Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Краткая историческая справка таксономического и фенотипического исследования серных спирилл рода Thiospira 17
1.2. Окислительный стресс и системы защиты микроорганизмов от токсичных форм кислорода 17
1.2.1. Окислительный стресс и пути образования активных форм кислорода 21
1.2.2. Влияние АФК на клеточные компоненты микроорганизмов и чувствительность бактерий к продуктам неполного восстановления кислорода 21
1.2.3. Ферментативные способы защиты бактерий от АФК 24
1.2.4. Неферментативные способы защиты отАФК 30
1.3. Роль серных соединений в метаболизме гетеротрофных бактерий 35
1.3.1. Использование соединений серы в детоксикации АФК у гетеротрофных сероокисляющих бактерий... 37
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 44
2.1. Объекты исследования 44
2.2. Материал для выделения 44
2.3. Состав питательных сред , 44
2.4. Методы изучения морфологии, ультроструктуры и внутриклеточных включений у гетеротрофных спирилл 47
2.5. Физиолого-биохимические исследования 47
2.6. Техника микроаэробного культивирования 48
2.7.Молекулярно-генетические методы анализа 48
2.7.1. Генотипические свойства 49
2.7.2. ПЦР гена 16SpPHK 49
2.7.3. Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и филогенетический анализ 49
2.8. Получение клеточной суспензии и ферментных препаратов 50
2.9. Методы определения активности ферментов 51
2.9.1. Определение активности ферментов, участвующих в удалении токсичных форм кислорода 51
2.9.2. Определение активности ферментов, приводящих к синтезу ФЕПи углеводов 52
2.9.3. Определение активности ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла 54
2.9.4. Определение активности ферментов, поставляющих субстраты для синтеза аминокислот 55
2.9.5. Определение активности ферментов, участвующих в превращениях восстановленных соединений серы 55
2.10. Физико-химические методы анализа 56
2.10.1 Определение белка 56
2.10.2. Методы определения концентрации кислорода 57
2.10.3. Радиоуглеродный метод определения интенсивности декарбоксилирования органических кислот 58
2.10.4. Анализ неорганических соединений серы 59
2.10.5. Определение ацетата 59
2.10.6. Определение общего содержания углеводов 59
2.10.7. Определение Н202 59
2.10.8. Определение концентрации АТФ в клетках бактерий 60
2.10.9. Определение убихинонов 60
2.10.10. Методика идентификации микроорганизмов по составу клеточных жирныхкислот 61
2.10.11. Определение метаболитной антиокислительной активности 61
2.10.12. Статистическая обработка экспериментальных данных 61
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Выделение и характеристика новых микроаэрофильных серных спирилл 62
3.1.1. Условия выделения. Морфология и ультроструктура спирилл 62
3.1.2. Фенотипические свойства микроаэрофильных гетеротрофных серных спирилл 65
3.1.2.1. Культуральные и физиолого-биохимические свойства 65
3.1.2.2. Влияние кислорода на накопление клеточной биомассы спирилл 69
3.1.3. Молекулярно-генетические исследования микроаэрофильных серных спирилл 73
3.1.3.1. Филогенетический анализ новых штаммов 73
3.1.3.2. Генотипические исследования 73
3.2. Пересмотр таксономического положения представителей рода Aquaspirillum 78
3.2.1. Филогенетический анализ 78
3.2.2. Генотипические исследования 84
3.2.3. Хемотаксономические исследования 86
3.2.4. Сравнительный анализ физиолого-биохимических свойств аэробных спирилл 89
3.3. Влияние кислорода на ростовые процессы и накопление клеточной биомассы у микроаэрофильных серных спирилл 100
3.4. Окислительный стресс и системы антиоксидантной защиты у бесцветных серобактерий 103
3.4.1. Влияние кислородного режима культивирования на скорость образования Н2О2 в клетках микроаэрофильных серных спирилл S. winogradsldi 103
3.4.2. Ферментативные системы защиты от токсичных форм кислорода 106
3.5. Влияние кислородного режима культивирования на биосинтетические процессы у S. winogradskii 109
3.6. Функциональная роль серных соединений в энергетическом и конструктивном метаболизме микроаэрофильных серных спирилл 117
3.6.1. Влияние концентрации кислорода и восстановленных серных соединений на ростовые процессы 117
3.6.2. Механизм окисления восстановленных серных соединений 119
3.6.3. Образование АТФ в клеточной суспензии 122
3.6.4. Активность ферментов серного метаболизма 124
3.6.5. Влияние тиосульфата на конструктивный метаболизм S. winogradskii 126
3.7. Функциональная роль тиосульфата в антиоксидантной защите клеток у гетеротрофных сероокисляющих бактерий 132
Заключение 135
Выводы 141
Список литературы 143
- Окислительный стресс и системы защиты микроорганизмов от токсичных форм кислорода
- Использование соединений серы в детоксикации АФК у гетеротрофных сероокисляющих бактерий...
