Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 Организация генома возбудителя чумы и разнообразие штаммов Yersinia pestis 14
1.2 Молекулярное типирование штаммов Y. pestis. Полимеразная цепная реакция с учетом результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и ее использование для молекулярно-генетического анализа возбудителя чумы 23
Собственные исследования 31
Глава 2 Обьекты, материалы и методы 31
2.1 Объекты исследования 31
2.1.1 Штаммы Y. pestis 31
2.1.2 Питательные среды 42
2.2 Анализ биохимических свойств штаммов 42
2.3 Выделение ДНК 43
2.4 Постановка полимеразной цепной реакции 44
2.5 Проведение ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 44
2.6 Секвенирование ДНК 44
2.7 Использованные компьютерные программы 45
2.8 Статистическая обработка результатов 45
Глава 3 Разработка способа определения биоварной принадлежности штаммов Y. pestis методом пцр с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 46
3.1 Выбор ДНК мишеней для определения биоваров штаммов Y. pestis основного подвида методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 46
3. 2 Разделение в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов типичных и атипичных штаммов средневекового биовара. Определение полной нуклеотидной последовательности криптической плазмиды pCKF 51
Глава 4 Разработка способа определения принадлежности штаммов y.pestis к основным филогенетическим линиям в пцр с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 61
4.1 Дифференциация в ПЦР штаммов античного биовара филогенетических линий O.ANT, 1.ANT и 2.ANT 61
4.2 Детекция в ПЦР штаммов Y. pestis античного биовара линии 4.ANT. Определение полной нуклеотидной последовательности криптической плазмиды рТРЗЗ 64
4.3 Разработка способа детекции штаммов Y. pestis античного биовара филогенетической линии 3.ANT 73
Глава 5 Определение филогенетической принадлежности штаммов возбудителя чумы из природных очагов россии и некоторых сопредельных стран 76
5.1 Филогенетическая принадлежность штаммов Y. pestis основного подвида из природных очагов чумы в России 76
5.2 Филогенетический анализ штаммов Y. pestis основного подвида, выделенных в Горно-Алтайском высокогорном очаге в 2012 и 2014 гг . 80
5.3 Анализ штаммов основного подвида из очагов чумы в Монголии 81
5.4 Филогенетическая принадлежность штаммов Y. pestis основного подвида из высокогорных очагов в Киргизии 85
Заключение 90
Выводы 106
Перечень сокращений и условных обозначений 107
Список литературы
- Молекулярное типирование штаммов Y. pestis. Полимеразная цепная реакция с учетом результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и ее использование для молекулярно-генетического анализа возбудителя чумы
- Анализ биохимических свойств штаммов
- Разделение в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов типичных и атипичных штаммов средневекового биовара. Определение полной нуклеотидной последовательности криптической плазмиды pCKF
- Филогенетический анализ штаммов Y. pestis основного подвида, выделенных в Горно-Алтайском высокогорном очаге в 2012 и 2014 гг
Молекулярное типирование штаммов Y. pestis. Полимеразная цепная реакция с учетом результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и ее использование для молекулярно-генетического анализа возбудителя чумы
Y. pestis является этиологическим агентом особо опасной инфекционной болезни - чумы, которая может протекать в виде бубонной септической и легочной форм. Ежегодно в мире регистрируется около 2000 случаев чумы, при этом летальность наиболее опасной легочной формы чумы в случае отсутствия ее лечения, достигает 90% (WHO. Plague, 2010; 2014).
