Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ) 11
1.1 Систематика и краткая характеристика представителей 11
1.2 Морфологические, физиологические и генетические свойства
1.2.1 Морфология и ультратонкое строение 27
1.2.2 Использование энергии света 30
1.2.3 Ассимиляция неорганического углерода 33
1.2.4 Метаболизм серы и азота 36
Глава 2. Филогенетическое и функциональное разнообразие АНФБ в гидротермальных источниках 38
2.1 Филогенетическое разнообразие 38
2.2 Функциональное разнообразие
2.2.1 Превращение углерода 42
2.2.2 Превращение серы 46
Глава 3. Филогеография прокариот 49
Материалы и методы 54
Глава 4. Материалы исследования 54
Глава 5. Микробиологические методы исследования 55
5.1 Состав питательной среды и условия культивирования 55
5.2 Изучение морфологии клеток 57
5.3 Определение пигментов клеток 57
5.4 Получение чистой культуры 58
5.5 Изучение физиологии штамма isl-2 58
5.6 Изучение хемотаксономических свойств штамма isl-2 59
Глава 6. Молекулярно-генетические методы исследования 60
6.1 Выделение ДНК 60
6.2 Амплификация фрагментов исследуемых генов 62
6.3 Детектирование продуктов ПЦР 64
6.4 Очистка ПЦР-фрагментов 64
6.5 Секвенирование ДНК 6.6 Клонирование ПЦР-фрагмента 65
6.7 Выделение плазмидной ДНК 65
6.8 Секвенирование геномной ДНК 66
6.9 Анализ полученных последовательностей 66
6.10 Географические, физические данные и корреляционный анализ 67
Результаты и обсуждение 68
Глава 7. Разнообразие термофильных АНФБ в гидротермах Байкальской рифтовой зоны (БРЗ) 68
7.1 Гены pufLM - генетические маркеры для АНФБ 69
7.2 АНФБ в цианобактериальных матах гидротерм БРЗ 71
Глава 8. Roseiflexus-содержащие фототрофные сообщества 77
8.1 Roseiflexus-содержащий мат источника Алла 78
8.2 Roseiflexus-содержащий мат источника Ценхер 89
Глава 9. Филогеография бактерий рода Roseiflexus 94
Глава 10. Новые бактерии рода Chloroflexus 103
10.1 Chloroflexus аggregans из источника Термофильный (Камчатка) 104 10.2 Chloroflexus islandicus – новая аноксигенная нитчатая фототрофная
бактерия из гейзера Строккур (Исландия) 106
10.2.1 Морфологическая характеристика 107
10.2.2 Пигменты клеток 109
10.2.3 Физиологические свойства 110
10.2.4 Хемотаксономические признаки. 114
10.2.5 Генетические свойства 114
10.2.6 Таксономическое описание Chloroflexus islandicus sp. nov. 118
10.3 Новые бактерии Chloroflexus spp. в контексте глобального
филогенетического разнообразия АНФБ 119
Заключение 121
Выводы 123
Сокращения и аббревиатуры 124
Список литературы 125
- Морфологические, физиологические и генетические свойства
- Превращение углерода
- Определение пигментов клеток
- Очистка ПЦР-фрагментов
Введение к работе
Актуальность исследования. Представители аноксигенных нитчатых
фототрофных бактерий (АНФБ) являются важным компонентом фототрофного
микробного сообщества цианобактериальных матов в экстремальных местах обитания,
в частности, в гидротермальных источниках (Горленко, 1977; Ward et al., 1998; Hanada,
2003; Klatt et al., 2007; Kim et al., 2015). Считается, что подобные цианобактериалые
маты являются архаичным типом сообщества, доминировавшим на ранних этапах
развития биосферы Земли (Заварзин, 2004). Эта концепция согласуется с результатами
ряда теоретических эволюционных построений, согласно которым АНФБ
рассматриваются в качестве ключевой группы микроорганизмов для реконструкции
ранних этапов эволюции фототрофии (Cavalier-Smith, 2014). В связи с этим понимание
разнообразия и функциональной роли термофильных АНФБ важно для
конструирования эволюционного сценария как развития микробных сообществ, так и самих АНФБ, являющихся важным компонентом этих сообществ.