- Влияние кислорода на накопление клеточной биомассы спирилл
- Влияние кислорода на ростовые процессы и накопление клеточной биомассы у микроаэрофильных серных спирилл
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бесцветные серобактерии - морфологически своеобразная группа прокариот, неоднородная в таксономическом' и филогенетическом плане. Экологические ниши бесцветных серобактерий в пресноводных и морских водоемах расположены на границе распространения H2S-02 и характеризуются нестабильным режимом и диффузионной лимитацией доноров или акцепторов электронов для роста (Jorgensen, Revsbech 1983; Schulz et al, 1996; Kojima et al, 2003). Это определяет с одной стороны микроаэрофильную природу большинства известных видов, а с другой -трудности их культивирования, поэтому большинство из обнаруживаемых морфотипов относятся к некультивируемым видам. Необходимо отметить, что природа микроаэрофилии микроорганизмов недостаточна ясна. Поэтому выяснение причин микроаэрофилии бесцветных серобактерий представляется актуальной задачей. По типу метаболизма бесцветные серобактерии представлены хемолитотрофами и гетеротрофами (Nelson, Castenholz, 1981; Дубинина, Грабович, 1983; Nelson, 1989; Грабович и др., 1998), причем у последних функциональная роль серных соединений в энергетическом метаболизме до конца не выяснена.
Среди бесцветных серобактерий, серные спириллы представляют довольно обширную группу, которая достаточно широко распространена в природных экосистемах (Omelianski, 1905; Molish, 1912; Владимирова, 1958; Дубинина, 1989; Bernard, Fenchel, 1995). В начале прошлого века с использованием морфологического подхода было описано несколько видов серных спирилл, отнесеннъж к роду Thiospira. В последующие годы штаммы бесцветных серньж спирилл были получены лишь в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов. Изучение их фено - и генотипических свойств позволило провести их ревизию и поместить в пределах рода Aquaspirillum (Дубинина, Грабович, 1984; Грабович и др., 1987; Дубинина и др., 1989; Грабович и др., 1990; Дубинина и др., 1993). Однако, исследование филогении и таксономии с применением современных молекулярно-биологических методов не было проведено в отношении серньж спирилл.
Цель и задачи работы Цель настоящей работы состояла в определении филогенетического положения пресноводных серньж спирилл, выяснении физиологии и адаптационньж механизмов в условиях окислительного стресса у микроаэрофильньж представителей серньж спирилл.
Конкретные задачи заключались в следующем:
Выделение представителей микроаэрофильньж серньж спирилл.
Выяснение таксономического и филогенетического положения группы аэробньж и микроаэрофильньж бесцветньж серньж спирилл.
Исследование физиолога - биохимических основ микроаэрофилии и систем антиоксидантной защиты клеток.
Выяснение функциональной роли восстановленных соединений серы в метаболизме микроаэрофильных серных спирилл.
Научная новизна работы. Выделены и охарактеризованы два новые штамма микроаэрофильных гетеротрофных серных спирилл, которые отнесены к роду Spirillum в качестве двух новых видов: S. kriegii sp.nov. и S. winogradskii sp.nov. По совокупности фенотипических свойств, составу жирных кислот и хинонов, результатам ДНК-ДНК гибридизации и анализа последовательностей гена 16S рРНК, четыре штамма гетеротрофных серных спирилл и пять видов гетеротрофных спирилл, ранее входивших в род Aquaspirillum, объединены в состав двух новых родов: Giesbergeria gen. nov.H Simplispira gen. nov. К роду Giesbergeria gen. nov. отнесены новые виды G. mznetsovii sp. nov., G voronezhense sp. nov., а также известные ранее виды [A.] giesbergeri, [А.] sinuoswn, [A.] aniilus в виде новых комбинаций. В род Simplispira gen. nov. объеденены два известные ранее вида - [A.] metamorphwn и [А.]'psychrophilum в качестве новых комбинаций.