Возбудитель чумы Y. pestis произошел от предшественника возбудителя псевдотуберкулеза Yersinia pseudotuberculosis относительно недавно - от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч лет назад (Куклева и др., 2002; Кутырев и др., 2009; Achtman et al., 1998; Parkhill et al, 2001 Brubaker, 2003; Achtman et al., 2004; Chain et al, 2004). На основе сравнения полногеномных последовательностей штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis показано совпадение у них нуклеотидных последовательностей генов-гомологов на 97-99%, а гена 16S рРНК - на 100% (Chain, 2004, Garcia, 2008). Тем не менее, эти возбудители вызывают разные заболевания. Y. pestis вызывает особо опасную системную болезнь преимущественно с трансмиссивным путем передачи через укус насекомого - переносчика блохи. В отличие от него Y. pseudotuberculosis, как и другой эволюционно удаленный вид Yersinia enterocolitica, вызывает гастроэнтериты различной степени тяжести с фекально-оральным путем передачи инфекции (Wren, 2003, Brubaker, 2004).
С внедрением в практику микробиологических исследований метода полногеномного секвенирования существенный прогресс достигнут в области изучения организации и эволюции геномов возбудителей опасных инфекций. В настоящее время в базе данных NCBI GenBank доступны для анализа завершенные полные геномы 24 штаммов возбудителя чумы и еще более 200 полногеномных последовательностей, не собранных в кольцевые геномы, и эти данные постоянно обновляются. На их основе установлено, что геном Y. pestis состоит из кольцевой хромосомной ДНК (состав Г+Ц пар равен 47,6%) размером около 4,65 м.п.н., включающей около 4200 генов, и трех плазмид: pCad (pYV, pCDl) 15 плазмида кальцийзависимости, pFra (pMTl) - фракционная плазмида и pPst (pPCPl) - плазмида пестициногенности (Попов и др., 1980; Проценко и др., 1983; Кутырев и др., 1986; 1992; Попов, 1991; 1992; Hinnebusch et al, 1998; 2002; Perry, 2003). Плазмида кальцийзависимости pCad является родоспецифич-ной и присутствует в геноме у всех трех видов патогенных иерсиний - Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Однако установлено, что возбудителем кишечного иерситниоза Y. enterocolitica плазмида pCad была приобретена независимо от Y. pseudotuberculosis и его потомка - Y. pestis. Данные полногеномного секвенирования свидетельствуют о том, что у патогенных иерсиний не было недавнего общего предка, и что они эволюционировали независимо друг от друга параллельными путями, приобретая одни и те же детерминанты патоген-ности. Это касается, прежде всего, плазмиды pCad и локуса адгезии-инвазии ail (Reuter et al., 2014). Размер плазмиды кальцийзависимости у возбудителя чумы составляет около 70,3 т.п.н., состав Г+Ц пар равен 44,8%. Она содержит 97 кодирующих последовательностей. Наличие этой плазмиды является обязательным условием вирулентности штаммов Y. pestis. В случае потери pCad штаммы Y. pestis теряют свою вирулентность.
Две плазмиды - pFra и pPst являются видоспецифическими. Плазмида pFra имеет размер около 92,2 т.п.н. и содержит 103 кодирующие последовательности. Ее Г+Ц состав равен 50,2%. Размер плазмиды pPst составляет около 9,6 т.п.н., а содержание Г+Ц равно 45,3%. Она включает 9 кодирующих последовательностей. Ген caf плазмиды pFra и ген pla плазмиды pPst часто используют для видоспецифической детекции возбудителя в качестве ДНК мишеней в ПНР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (Куклев, 2007). В РосНЖТЧИ «Микроб» производится ряд ГЩР тест систем для детекции возбудителя чумы с использованием последовательностей генов плазмид pFra и pPst.
Помимо трех резидентных плазмид в геномах различных штаммов Y. pestis встречаются другие плазмиды, часть из которых является рекомбинантами этих резидентных внехромосомных репликонов, а часть новыми плазмидами, присутствующими у штаммов Y. pestis из отдельных географических районов. Димер плазмиды pPst размером около 19,5 т.п.н. выявлен у штаммов Y. pestis на западе США (Chu et al., 1998). Обнаружены другие рекомбинационные, муль-тимерические и делеционные производные трех классических плазмид возбудителя чумы (Филиппов и др., 1992; Балахонов, 2000; Filippov et al, 1990). У некоторых штаммов Y. pestis, выделенных на о. Мадагаскар, обнаружены плазмиды р1Р1202 и р1Р1203 с генами множественной лекарственной устойчивости к антибиотикам (Galimand et al., 1997; Guiyoule et al, 2001).