Первая бактерия этой группы была выделена в культуру и описана 45 лет назад, как вид Chloroflexus aurantiacus, являющийся типичным обитателем горячих источников национального парка Йеллоустон (Сев. Америка) и Японских островов (Pierson, Castenholz, 1971, 1974а). Тем не менее, группа АНФБ остается «бедной на виды». Большинство известных в литературе родов как термофильных, так и мезофильных АНФБ включает один или два законно описанных вида (Hanada, 2014).
Из анализа комплекса работ, посвященных термофильным АНФБ, следует, что серьезной научной проблемой является диспропорция в степени изученности различных гидротермальных областей, источники которых пригодны для развития АНФБ. Объектами большинства исследований, посвященных экологии и разнообразию АНФБ, служат источники Йеллоустона (Ward et al., 1998; Boomer et al., 2002; Meer et al. 2005, 2007, 2010; Klatt et al. 2007; Liu et al., 2011). В связи с этим назрела необходимость в расширении географии исследования АНФБ. Во-первых, эта необходимость обусловлена возможностью выделения и описания культур новых АНФБ из ранее не изученных источников и, во-вторых, изучение материала по гидротермальным источникам всего мира дает богатый материал для сравнительного анализа глобального филогенетического разнообразия термофильных АНФБ. Последнее особенно актуально, так как до сих пор не было проведено анализа глобального распространения АНФБ.
Цель данного исследования: Изучение разнообразия термофильных
аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий в гидротермальных экосистемах с применением комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов.
В задачи исследования входило:
-
Исследовать филогенетическое разнообразие АНФБ в цианобактериальных матах из термальной зоны гидротермальных источников Байкальской рифтовой зоны (БРЗ).
-
Описать состав и структуру фототрофного микробного сообщества Roseiflexus-содержащих матов из термальной зоны гидротермальных источников БРЗ.
-
Проанализировать закономерность распределения термофильных АНФБ в географически удаленных гидротермальных регионах.
-
Выделить термофильные АНФБ из природных мест обитания, изучить их морфологические и физиологические свойства.
-
Провести молекулярно-генетическую идентификацию выделенных АНФБ, а также изучить их генетические свойства и провести филогенетический анализ.
Научная новизна. Ранее видовое разнообразие аноксигенных фототрофных бактерий в источниках БРЗ исследовали только посредством бактериологических методов. В результате выполнения данной работы впервые изучено филогенетическое разнообразие термофильных АНФБ в гидротермальных источниках Байкальской рифтовой зоны с помощью комплексного подхода, включающего микробиологические и молекулярно-экологические методы. Впервые в гидротермах БРЗ было описано развитие бактерий рода Roseiflexus и образование Roseiflexus-содержащего мата. Также впервые было подробно описано фототрофное микробное сообщество гидротермальной системы источника Алла, и проведено его сравнение с сообществом Roseiflexus-содержащего цианобактериального мата источника Ценхер.
На основании сравнения полученных в ходе настоящего исследования и
доступных из международных баз данных последовательностей генов 16S рРНК была
впервые описана филогеографическая структура глобального разнообразия
термофильных бактерий рода Roseiflexus.
Составлено полное таксономическое описание нового вида термофильных хлоросом-содержащих АНФБ Chloroflexus islandicus.
Практическая значимость. В ходе выполнения данной работы были разработаны протоколы проведения ПЦР с серией новых праймерных систем разного уровня специфичности, которые могут быть использованы в дальнейших работах по микробной экологии АНФБ.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференциях «Актуальные аспекты микробиологии» (2012, Москва, Россия), «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (2014, Москва, Россия), 10th International Congress on Extremophiles (2014, Санкт-Петербург, Россия), 14th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes (2012, Porto, Portugal) и 15th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes (2015, Tbingen, Germany).
Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и 5 тезисов конференций:
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Текст работы изложен на 163 страницах, содержит 30 рисунков, 7 таблиц и 5 приложений. Список литературы содержит 220 наименований.
Морфологические, физиологические и генетические свойства
Как было отмечено выше, в группу бесхлоросомных АНФБ (подпорядок Roseiflexineae) включено два рода: Roseiflexus и Heliothrix. Род Heliothrix был предложен исторически первым на основании описания вида Htr. oregonensis (Pierson et al., 1985). Эта бактерия была выделена из горячих источников штата Орегон (США) как изолят F-1 в со-культуре с бактерией Isosphaera pallida (Pierson, Castenholz, 1971). Нитчатая бактерия получила родовое название — Heliothrix, что значит «солнечный волос», и видовое название — oregonensis, которое отражает место выделения бактерии — штат Орегон (Pierson et al., 1985). Характеристика H. oregonensis была сделана на основании изучения бактерии в природной среде и в со-культуре. Впоследствии культура была утеряна и на сегодня недоступна для изучения. До сих пор не было описано других представителей этого рода.
В щелочных горячих источниках H. оregonensis образует ярко-оранжевый поверхностный слой в цианобактериальном мате, который получает обильное развитие в наиболее солнечные летние месяцы (Pierson et al., 1985). Оптимальная температура роста 40-55С. Было установлено, что природная популяция H. оregonensis обладает фотогетеротрофным метаболизмом и осуществляет свето-зависимую утилизацию ацетата (Pierson et al., 1984). Пигментный состав клеток включает набор каротиноидов и бактериохлорофилл а в качестве единственного хлорофильного пигмента. Максимумы поглощения бактериохлорофилла а в препарате разрушенных клеток (in vivo) — 795 и 865 нм.
Род Roseiflexus был предложен на основании описания бактерии, которая тоже была выделена из цианобактериальных матов щелочных термальных источников. Первый представитель этого рода был выделен в чистую культуру из японского термального источника Nakabusa префектуры Nagano и описан как штамм HLO8 (DSM 13941) (Hanada et al., 2002а). На основании описания этого штамма был предложен род Roseiflexus, название которого значит — имеющий розовую окраску и изгибающийся, и предложен вид Rfl. castenholzii. Видовое название предложено в честь американского микробиолога R.W. Castenholz, который внес большой вклад в изучение фотосинтезирующих прокариот и первым вместе с B.K. Pierson описал АНФБ.
Еще два изолята Roseiflexus sp. RS-1 и Roseiflexus sp. RS-2 были выделены из источника Octopus в природном парке Yellowstone в США (van der Meer et al., 2010). Эти изоляты не получили валидированые видовые имена, несмотря на то, что отличаются по нуклеотидному составу генов, кодирующих 16S рРНК, более чем на три процента и в цитируемой статье van der Meer с соавторами было приведено их подробное морфофизиологическое описание. Также они не представлены в международных коллекциях микроорганизмов.
Бактерии рода Roseiflexus осуществляют фотогететрофный рост на свету и способны к дыханию в темноте при аэробных условиях и наличии органики (van der Meer et al., 2010). Автотрофный рост отсутствует. Нитрогеназная активность отсутствует (van der Meer et al., 2010). Оптимальная температура роста для Rfl. castenholzii — 50С, для Roseiflexus sp. RS1 — 55-60С. Максимумы поглощения бактериохлорофилла а в препарате разрушенных клеток (in vivo) — 801, 878 нм для Rfl. castenholzii и 795, 900 нм — для Roseiflexus sp. RS1.