Установлено, что микроаэрофилия серных спирилл обусловлена окислительным стрессом в условиях роста при свободном доступе кислорода как следствие образования и накопления АФК в клетке в литических концентрациях. Последнее связано с низкой активностью или отсутствием ферментных систем защиты от АФК либо их пространственной разобщенностью.
Впервые на примере гетеротрофных бесцветных серобактерий обоснована полифункциональная роль серных соединений в метаболизме гетеротрофных бактерий. Положительное влияние соединений серы на рост и стабильность культур проявляется: 1) в предотвращении токсического действия АФК на клетки путем их удаления при химическом взаимодействии; 2) в защитном и стабилизирующем влиянии на ферменты углеродного метаболизма, особенно на ферменты, содержащие SH-группы и железо-серные кластеры; 3) в повышении антнокислительного состояния клеток за счет активизации и регуляции процессов конструктивного метаболизма, направленных на синтез клеточных компонентов, содержащих SH-группы.
Практическая значимость работы. Работа расширяет
фундаментальные представления о видовом разнообразии, филогенетических связях группы прокариот в пределах класса бетапротеобактерий. Полученные результаты могут быть использованы в соответствующих разделах учебньж программ по микробиологии, биохимии и физиологии микроорганизмов. Результаты исследования биохимических механизмов повреждающего действия АФК и механизмов антиоксидантной защиты могут быть использованы при решении общебиологических проблем борьбы с окислительным стрессом у живых организмов.
Апробация работы. Результаты диссертации были представлены и обсуждались на Школе-конференции молодых ученых «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), 5-й и 6-й Пущинских школах -конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино 2001, 2002), на Международной конференции «Водные экосистемы и организмы» (Москва, 2001) и на 1-ом Международном FEMS Конгрессе Европейских микробиологов (Словения, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая 3 статьи и 5 тезисов докладов.
Место проведения работы. Работа проведена в Лаборатории экологии и. геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (заведующий лабораторией - д.б.н. проф. Горленко В.М.) и на кафедре Физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета (заведующий кафедрой -д.б.н. проф. Епринцев А.Т.).
Определение состава нуклеотидных оснований ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию выполнили к.б.н. А.М. Лысенко и к.б.н. Н.А. Черных (ИНМИ РАН). Анализ последовательностей 16S рДНК выполнили к.б.н. Е.Ю. Гавриш (ИБФМ РАН) и к.б.н. Т.П. Турова (ИНМИ РАН). Исследование ультроструктурной организации клеток спирилл проводили совместно с Л.Л. Митюшиной (ИНМИ РАН). Анализ убихинонов выполнила к.б.н. Е.Ю. Гавриш. Жирнокислотный состав клеток спирилл выполнил д.б.н. Г.А. Осипов (академическая группа академика РАМН Ю.Ф. Исакова).
Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам и друзьям, принимавшим участие на разных этапах работы. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. проф. Дубининой Г.А. и к.б.н. Грабович М.Ю. за содействие в работе и помощь при обсуждении результатов.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть» (включающая подразделы «Объекты и методы исследования», «Результаты и их обсуждение», «Заключение»), «Выводы» и «Список литературы», который содержит 59 отечественных и 202 иностранных наименований работ. Материалы диссертации изложены на 170 страницах машинописного текста и содержат 21 таблицу и 20 рисунков.
Принятые сокращения: БСА - бычий сывороточный альбумин; 2,6-ДХФИФ - 2,6-дихлорофенолиндофенол; ЦГК - цикл трикарбоновых кислот; ЭТЦ - электротранспортная цепь; ФЕП - фосфоенолпировиноградная кислота; РБФК - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа; АФК -активные формы кислорода.