Криптическая плазмида pYC размером 6 т.п.н. обнаружена в геноме штаммов, выделенных в Китае (Dong et al., 2000). Плазмида pYC содержит 12 кодирующих последовательностей, включая ген белка инициации репликации и гены, участвуют в поддержании стабильности ДНК.
Криптическая плазмида размером около 33 т.п.н. включена в геном штаммов Y. pestis из Тувинского горного очага чумы в России (Балахонов и др., 2013). Еще одна криптическая плазмида pCRY размером около 22 т.п.н. присутствует в геноме штамма Y. pestis 91001, относящегося к штаммам microtias из очагов Китая (Song et al., 2004). Состав Г+Ц пар у нее равен 49,1% и немного отличается от нуклеотидного состава трех резидентных плазмид возбудителя чумы. В состав pCRY входят 30 кодирующих последовательностей, в том числе ген герА белка репликации, ген рог А (разделение реплицированных плазмид), а также кластер генов vir системы секреции IV типа. СС4Т является важным фактором вирулентности, необходимым для секреции эффекторных белков в клетки макроорганизма. Установлено, что на территории Китая плазмида pCRY имеет ограниченное распространение, поскольку из 257 выделенных здесь штаммов она присутствует только у 11 (Song et al., 2004).
Анализ биохимических свойств штаммов
При идентификации различных патогенов в мультиплексной ПЦР-РВ при недостаточном количестве исследуемого материала можно выявлять несколько разных патогенов в одной реакции. Это было показано при расследовании распространения чумы в средневековой Венеции. Из 173 образцов пульпы зубов, полученных из 46 захоронений, было определено наличие возбудителя чумы в трех образцах с временным интервалом захоронений от 14 до 16 века. По части секве-нированного гена glpD было установлено, что эти люди погибли от штаммов восточного биовара (Tran et al, 2011).
Хорошие результаты показало использование ПЦР-РВ для детекции специфических бактериофагов чумы (рЫА1122 и L-413C) (Sergueev et al, 2010). В качестве ДНК мишеней при определении плазмидного профиля штаммов в ПЦР-РВ применяют мультиплексную ПНР с гирбидизационно-фуоресцентным учетов результатов. В качестве ДНК мишеней используют гены IcrV (pCDl), ш/"(рМТ1) и pla (pPCPl). Их эффективность подтверждена на 192 штаммах Y. pestis (Stewart etal.,2008).
Метод ПЦР-РВ, с помощью которого можно быстро и точно определять наличие патогенов в исследуемом материале, находит широкое применение в таких сферах лабораторных исследований как контроль качества продуктов питания, мониторинг эпидемиологической обстановки, лабораторная диагностика заболеваний человека и животных и других сферах жизни общества (Gabitzsch et al., 2008). В частности, К. Атоако с соавторами (2010) показали возможность использования мультилокусной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов для детекции Y. pestis в молоке и продуктах питания. Они установили, что чувствительность данного метода для определения возбудителя чумы в молоке составила от 101 до 103 КОЕ/мл, а в говяжьем фарше от 102 до 105 КОЕ/г. В качестве ДНК-мишени использовались участки хромосомных генов (Amoako et al., 2010). Также ПЦР-РВ используется для контроля пищевых продуктов и обнаружения в них бактерий родов Escherichia, Salmonella, Shigella, Vibrio, Yersinia и Francisella на основе ДНК мишеней, в качестве которых послужили участки известных генов или генов с предполагаемой функцией (Woubit et al., 2012).
Другой важнейшей областью применения метода ПЦР-РВ являются работы по мониторингу особо опасных болезней человека. Для детекции возбудителя чумы в основных переносчиках - блохах разработана коммерческая тест-система на основе ПЦР-РВ, эффективность которой проверена в 14 независимых лабораториях в США (Tomaso et al., 2008).