Бесхлоросомные АНФБ описаны исключительно как термофильные бактерии, обитающие в гидротермальных источниках. Это согласуется с представлением о том, что это более древняя реликтовая группа АНФБ, не занявшая мезотермальные экологические ниши, которые считаются геологически более молодыми в сравнении с термальными экосистемами. Принято считать, что эволюция микроорганизмов канализируется эволюцией экологической ниши (Gorlenko, 1988). Хлоросом-содержащие АНФБ, объединенные в подпорядок Chloroflexineae, представлены как термофилами (семейство Chloroflexaceae), так и мезофилами (семейство Oscillochloridaceae). В первое семейство включен один род Chloroflexus, который был предложен на основании описания вида C. aurantiacus, типовой штамм которого — J-10-fl (DSM 635), был выделен из термального источника Hakone (Япония) (Pierson, Castenholz, 1974а). Родовое название «Chloroflexus» означает — зеленный и гибкий. Видовое название «aurantiacus» означает — оранжевый. Видовое название отражает то, что бактерия приобретает окраску биомассы от желто-оранжевой до красно-бурой при увеличении концентрации кислорода, уменьшении температуры окружающей среды или сильного увеличения интенсивности света. Эти факторы ингибируют синтез бактериохлорофилла с клетками, что приводит к проявлению каротиноидной окраски (Pierson, Castenholz, 1974б). Это — обратимая адаптивная реакция, основанная на снижении концентрации бактериохлорофилла с в хлоросомах, но не приводящая к их исчезновению. В клетках всегда образуются реструктуризованные хлоросомы ("chlorosome bags"), которые быстро превращаются в полноценные хлоросомы при смене условий (Schmidt et al., 1980). Адаптивная реструктуризация хлоросом была показана только для бактерий рода Chloroflexus.
Основные данные о хлоросомах в клетках АНФБ были получены при изучении C. aurantiacus. Тем ни менее Хлоросомы есть у всех представителей семейства Chloroflexaceae Oscillochloridaceae, в том числе у «Candidatus Chlorothrix halophila» (Klappenbach, Pierson, 2004) и «Candidatus Chloroploca asiatica» (Gorlenko et al., 2014).
В хлоросомах бактерия C. aurantiacus сосредоточен бактериохлорофилл с клеток, который в пигментных спектрах in vivo дает максимум поглощения около 740 нм. Также в клетках присутствует бактериохлорофилл а (максимум поглощения in vivo около 802 и 865 нм), но в значительно меньшем количестве. Бактериохлорофилл а у бактерии C. aurantiacus, как в общем и у остальных АНФБ, входит в состав хлоросом, B806-866 комплекса и реакционных центров. Каротиноиды в клетках C. aurantiacus представлены -каротином и -каротином с соответствующими производными в соотношении 1:2 (Halfen et al., 1972).
Превращение углерода
Бактерия Roseiflexus castenholzii была выделена из японского щелочного источника, бактерия Roseiflexus sp. RS-1 из йеллоустонского щелочного источника (Hanada et al., 2002а; van der Meer et al., 2010). На этом «разнообразие в культурах» заканчивается. Гораздо больше известно о филогенетическом разнообразии бактерий рода Roseiflexus — о разнообразии Roseiflexus-подобных филотипов известно благодаря молекулярно генетическим исследованиям на основе анализа последовательностей гена 16S рРНК. Причем, во многих исследованиях бактерии Roseiflexus spp. не являлись целевой группой, а просто были отмечены в качестве одного из элементов сообщества. Так, Roseiflexus-подобные филотипы были обнаружены в гидротермах Йеллоустона (Boomer et al., 2002; Boomer et al., 2009; Nbel et al., 2002; Spear et al., 2005) и Японии (Everroad et al., 2012) Камчатки (Акимов и др., 2013; Burgess et al., 2012), Таиланда (Portillo et al., 2009), Центрального Тибета (Lau et al., 2009; Lau, Pointing, 2009), Чили (Engel et al., 2013), Аргентины (Urbieta et al., 2015), Болгарии (Tomova et al., 2010). Кроме того, Roseiflexus-подобные филотипы выявляют в горячих источниках с помощью высокопроизводительного секвенирования (Klatt et al., 2013, Len et al., 2013). Таким образом, можно говорить о глобальном распространении Roseiflexus spp., множество филотипов которых распространены в различных гидротермах мира.