Окислительный стресс и системы защиты микроорганизмов от токсичных форм кислорода
В этом разделе кратко обобщены основные представления о окислительном стрессе различной природы. В настоящее время исследования, посвященные изучению причин и механизмов окислительного стресса, достаточны обширны. Они показывают, что реакции с участием кислорода в живой клетке чаще всего происходят в активном центре оксидаз или оксигеназ (Chance et al, 1979; Метелица, 1982; Messner, Imlay, 1999). В ходе этих реакций могут образовываться и промежуточные продукты восстановления молекулярного кислорода, такие как супероксидный радикал (супероксид анион) - О2", перекись водорода - Н202, гидроксильный радикал - ОН . Эти соединения обладают высокой реакционной способностью и получили название активных форм кислорода (АФК). Вместе с тем установлено, что Н202 является нормальным продуктом жизнедеятельности организма и используется им для образования стероидных гормонов или выступает в качестве эффектора ряда ферментативных реакций (Храпова, 1982). Наряду с этим показано, что дисбаланс между процессами образования и удаления продуктов неполного восстановления кислорода в клетке с участием антиоксидантных систем, приводит к окислительному стрессу в живых организмах (Gerschman et aL, 1954).
Данные литературы свидетельствуют, что свободнорадикальный механизм старения и запрограмированная клеточная смерть (апоптоз) связаны с окислительным стрессом (Зенков и др., 1999; Синицкая, Хавинсон, 2002). Типичный феномен апоптоза характерен главным образом для многоклеточных организмов, однако, в настоящее время у некоторых прокариот зафиксированы некоторые изменения к стресс орным воздействиям, напоминающие процесс апоптоза в эукариотных организмах -фрагментация ДНК, сморщивание клеток, деградация РНК, протеолиз и синтез новых белков (Ameisen, 1996; Hochman, 1997; Lewis, 2000). Очевидно, что эти реакции, названные «проапоптозом» являются филогенетическим предшественником запрограммированной гибели клеток эукариот (Hochman, 1997). Известно, что апоптоз представляет собой филогенетический процесс, необходимый для жизнедеятельности многоклеточных организмов и играет важную роль в противовирусной и противоопухолевой защите организма (Baixerax et aL, 1994). Множественность физиологических и патологических проявлений апоптоза и универсальность его проявления в организмах разного эволюционного уровня послужило причиной начала широкого круга исследований, направленных на изучение окислительного стресса не только в эу кари отеческих, но и в прокариотических клетках.
Особое внимание в последние десятилетия уделяется изучению роли АФК в окислительном стрессе у бактерий (Hassan, Fridovich, 1978; Demple, Halbrook, 1983; Stoz et aL, 1990; Demple, 1991; Imlay, Fridovich, 1991; Лущак, 2001). Это связано с тем, что высокореакционные АФК образуются в клетках всех прокариот, и их токсическое действие может быть снижено с участием работы многоуровневых систем антиоксидантной защиты клетки.
Нарушения в работе антиоксидантных систем может привести к гибели клеток. В норме АФК вырабатываются в процессе аэробного дыхания клеток при одно-, двух- и трехэлектронном восстановлении кислорода в дыхательной цепи, а также в результате самоокисления переносчиков электронов дыхательной цепи, имеющих низкий окислительно восстановителный потенциал - флавинов, хинонов (Панкин и др., 2001). Показано,-что двумя основными местами образования свободных радикалов в дыхательной цепи являются Комплекс I (НАДН - коэнзим Q - редуктаза) и Комплекс III (Убихинон - цитохром с - редуктаза) (Genova et al.r 2001). С помощью ингибиторного анализа у Escherichia coli обнаружено образование 0{ на начальном участке ЭТЦ - на уровне НАДН - дегидрогеназы и на участке между убихиноном и цитохромом b (Conzales-Flecha, Demple, 1995). В дыхательной цепи на уровне НАДН - дегидрогеназы показано образование Нг02у штамма Beggiatoa Д-405 (Чеканова, 1991), на уровне ферредоксинов происходит образование Н2О2 у цианобактерий Anacystis nidulans, Anabaena variabilis и у анаэробных фототрофов Chloropseudomonas (Tefler et ah, 1970; Honneegt et ah, 1970). Образование H2O2 может наблюдаться при функционировании формиатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы (Niekus et ah, 1978). Самоокисление флавинсодержащих ферментов может сопровождаться