Таким образом, использование модификации полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме ренально-го времени зарекомендовало себя как надежный и простой рутинный метод детекции возбудителя чумы в исследуемом материале. В тоже время, отсутствуют разработки по использованию этого метода для проведения внутривидовой дифференциации и определения филогенетической принадлежности штаммов Y. pestis. Решение этой задачи может значительно ускорить анализ по выявлению происхождения вспышечного штамма чумы при проведении эпидемиологического расследования. Это знание необходимо для определения возможного пути заноса инфекции или установления ее местного происхождения. Эта информация необходима для проведения противоэпидемических мероприятий и локализации вспышки чумы.
В таблице 2 представлены использованные в диссертации штаммы возбудителя чумы. Всего в работе использовано 162 штамма Y. pestis. Таблица 2 - Штаммы Y. Pestis
Для анализа отличительных биохимических свойств штаммов Y. pestis определяли их ферментативную активность по отношению к различным сахаридам и спиртам, способность к денитрификации (Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней», 2013 г.).
Этот признак используется для разделения биоваров Y. pestis. Штаммы античного и восточного биоваров обладают нитрифицирующей и денитрифицирующей активностью, а у штаммов средневекового биовара она отсутствует. Одну петлю 24- или 48- часовой культуры штамма засевали в 1 мл бульона LB или Хоттингера (рН7,2) с добавлением 0,1% KN03 (азотнокислый калий), инкубировали в течение 72 часов при 28С и затем добавляли 0,5 мл реактива Грисса. В положительных реакциях (наличие денитрифицирующей способности) среда окрашивалась в малиновый цвет за счет образования нитритов.
Ферментация глицерина
Этот признак используется для отделения штаммов Y. pestis восточного биовара, не способных ферментировать глицерин. Штаммы античного и средневекового биовара обладают этой способностью. Способность к ферментации глицерина определяли в жидкой среде Гисса, включавшей 1 % пептонную воду (рН 7,2), 1 % глицерин и 1 % индикатор Андреде (Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней», 2013 г.). Среду Гисса с глицерином засевали бактериями и в течение 24-72 часов культивировали при 28С. Покраснение среды указывало на способность исследуемого штамма ферментировать глицерин.
Ферментация рамнозы, мелибиозы
Эти признаки используются для разделения штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов. Штаммы неосновного подвида не ферментируют эти диса-хариды. Метод выполнялся аналогично методики, представленной в предыдущем разделе (ферментация глицерина), но вместо глицерина добавляли в среду Гисса либо 1% рамнозу, либо мелибиозу.
Выделение ДНК штаммов бактерий проводили с учетом требований МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение бактериальной ДНК осуществляли с применением наборов для выделения ДНК AxyPrep Bacterial Genomic Miniprep Kit по инструкции производителя (производство AXYGEN Biosciences). Полученные препараты ДНК применяли для проведения ПЦР и секвенирования. 2.4 Постановка полимеразной цепной реакции
Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25 мкл. Смесь состояла из 10х ПНР буфера (2,5 мкл), раствора по 2 мМ каждого из четырех дНТФ (2,5 мкл), 25 мМ MgCl2 (2 мкл), 10 пМ каждого праймера (0,1-0,2 мкл), 5 ед. Taq по-лимеразы (0,2 мкл) и деионизованной Н20 до общего объема 15 мкл. Затем добавляли бактериальную. ДНК в объеме 10 мкл.
Для проведения ПЦР использовали амплификатор БИС Н (Кольцове, Россия). Полученные в ПЦР продукты выявляли методом электрофореза в агарозном геле (1-2%) (Остерман, 1981; Маниатис и др., 1984).