Все описанные на сегодня термофильные хлоросом-содержащие АНФБ объединены в род Chloroflexus (Hanada, 2014). Разнообразие этих бактерий наиболее изучено, т. к. это был первый организм среди АНФБ, привлекший внимание исследователей. Еще до распространения молекулярно-генетических методов Pierson и Castenholz исследовали разнообразие Chloroflexus spp., выделив штаммы из множества источников Северной и Центральной Америки, Японии, Исландии и Новой Зеландии (Pierson, Castenholz, 1974). Из-за схожести морфологических и физиологических свойств они были описаны как штаммы бактерии Chloroflexus aurantiacus. Однако после получения нуклеотидных последовательностей стало ясно, что некоторые штаммы имеют значительные генетические отличия (см. Рисунок 1). Тем ни менее, штаммы так и не были описаны как отдельные виды.
Кроме вида C. aurantiacu,s был описан вид C. aggregans, работу со штаммами которого вели японские исследователи. Типовой штамм бактерии C. aggregans – MD-66 был выделен из японского источника «Okukinu Meotobuchi» префектуры «Tochigi». Еще один штамм YI-9 был выделен из источника «Yufuin» префектуры «Oh-ita» (Hanada et al., 1995б).
Интересно, что C. aggregans не имеет широкого распространения даже в термальных источниках японских островов. Так, Hanada с соавторами исследовали 41 термальный источник, в результате чего были выделены только два выше описанных штамма этой бактерии (Hanada et al., 1995а). В противоположность этому, множество штаммов бактерии C. aurantiacus выделено из гидротерм Северной Америки, Исландии и Новой Зеландии (Hanada et al., 1995а; Pierson, Castenholz, 1974а). Эта бактерия была обнаружена в гидротермах всего мира посредством молекулярно-генетических методов исследования микробных сообществ. Судя по всему, этот вид проявляет самый широкий космополитизм среди термофильных представителей АНФБ.
Хотя было описано только два вида, на сегодня доступны полногеномные последовательности для пяти штаммов: Chloroflexus sp. Y-396-1, Chloroflexus sp. Y-400-fl, Chloroflexus sp. MS-G, C. aurantiacus DSM 635 и C. aggregans DSM 9485. Кроме штаммов, выделенных Pierson и Castenholz, большое количество термофильных штаммов бактерий Chloroflexus spp. было выделено сотрудниками Института микробиологии РАН им. С.Н. Виноградского из термальных источников Камчатки (штамм UZ) и Бурятии (штамм В-3) (Красильникова и др., 1986).
Уже было отмечено, что практически во всех гидротермальных экосистемах можно встретить АНФБ и, порой, их развитие достигает значительной величины. Этот факт указывает на существование определенной экологической значимости этой группы бактерий в термофильном микробном сообществе. Было показано, что в цианобактериальном мате горячего источника почти половина белкового пула синтезируется этими бактериями (Schaffert et al., 2012). Функциональное разнообразие различных представителей АНФБ определяется их ролью в круговороте углерода и серы. Также отдельно можно выделить структурообразующую функцию АНФБ для микробного сообщества матов. Из-за нитчатого строения и способности образовывать чехлы АНФБ формируют микробный «войлок», обеспечивающий прикрепление к твердому субстрату и основу для развития одноклеточных бактерий.