образованием как 02\ так Н2С 2 (Massey, 1994), причем увеличение образования Н2О2, как продукта, способного к диффузии, по сравнению с (V наблюдается при функционировании НАДН -дегидрогеназы, сульфитредуктазы и ксантиноксидазы (Hille, Massey, 1981; Messner, Imlay, 1999), тогда как больший выход 0{ происходит в реакциях, катализируемых ферментами сукцинатдегидрогеназоЙ и фумаратредуктазой (Messner, Imlay, 2002). В образовании свободных радикалов в клетках могут принимать участие высокотоксичные соединения - гидроперекиси (Akaikei et ah, 1992), образующиеся в результате перекисного окисления липидов мембран (Turton et ah, І977) или в растительной клетке в ответ на микробное заражение (Sutherland, 1991). Токсическое действие Н202 связано с тем, что она участвует в реакции, известной как реакция Фентона, с образованием гидроксильного радикала (Fenton, Jackson, 1899). В присутствие ионов металлов с переменной валентностью в восстановленной форме, таких как Fe2+, Cu+, Н202 разлагается с образованием ОН. ОН образуется не только в реакции Фентона, показано, что при неблагоприятных условиях или в отсутствие систем защиты в клетке от АФК, Ог" и Н202 могут образовывать ОН в реакции Хабера - Вайса, катализируемой ионами металлов (Осипов и др., 1990). В отсутствие ионов Fe константа скорости реакции не превышает 0.35 М с . Кроме того, причиной окислительного стресса могут быть экзогенные источники свободных радикалов, такие, как ионизирующая радиация, облучение ближним УФ, в качестве генератора внутриклеточного 02 используют паракват, менадион (McCormick et ah, 1976; Fridovich, 1978). В природных водах образование АФК наблюдалось при фотохимических или химических реакциях, при флуктации концентраций кислорода в водной среде (Draper, Crosly, 1983). Образование Н202 наблюдалось и в лабораторных культуральных средах, которые предварительно подвергали освещению до внесения в них инокулята (Padgett et ah, 1982). В стерильных лабораторных средах может накапливаться до 10 цМ Н202, образуемой в результате окисления Сахаров (Imlay, 2003).
Использование соединений серы в детоксикации АФК у гетеротрофных сероокисляющих бактерий...
Выяснение механизма окисления неорганических соединений серы у гетеротрофных одноклеточных серобактерий родов Thiospira и Macromonas позволило сделать заключение о функциональной роли восстановленных серных соединений в детоксикации продуктов неполного восстановления кислорода (Дубинина, Грабович, 1983; Дубинина, Грабович, 1984; Дубинина, 1989).
Участие Н202 в окислении H2S у представителей рода Beggiatoa впервые было предложено Буртон и Морита (1964) и позже показано рядом исследователей (Nelson, Castenholz, 1981; Дубинина, 1989; Дубинина и др., 1990). Исследование локализации продуктов неполного восстановления кислорода и продуктов окисления H2S - элементной серы у серорбактерий, указывает на их пространственную взаимосвязь. Отложение серы происходит в периплазме и инвагинатах цитоплазматической мембраны, где накапливается Нг02. У гетеротрофного штамма Beggiatoa Д -405 пул Н202, накапливаемый в периплазме, составляет 90%» от образованной в культуре или в клеточной суспензии, а количество элементной серы, откладываемой в периплазме, может достигать 90% от веса сухих клеток (Чеканова, Дубинина, 1990; Чеканова, 1991). Удаление Н202 из клеток нитчатых и одноклеточных серобактерий путем их обработки каталазой предотвращает накопление серы внутри клеток (Дубинина, Грабович, 1983; Чеканова, Дубинина, 1990). Эти факты могут рассматриваться как доказательство образования серы у исследуемых гетеротрофных серобактерий в процессе детоксикации Н202. Имеющиеся в литературе сведения показывают, что у многих микроаэрофильных бактерий, обитателей сульфидсодержащих водных экосистем преобладают неферментативные реакции удаления АФК с участием восстановленных серных соединений (Дубинина, 1989). Такими неспецифическими восстановителями могут быть как вещества неорганической природы, так и органические соединения, в частности, такие, как пептон, содержащий аминокислоты с SH-группой, цистин (Bowdre et al.t 1976; Norris et al., 1978; Дубинина, Грабович, 1983).
Из вышесказанного можно заключить, что вопрос о физиологических функциях восстановленных серных соединений у многих гетеротрофных микроорганизмов на сегодняшний день недостаточно исследован.