Состав реакционной смеси для проведения ПНР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов был тот же, что и для ПЦР в традиционном формате, за исключением того, что в смесь добавляли 5 пМ зонда (0,1-0,2 мкл). Применяли зонд в формате TaqMan. В качестве флуоресцентных красителей использовали FAM и ROX, а гасителя флуоресценции - BHQ1 и BHQ2. Амплификацию ДНК осуществляли в амплификаторе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия).
Учет флуоресценции проводили на этапе отжига праймеров, уровень порога равнялся 0,05. Наличие положительного сигнала пробы учитывалось значением Ct графика кривой флуоресценции менее 31, что отображалось в виде статуса реакции («реакция» и «нет реакции»).
Разделение в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов типичных и атипичных штаммов средневекового биовара. Определение полной нуклеотидной последовательности криптической плазмиды pCKF
Параллельно со штаммами античного биовара филогенетической линии 4.ANT были выявлены штаммы этого биовара филогенетической линии 3.ANT (Cui et al., 2013). Они отделились от древней линии 0.ANT одновременно со штаммами линий l.ANT, 2.ANT и 4.ANT, но также как и штаммы 4.ANT не получили эволюционного продолжения и циркулируют только в некоторых районах Монголии и Китая. Выделено небольшое количество штаммов этой линии, полногеномный сиквенс некоторых из них - Y. pestis MGJZ7, MGJZ6 и MGJZ3 представлен в базе данных NCBI GenBank. Проведенный нами анализ последователь 74
ностей этих штаммов показал, что у них, как у штаммов линии 0.ANT отсутствуют филаментозный фаг cusq) и делеция в 70 п.н. в гене у 1694. В ПЦР с праймера-ми и зондами на мишени «Cus» и «70» у них, как и у 0.ANT отсутствует флуоресцентный сигнал по первой мишени и проявляется положительный сигнал по второй ДНК мишени. Для отделения штаммов античного биовара линии 3. ANT от штаммов 0.ANT необходимо было найти эффективную ДНК мишень, дифференцирующую эти штаммы.
Проведенный нами анализ нуклеотидных последовательностей штаммов линии 3.ANT не позволил на данный момент выявить ДНК мишени для детекции штаммов линии 3.ANT методом ПНР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Поэтому для их детекции нами разработан другой способ, основанный на выявлении маркерных замен единичных нуклеотидов методом фрагмент-ного секвенирования. Известно, что абсолютное большинство замен единичных нуклеотидов произошло в истории эволюции возбудителя чумы лишь однажды, за исключением нескольких зон гомоплазий, локализация которых в геноме хорошо известна (Одиноков и др., 2013; Achtman et al, 2004; Morelli et al., 2010; Cui et al., 2013). Ввиду этого детекция отдельных филогенетических линий Y. pestis возможна путем выявления единичных нуклеотидных замен, маркерных для этих линий.
На основе сравнения геномов штаммов Y. pestis MGJZ7, MGJZ6 и MGJZ3 (NCBI GenBank) с геномами других филогенетических линий была выявлена единичная замена нуклеотида, перспективная для использования в качества маркерной SNP для штаммов линии 3.ANT. Замена единичного нуклеотида С— А находилась в гене YP02499 в позиции 139 от начала гена. На вариабельный участок были рассчитаны праймеры YP02499 S - GCCGCGAAGTCAGTACCAG и YP02499 As - ATTCTGATCATGGCCGGTGT, и подобраны условия проведения ПНР: 1 цикл 94С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94С 45 с, 57С 1 мин, 72С 45 с и завершающий цикл 3 мин при 72С. Полученные в ПНР продукты анализировали методом электрофореза в 1% агарозном геле при напряжении 10-15 В/см. Определение нуклеотидных последовательностей ПЦР фрагментов, полученных с праймерами на мишень YP02499, проводили на секвенаторе Genetic Analyzer «CEQ 8000» (Beckman Coulter). Сравнительный анализ последовательностей полученных фрагментов выполняли с применением алгоритма BLAST и программ DNA STAR v. 11.2.1.25, а также UGENE версии 1.12.2.