Как фототрофные бактерии, АНФБ прежде всего рассматривались в роли как возможных первичных продуцентов. Действительно, после описания способности бактерии C. aurantiacus к фотоавтотрофному росту стало очевидно, что эта бактерия может выполнять функцию продуцента в анаэробных условиях (Madigan, Brock, 1975). Позже было описано, что в сульфидном источнике «Mammoth» при отсутствии цианобактерий природная популяция бактерий Chloroflexus spp. осуществляет сульфид-зависимый аноксигенный фотосинтез в составе мата (Giovannoni et al., 1987). В подтверждение к этому выводу, на основе результатов анализа изотопного состава было установлено, что в высокосульфидном исландском источнике бактерии Chloroflexus spp. осуществляют преимущественно автотрофный рост (van der Meer et al., 2008) Таким образом, в высокосульфидных горячих источниках, в которых описаны маты с доминированием Chloroflexus spp. (Skirnisdottir et al., 2000; Kato et al., 2004), эти бактерии могут выполнять функцию основных первичных продуцентов сообщества.
В естественных условиях бактерии Heliothrix oregonensis и Roseiflexus spp. всегда развиваются вместе с цианобактериями в составе мата (Pierson et al., 1985; Boomer et al., 2002; Hanada, 2003). Выделенные штаммы этих бактерии не были способны к фиксации углерода в лабораторных условиях (Hanada et al., 2002а; van der Meer et al., 2010). Однако в результате исследования протеома цианобактериального мата из горячего источника «Octopus» было установлено, что природная популяция бактерий Roseiflexus spp. синтезирует ряд ферментов 3-гидроксипропионатного цикла (Schaffert et al., 2012). Анализ посуточного изменения уровней экспрессии генов метаболизма углерода у АНФБ в мате горячего источника «Mushroom» подтвердил результаты протеомного анализа. Было установлено, что у бактерий Roseiflexus spp. происходит экспрессия генов 3-гидроксипропионатного цикла, причем пик активности приходится на утреннее время (Klatt et al., 2013). Эти результаты подтвердили результаты, полученные на основе экспериментов с меченым углеродом, указывающие на наибольшую активность аноксигенного фотосинтеза в утреннее сумеречное время (van der Meer et al., 2005).
Определение пигментов клеток
В микробиологии проблема распространения и расселения микроорганизмов в биосфере Земли долгие годы рассматривалась лишь в свете экологического подхода, который резюмировала гипотеза Баас-Бекинга: Everything is everywhere, but, the environment selects (De Wit, Bouvier, 2006), то есть, микроорганизмы потенциально способны обитать везде, и только конкретные экологические условия определяют, какие организмы обитают в той или иной экосистеме. Это было обусловлено общераспространенными представлениями о большом потенциале микроорганизмов к расселению и огромном размере популяций (Finlay, Clarke, 1999). Таким образом, любые микроорганизмы рассматривались как вездесущие агенты, которые можно найти в любой благоприятной экологической нише вне зависимости от ее расположения на Земле.
Однако последние двадцать лет стало появляться все больше данных указывающих, что распределение микроорганизмов в ландшафте носит не случайный характер и обусловлено не только экологическими, но и географическими/историческими факторами (Martiny et al., 2006; Lindstrom, Langenheder, 2012). Новые данные заставили иначе взглянуть на проблему микробного расселения, и этот новый взгляд хорошо обобщил van der Gast, перефразировав гипотезу Баас-Бекинга: «some things are everywhere and some things are not. Sometimes the environment selects and sometimes it doesn t» (van der Gast, 2015). То есть, вездесущность микроорганизмов не является непреложным законом, и не всегда наблюдаемая структура микробного сообщества или структура генетического разнообразия вида определена лишь условиями среды. Рост интереса к проблеме микробного расселения и накопившиеся новые данные привели к формированию нового направления в микробиологии — микробной биогеографии, для которого в последнее время идет быстрое концептуальное оформление (Hanson et al., 2012). Микробная биогеография, как и биогеография животных и растений, рассматривается как концептуальная база при изучении механизмов, лежащих в основе эволюции организмов, в частности, при образовании новых таксонов (Martiny et al., 2006; Hanson et al., 2012).