Завершая обзор литературы, посвященный анализу, проводимых в последние десятилетия исследований в области таксономии, причин окислительного стресса, путей детоксикации АФК в клетках прокариот и физиологии гетеротрофных спирилл, необходимо отметить, что несмотря на достигнутый прогресс в получении и изучении чистых культур гетеротрофных серных спирилл, многие виды микроорганизмов этой группы остаются" пока недоступными для исследователей. Сведения об этих организмах ограничиваются отдельными экологическими и физиологическими исследованиями природных популяций.
Из сравнительного анализа проведенных филогенетических исследований рода Aquaspirillum, к которому были отнесены, выделенные в чистую культуру гетеротрофные серные спириллы, можно отметить, что род Aquaspirillum оказался весьма гетерогенен в генетическом отношении и в настоящее время имеются предпосылки к его разделению на несколько новых независимых родов. Важно подчеркнуть, что филогенетическое положение гетеротрофных серных спирилл остается на сегодняшний день не выясненным. Определение таксономического описания некоторых видов с использованием хемотаксономических исследований, отнесенных ранее к роду Aquaspirillum, и проведение филогенетических исследований видов гетеротрофных серных спирилл позволит решить вопрос об их эволюционном родстве и положении в таксономической системе микроорганизмов.
Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению основополагающих причин микроаэрофилии, в этой области исследований остается на сегодняшний день много невыясненного. В свете этих данных не представляется возможным объяснить причины приуроченности развития микроорганизмов, и, в частности, группы гетеротрофных серных спирилл, к микроаэробным нишам. Высказываются предположения, что приуроченность развития микроорганизмов к этой экологической нише обусловлена повышенной чувствительностью бактерий к продуктам неполного восстановления кислорода, которая, в свою очередь, может быть следствием ряда факторов как эндогенной, так и экзогенной природы. В природных средах микроаэрофилия может быть связана с ингибирующим влиянием экзометаболитов на ферменты антиоксид антной защиты клеток в микроаэробных сообществах, что рассматривается как один из механизмов межклеточных взаимодействий (Бухарин и др., 2002), либо действием АФК внешней среды, образуемых при фотохимических или химических реакциях, при флуктации концентраций кислорода в водной среде.
Влияние кислорода на накопление клеточной биомассы спирилл
Исследуемые штаммы не метаболизируют аминокислоты: гистидин, тирозин, фенил аланин, аланин, глутамат, аспартат, аспарагин, глутамин, пролин, гидроксипролин, серии, глицин, орнитин, аргенин, лизин, метионин, истин, лейцин, валин, треонин, триптофан, цистин; спирты - пропанол, маннит, глицирин, этанол, бутанол; сахара - глюкозу, фруктозу, мальтозу, арабинозу, галактозу и сахарозу; полимерные соединения - пептон, крахмал, гидролизат казеина. Клетки характеризуются наличием оксидазной активности и очень низкой активности каталазы (0,3-0,27 мкм/мин/мг белка). Нитраты не восстанавливают до нитритов. Оба штамма не растут в присутствии в среде NaCI выше 0,5%. В качестве источника азота бактерии используют аммонийные соли, пептон и гидролизат казеина и не способны к использованию нитрата, нитрита и индивидуальных аминокислот.
Исследуемые штаммы обладают респираторным типом метаболизма и не способны к росту в анаэробных условиях за счет использования в качестве акцептора электронов: фумарата, нитрата, сульфата или тиосульфата.
При посеве культур в пробирки на полужидкую среду (ОД 5% агар) развитие штамма Д-427 происходит на глубине 0,3-0,5 см от поверхности, что указывает на тенденцию штамма к микроаэрофилии. Однако, штамм Д-427 способен расти и на поверхности среды с 1,5% агаром в присутствии восстановленных соединений серы, тогда как развитие штамма Д-430 с 1,5% агаром происходит только в толще агара при экспозиции чашек на воздухе, что указывает на более выраженную тенденцию к микроаэрофилии у штамма Д-430 по сравнению со штаммом Д-427.