На наличие маркерной замены (С— А) в гене YP02499 были проверены штаммы античного биовара, представленные в таблице 8, в том числе 22 штамма линии 0.ANT из высокогорных очагов Тянь-Шаня, 4 штамма линии 1.ANT из Африки и 8 штаммов линии 2.ANT из Забайкальского степного очага. У всех этих штаммов маркерная замена в гене YP02499 отсутствовала. Она также отсутствовала у 9 взятых в эксперимент штаммов из Тувинского горного очага -Y. pestis И-3223, 1771, 2060, И-2638, И-3110, И-3265, 1146, И-3358, И-3264. Маркерная замена в гене YP02499 выявлялась только у нескольких взятых в эксперимент штаммов Y. pestis И839, И840, И846, И847 из Монголии, что позволило предположить их принадлежность к линии 3.ANT. В дальнейшем (глава 5) эффективность этого способа, основанного на выявлении маркерного нуклеотида для линии 3.ANT, подтверждена при проведении филогенетического анализа штаммов из природных очагов России, Монголии и Киргизии.
Таким образом, в этой главе впервые разработан способ определения принадлежности штаммов чумного микроба античного биовара к филогенетическим линиям 0.ANT, l.ANT, 2.ANT, 3.ANT, 4.ANT с использованием ПЦР с гибриди-зационно-флуоресцентным учетом результатов и на основе выявления маркерной замены единичного нуклеотида с помощью метода секвенирования. Установлена высокая специфичность предлагаемого подхода при исследовании большого числа штаммов Y. pestis античного биовара, выделенных на разных территориях. Использование разработанного способа позволяет быстро и надежно устанавливать принадлежность исследуемого штамма Y. pestis античного биовара к конкретной филогенетической линии, и, следовательно, определять географический регион его происхождения.
В главах 3 и 4 нами разработан способ с использованием ПЦР с гибридиза-ционно-флуоресцентным учетом результатов для определения принадлежности штаммов Y. pestis основного подвида к биоварам и к основным филогенетическим линиям O.ANT, l.ANT, 2.ANT, 4.ANT, 2.MED, 2.MED0, l.ORI, а также способ детекции штаммов линии 3.ANT методом выявления маркерной замены единичного нуклеотида с помощью секвенирования.
В этой главе разработанный способ использован для филогенетического анализа штаммов Y. pestis основного подвида из природных очагов России и части очагов сопредельных стран. Всего исследовано 113 штаммов Y. pestis основного подвида, в том числе 49 штаммов основного подвида из очагов России, 24 штамма основного подвида из очагов Монголии и 40 из высокогорных очагов Киргизии.
Филогенетическая принадлежность штаммов Y. pestis основного подвида из природных очагов чумы в России В таблице 10 представлены результаты филогенетического анализа штаммов Y. pestis основного подвида из 9 природных очагов России, в которых циркулируют штаммы основного подвида. Всего исследовано 47 штаммов Y. pestis, выделенных в России.
Филогенетический анализ штаммов Y. pestis основного подвида, выделенных в Горно-Алтайском высокогорном очаге в 2012 и 2014 гг
В плазмиде pCKF в позиции 5219-5308 также выявлен участок с богатым содержанием А+Т, равным 65,9%. Этот участок находится перед геном rep белка репликации и, по-видимому, является точкой начала репликации плазмиды pCKF.
В целом полученные данные доказывают связь генов плазмиды pCKF с процессами транспорта и секреции, и с высокой долей вероятности с системой секреции IV типа. Близкие функции описаны ранее для генов плазмиды pCRY штамма microtias Y. pestis 91001 (Song et аі, 2004). . В мировых информационных ресурсах сведения о плазмиде pCKF отсутствуют. Последовательность pCKF депонирована в базе данных NCBI GenBank с номером доступа КМ112087. Не исключено, что именно наличие плазмиды pCKF обеспечило сохранение в Центрально-Кавказском высокогорном очаге этой древней линии 2.MED0 атипичных штаммов средневекового биовара.