Влияние географической разобщенности популяций непатогенных микроорганизмов на их генетическую структуру было показано при изучении экстремофильных прокариот. Так, одна из первых работ, убедительно показывающая влияние географической разобщенности на генетическую структуру группы бактерий, была посвящена исследованию эндемичных популяций гипертермофильных архей рода Sulfolobus (Whitaker et al., 2003). Другая пионерская работа была посвящена филогеографии термофильных цианобактерий (Papke et al., 2003). В отличие от работы Papke с соавторами, в первой работе кроме филогенетического анализа была проведена статистическая обработка. Последнее позволило достоверно выявить корреляцию между генетической дивергенцией популяций и их географической дистанцией, и в тоже время отсутствие корреляции между генетической дивергенцией и условиями среды (Whitaker et al., 2003).
Облигатно термофильные прокариоты являются стенобионтными организмами, способными расти в весьма специфических условиях термальных экосистем, которые на поверхности современной земли не являются основными местами обитания, а скорее имеют спорадическое распределение. Экосистемы горячих источников являются своего рода островами в современной не термальной биосфере. Очевидно, это обусловливает механизм «островного эффекта», влияющего на генетическую структуру видов термофильных прокариот, «запертых» в гидротермах. Известно, что чем уже экологические возможности микроорганизмов, тем больше проявление эндемизма (Barbern et al., 2014). Поэтому некоторые авторы рассматривают островной эффект как значимый механизм для бактериального видообразования (Hreggvidsson et al., 2012) у термофильных микроорганизмов. В поддержку такого взгляда существует целый ряд работ. Так, локальные популяции были выявлены для гипертермофильных архей рода Pyrococcus (Escobar-Paramo et al., 2005), а также при исследовании филогеографии гена аммония-монооксидазы amoA у термофильных архей (Zhang 2008). Проявление эндемизма было обнаружено для популяций термофильных цианобактерий рода Mastigocladus (Miller et al., 2007). В тоже время, при исследовании мезофильных цианобактерий островной эффект не обнаруживается (van Gremberghe et al., 2011). В этой работе было проанализированно 311 последовательностей внтуренних траскребируемых участков рибосомальных опиронов пресноводной цианобактерии Microcystis aeruginosa, штаммы которой были полученны в Европе, Азии, Африки, Океании Южной и Северной Америки. Не исключено, что полученный результат обусловлен разрешающей способностью выбранного генетического маркера.
Стоит ожидать, что островной эффект действует и в отношении других групп экстремофильных прокариот. Так, проявление эндемизма было отмечено при исследовании галотолерантных изолятов бактерий рода Thioalkalivibrio (Foti et al., 2006) и рода Nocardiopsis (He et al., 2015).
Островной эффект в вышеописанных случаях является результатом естественно сформировашихся условий, однако в наше время на филогенетическую труктуру свободноживущих микроорганизмов может влиять антропогенный фактор. Человек может служить вектором обуславливающим миграцию из одного естественно изолированной популяции в другую. Это важно учитывать при итропретации результатов филогеографического анализа. Так в разарботанной Cohan филогеографической модели бактериального видообразование этот фактор был назван «эффект Боинга» (Cohan, Perry, 2007). Само это название отражает, что глобально занчение этот фактор получил лишь во вторую половину двадцатого века с развитием и масовым применением быстрых способов транспортировки на дальние растоняия.
Очистка ПЦР-фрагментов
Для источников БРЗ развитие Roseiflexus-содержащего цианобактериальныго мата отмечено впервые, поэтому в данной работе мы сосредоточили наше внимание на исследовании этого типа фототрофного микробного сообщества. Roseiflexus-содержащий мат привлек исследователей, как отдельный тип мата, еще в конце девяностых годов двадцатого века, и даже стал объектом для систематического сравнительного исследования в рамках проекта «Red Layer Microbial Observatory» (RLMO), заявленного в 2000 году (Boomer et al., 2003). Однако, через пять лет проект не получил дальнейшего развития. Кроме того, сбор данных для этого проекта был ограничен гидротермами Йеллоустона (США). В связи с последним обстоятельством, данные, полученные при исследовании источников БРЗ, в совокупности с результатами исследований матов из Йеллоустона и других регионов планеты, представляют интерес как материал для дальнейшего сравнительного анализа.