Результаты влияния концентраций кислорода на прирост биомассы штаммов Д-427 и Д-430 представлен на рис. 6. Культивирование микроорганизмов осуществляли при конечной концентрации кислорода в газовой фазе от 20 до 0,4% на качалках. Как видно из рис. накопление максимальной биомассы бактерий штамма Д-427 происходит при содержании Ог в газовой фазе среды культивирования 2%, что соответствует 0,6 мг/л 02 в жидкой среде культивирования, тогда как для штамма Д-430 оптимальное содержание ( в газовой фазе составило 0,8% кислорода (0,1 мг/л С 2 в жидкой среде культивирования). Анализ полученных результатов показывает, что оба штамма спирилл: штамм Д—427 и Д-430 по морфологическим свойствам — размерам, формой клетки и способностью к внутриклеточному накоплению элементной серы близки к описанному ранее, но не культивируемому виду Thiospira winogradsky - (Omelianski 1905). Однако, сравнительный анализ фенотипических и физиолого - биохимических исследований показывает, что штаммы Д-430 и Д—427 очень близки к типовому и единственному виду рода Spirillum - облигатному микроаэрофилу S. volutans. Несмотря на большое сходство морфологических и физиолого-биохимических свойств, серные спириллы имеют ряд отличий от типового вида (табл.3.). По продуктам окисления восстановленных соединений серы, выделенные микроаэрофильные штаммы сходны с аэробными серными спириллам. Штаммы аэробных серных спирилл были отнесены ранее к роду Aquaspirillum, и для них был показан перекисный механизм окисления серных соединений (Дубинина, 1989). Необходимо отметить, что широко применяемые в последние годы современные методы молекулярно-генетических исследований к представителям рода Aquaspirillum, показали филогенетическую гетерогенность этого рода. В связи с неопределенным таксономическим статусом представителей рода Aquaspirillum таксономическое положение аэробных серных спирилл также оставалось не выясненным. В связи с этим следующая задача работы состояла в исследовании филогенетического положения и таксономической принадлежности описанных ранее аэробных и выделенных нами микроаэрофильных серных спирилл. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал, что оба исследуемых штамма Д-427 и Д—430 относятся к классу бетапротеобактерий. Филогенетический анализ свидетельствовал о том, что штаммы Д-427 и Д-430 имеют высокий уровень сходства нуклеотидных последовательностей как между собой (98,4%), так и с типовым и единственным видом рода Spirillum - Spirillum volutans (97,4 - 97,8%), с которым образуют единый кластер на филогенетическом дереве в семействе Spirilliaceae (рис. 7). Для установления родства между штаммами были проведены генотипические исследования. Определение нуклеотидного состава ДНК показало, что содержание Г+Ц пар в ДНК у штамма Д-427 составляет 38,0 мол.%, а у штамма Д-430 эта величина составила 38,9 мол.%. Для установления родства между штаммами и видом S. volutans была проведена ДНК - ДНК гибридизация, которая выявила, что штамм Д-427 имеет 12% уровня гомологии со S. volutans (АТСС 19553) и 28% со штаммом Д- 430. Таким образом, результаты ДНК-ДНК гибридизации выявили низкий уровень гомологии ДНК исследованных штаммов как между собой, так и с видом S. volutans, что указывает на видовую обособленность штаммов Д-427 и Д—430 в пределах рода Spirillum. Анализ полученных данных генотипического анализа позволяет расширить границы рода Spirillum, внеся соответствующие коррективы в его диагноз и отнести штаммы Д-4-27 и Д-430 к новым видам рода Spirillum со следующими диагнозами:
Влияние кислорода на ростовые процессы и накопление клеточной биомассы у микроаэрофильных серных спирилл
Диагноз Giesbergeria kuznetsovii sp. nov. Giesbergeria kuznetsovii (kuz .net.so.vi.i M.L. gen. n. kuznetsovii— в честь русского микробиолога СИ. Кузнецова),
Спиральные клетки толщиной от 1,2 - 1,5 до 3 мкм, от Ідо 4 оборотов спирали, диаметр спирали 1,9-4,0 мкм. Подвижны с помощью биполярных пучков жгутиков. Внутри клеток накапливают поли-р-оксимасляную кислоту, волютин, а в присутствии сульфидов - элементную серу. Бактерии грамотрицательные. Аэробы, пределы рН для роста 6,0-8,5, оптимум температуры 28С. Хемоорганогетеротрофы. Для роста используют широкий спектр органических кислот: ацетат, сукцинат, малат, фумарат, бензоат, изоцитрат, формиат, 2-оксоглутарат, оксалоацетат, пируваг, салицилат, лактат, глиоксилат; спиртов: пропанол, маннитол, глицерол, этанол, бутанол; все аминокислоты. Сахара не усваивают. В качестве источника азота используют соли аммония, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, пептон, аспартат, глутамат, цистеин. Нитраты не восстанавливают до нитритов. Казеин и крахмал не гидролизуют; нитраты, сульфаты, тиосульфат, фумарат не используют в качестве акцепторов электронов. Обладают каталазной, оксидазной, уреазной активностью. Образуют сероводород из цистеина. Индол не образуют. Содержание Г+Ц пар в ДНК составляет 56,5 мол.% (Тт). Источник выделения: сульфидный источник. Типовой штамм Д-412 (=DSM 12827і).