Для детекции атипичных штаммов средневекового биовара в ПНР с гибри-дизационно-флуоресцентным учетом результатов использован участок плазмиды pCKF в позиции 3205-3332, который обозначен нами как мишень «pCKF». Эта мишень расположена в начале гена CDS6, и представляет собой участок, богатый Г+ГД парами. На нее рассчитаны праймеры и зонд в формате TaqMan, и определены условия проведения ПНР. Эффективность разработанной ПЦР подтверждена на 72 штаммах Y. pestis разных подвидов, в том числе на 21 типичном и 12 атипичных штаммах средневекового биовара. В ПНР на мишень «pCKF» сигнал флуоресценции наблюдался только у атипичных штаммов средневекового биовара из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы. В целом использование трех разработанных монолокусных ПНР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на мишени «Med24», «pCKF» и «glpD» обеспечивает разделение штаммов Y. pestis всех трех биоваров, включая и атипичные штаммы средневекового биовара. Штаммы средневекового биовара относятся к линии 2.MED (а атипичные - к 2.MED0), а штаммы восточного биовара к линии l.ORI.
Большую сложность представляет собой определение филогенетической принадлежности штаммов античного биовара. Штаммы этого биовара отличаются значительным генетическим разнообразием. Филогенетическая линия 0.ANT является древней линией античного биовара, которая в процессе эволюции дала начала линиям 1.ANT и 2.ANT. Штаммы линии 1.ANT в дальнейшем явились эволюционными предками восточного биовара (l.ORI), а линии 2.ANT - средневекового биовара (2.MED). Нами путем сравнительного анализа полногеномных последовательностей штаммов античного биовара, представленных в базе данных NCBI GenBank, с помощью алгоритма BLAST выявлены две эффективные ДНК мишени для разделения штаммов линий 0.ANT1, 1.ANT и 2.ANT в ПНР в традиционном формате с электрофоретическим учетом результатов. Для детекции штаммов 1.ANT выбран участок генома, содержащий у штаммов этой линии фи-ламентозный фаг cusq), локализованный в позиции 2554179-2562920 н. Для детекции штаммов 1.ANT в ПНР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов нами рассчитаны праймеры и зонд в формате TaqMan, комплементарные последовательности фага cusq), которые обеспечивают получение флуоресцентного сигнала у штаммов линии 1.ANT. Филаментозный фаг cusq) содержится также в геноме всех штаммов восточного биовара l.ORI, однако, линия античного биовара 1.ANT отделяется от l.ORI по наличию сигнала в ПЦР по ДНК мишени «glpD». У штаммов восточного биовара сигнал по мишени «glpD» отсутствует.
Для дифференциации штаммов другой филогенетической линии античного биовара - 2.ANT выбрана мишень «70», которая представляет участок гена у 1694, содержащий у штаммов этой линии делецию размером 70 п.н. после 811 н. от начала гена. Нами рассчитаны праймеры на участки гена у 1694, фланкирующие делецию, и зонд, комплементарный самому участку делеции, определены оптимальные условия проведения ПНР. В ПЦР у штаммов линии 2.ANT положительный сигнал на мишень «70» отсутствует. Делеция размером в 70 п.н. в гене у 1694 присутствует также и у штаммов средневекового биовара линии 2.MED, однако, линия 2.ANT отделяется от них по наличию положительного сигнала по мишени «Med24». У штаммов линии 2.MED сигнал на «Med24» отсутствует. Эффективность двух разработанных ПЦР подтверждена на 34 штаммах античного биовара. Таким образом, впервые разработаны две ПЦР с гибридизаци-онно-флуоресцентным учетом результатов для дифференциации трех основных филогенетических линий античного биовара O.ANT, 1.ANT и 2.ANT.