ДНК Roseiflexus-содержащих матов были нами выделены в 2011 и в 2012 году. Для определения филогенетического состава микробного сообщества были сделаны клональные библиотеки ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК, полученные с использованием универсальной праймерной системы Univ27f и Univ1492r (Lane, 1991). Далее вставки клонов были секвенированы с помощью праймеров Univ27f, Univ530f и Univ1492r. После обработки и проверки на наличие аномалий, последовательности были отобраны для дальнейшего анализа. Для источника Алла было отобрано 111 последовательностей, для источника Ценхер – 60. В среднем длина последовательностей составляла около 1400 нуклеотидов. В сравнительном анализе участвовали только последовательности, отнесенные к филотипам фототрофных бактерий. Данные о филогенетическом анализе легли в основу сравнения состава Roseiflexus-содержащих матов.
В связи с тем, что гидротермальный источник Алла был наиболее доступен, он послужил площадкой для детального исследования данного типа сообщества. Полученные результаты могут служить для описания типового сообщества микроорганизмов мата Roseiflexus, характерного для источников БРЗ.
Термальный источник Алла представляет собой гидротермальную систему, расположенную в пределах Баргузинской долины на отрогах Байкальского хребта, возле одноименной реки. В данной работе было исследовано термальное поле, расположенное на орографически правом берегу реки Алла. Горячая вода выходила как из грифонов, так и просачивалась через песок, выстилающий площадку термального поля. При этом формировался градиент физико-химических параметров водной среды непосредственно от дна, на котором находятся микробные маты. По краю термального поля проходила протока реки Алла, частично заливая поверхность термального поля. Речная вода при этом охлаждает поверхность сформированных матов, создавая резкий контраст физико-химических условий, влияющих на развитие цианобактериальных матов.
Впервые Roseiflexus-содержащий мат в гидротермальном источнике Алла был найден нами в 2011 году. Согласно исследованиям других авторов, в этом источнике ранее наблюдали только типичные цианобактериальные маты, содержащие Chloroflexus sp. в качестве единственного представителя АНФБ (Намсараев и др., 2006; Лазарева и др. 2010). Возможно, появление данного типа мата связанно с изменением физико-химических условий в термальном поле, вызванное уменьшением заливания поля речной водой. Так, по сообщению Горленко В.М. до проведения этого исследования, в 2010 году в термальном поле под потоком речной воды (из протоки) был обнаружен только «Chloroflexus-содержащий» оливкового цвета, который развивался в непосредственной близости от мест выхода горячей воды из грифонов. При этом большая часть песчаной площадки была свободна от фототрофного мата. Но уже в 2010 году общий уровень воды в реке упал, по сравнению с наблюдениями более ранних экспедиций, что привело к тому, что протока реки стала мелеть, обнажая термальное поле. Дальнейшее падение уровня речной воды в протоке привело к обильному развитию фототрофного мата. В 2011 году увеличилась площадь, занятая зеленым матом, и появился Roseiflexus-содержащий мат, который стал объектом нашего исследования. В 2012 году площадь, занятая Roseiflexus-содержащим хлорофототрофным матом, стала еще больше. В некоторых местах мат достиг значительной толщины (до 2 см).
Для выявления основных групп фототрофных бактерий мы провели послойное определение пигментного состава мата. В структуре мата, обнаруженного в 2011 году, выделялись два основных слоя: тонкий верхний слой зеленого цвета и нижний толстый слой красно-оранжевого цвета. Основным пигментом верхнего слоя был цианобактериальный хлорофилл а с максимумом поглощения in vivo 681 нм. В нижнем слое появляются пики поглощения бактериохлорофилла а с максимумами in vivo при 805, 884 нм. (Рисунок 10).