Кроме этих трех линий недавно выделены еще две филогенетические линии античного биовара 4.ANT и 3.ANT. Эти линии отделились от древней линии 0.ANT одновременно с линиями 1.ANT и 2.ANT, однако, в отличие от двух последних, они не стали предшественниками других филогенетических линий и распространены на ограниченных очаговых территориях в России, Монголии и Китае. Штаммы линии 4.ANT циркулируют в Тувинском горном очаге, расположенном в России. Проведенный нами анализ последовательностей штаммов 4.ANT показал, что у них отсутствуют филаментозный фаг cusq) и делеция в 70 п.н. в гене у1694. В ПЦР с праймерами и зондами на мишени «Cus» и «70» у них, как и у штаммов линии 0.ANT отсутствует флуоресцентный сигнал по первой мишени и проявляется положительный сигнал по второй ДНК мишени. Для разделения штаммов античного биовара линий 0.ANT и 4.ANT необходимо было найти эффективную ДНК мишень, дифференцирующую штаммы этих двух линий. Штаммы Y. pestis основного подвида из Тувинского горного очага чумы содержат криптическую плазмиду рТРЗЗ размером 34 т.п.н., которая отсутствует у других штаммов Y. pestis (Балахонов, 2000; 2013). Поскольку последовательность рТРЗЗ могла быть использована для выбора мишени для детекции штаммов 4.ANT нами впервые проведено секвенирование полного генома этой плазмиды. Установлено, что размер плазмиды составляет 33829 п.н., и что она содержит 52 открытые рамки считывания. Состав Г+Ц пар составляет у рТРЗЗ 50,3 %, относительно 47,6% хромосомы у содержащих ее штаммов Ypestis, что не исключает возможности приобретения плазмиды рТРЗЗ от других бактерий семейства Enterobacteriaceae. С помощью сервера поиска открытых рамок считывания RAST и алгоритма NCBI GenBank glimmer3 большинство генов рТР733 идентифицированы как фаговые белки. В частности CDS 19, CDS27, CDS28, CDS30, CDS31, CDS33, CDS36, CDS37, CDS38, CDS41, CDS45, CDS46, CDS47, CDS48, CDS51, CDS52 кодируют, по данным RAST фаговые или фаг-связанные белки. Продукты генов CDS2, CDS25 и CDS26 участвуют в образовании структур хвоста фага. Ген CDS21 кодирует рекомбинационный белок RecT фага, CDS24 - белок ExoZ продукции экзополисахарида, CDS51 - большую субъединицу фаговой термина-зы.
Белки, кодируемые CDS1, CDS3, CDS4, CDS6, CDS11, CDS12, CDS16 и CDS20, принимают участие в процессе репликации ДНК, а также в лизисе бактериальной стенки. CDS1 кодирует интегразу, которая по последовательности С-концевого каталитического домена на 100% совпадает с надсемейством интеграз, включающих в себя тип IB топоизомераз и тирозин-рекомбиназ. Продукт CDS3 является лизоцимом, который имеет 100% идентичности с лизоцимом Y. pestis, а продукт CDS4 имеет 100% идентичности с холином (предположительно II семейства) Y. pestis. Лизоцим вместе с холинами может участвовать как в эндолизисе, так и в авто лизисе бактериальной клетки.
Продукт CDS6 является белком начала репликации ParA, CDS 10, CDS 11 и CDS20 - экзорибонуклеазой VIII (по классификации ферментов - ЕС 3.1.П.), CDS 16 - белком инициации репликации. Все эти белки имеют 100% гомологии с соответствующими белками Y. pestis.
Кроме белков фагового морфогенеза в плазмиде рТРЗЗ выявлены два гена CDS 12 и CDS 13, которые кодируют гены двухкомпонентной системы белков токсин/анатоксин YoeB/YefM. CDS 12 имеет 97% покрытие и 73% сходство с белком YoeB суперсемейства токсин-антитоксин YoeB/YefM регулирующей системы, локализованной в основном на плазмидах семейства Enterobacteriaceae. Белок YoeB является токсином, действующим на репликативный аппарат бактерий. Он связывается с ДНК акцептора и препятствует расхождению хромосом во время деления клетки.