Диагноз Giesbergeria voronezhense sp. nov. (базоним Aquaspirillum voronezhense Грабович и др., 1987) Giesbergeria voronezhense (vo, ro, ne, zhen. se M.L. gen. n. voronezhense - воронежская, указывает на географическое местоположение, откуда были выделены штаммы). Описание вида Giesbergeria voronezhense идентично описанию вида Aquaspirillum voronezhense в работе Грабович и др., 1987. Типовой штамм Д-419Т (= DSM 12825Г=СТР 107340т) Диагноз Giesbergeria sinuosa comb. nov. (базоним Aquaspirillum sinuosum Williams, Rittenberg, 1957; Hylemon et al., 1973) Giesbergeria sinuosa (si.nu.o sa. M.L. adj. sinuosa - полные обороты). Описание вида Giesbergeria sinuosa идентично описанию вида Aquaspirillum sinuosum в работе Hylemon eta I., 1973. Типовой штамм АТСС 9786T=DSM 11556т. Диагноз Giesbergeria giesbergeri comb. nov. (базоним Aquaspirillum giesbergeri Williams, Rittenberg, 1957; Hylemon et al., 1973) Giesbergeria giesbergeri (gies bcr.ger.i. M.L. gen. n. giesbergeri от Giesberger, назван в честь исследователя Giesberger G., внесшего большой вкад в исследование физиологических характеристик гетеротрофных спирилл). Описание вида Giesbergeria giesbergeri идентично описанию вида Aquaspirillum giesbergeri в работе Hylemon et al., 1973. Типовой штамм АТСС 11334T=DSM 9157T=NCIB 9073T=NRRL В-20607. Диагноз Giesbergeria anula comb. nov. (базоним Aquaspirillum anulus Williams, Rittenberg, 1957; Hylemon etal, 1973) Giesbergeria anula (a nu. la. L. masc. п. апиЫ - кольцо). Описание вида Giesbergeria anula идентично описанию вида Aquaspirillum anulus в работе Hylemon et al. ,1973. Типовой штамм NCI В 9012\ Диагноз Simplispira gen.nov. Simplispira (Sim. pli. spi ra. Gr. n. simplex - простая; Gr. n. spira - спираль; M.L. fem. Simplispira - простая спираль). Клетки полиморфны - от слегка изогнутых палочек до вибриоидных, спиральных клеток, подвижных с помощью биполярных пучков жгутиков. Бактерии грамотрицательные. Внутри клеток накапливают поли-Р-оксимасляную кислоту. Аэробы, пределы рН для роста 5,5-9,0, температурные пределы роста 2-3 8С. Хеыоорганогетеротрофы. Каталазо- и оксидазоположительны. Не растут с 3% NaCl. Основные жирные кислоты -гексадекановые (16:0) и гексадеценовые (16:1) кислоты; содержание пентадекановых (15:0), гептадекановых (17:0) и октадеценовых (18:1) кислот может варьировать у представителей рода. Основной убихинон - Q-8. Содержание Г+Ц в ДНК 63 - 65 мол.%. (Тт). Для представителей рода сходство генов 16S рРНК составляет более 97,8%. Широко распространены в пресноводных водоемах и в промышленных стоках. Типовой вид Simplispira metamorpha (базоним Aquaspirillum metamorphum Terasaki, 1961; Hylemon et al, 1973) с типовым штаммом АТСС 15280т (= DSM 12825MFO 12012т). Диагноз Simplispira metamorpha comb. nov. (базоним Aquaspirillum metamorphum (Terasaki, 1961; Hylemon et al., 1973) Simplispira metamorpha (me.ta.mor pha. M.L. adj. metamorpha — изменяющийся, имеющий много форм).
Описание вида Simplispira metamorpha идентично описанию вида Aquaspirillum metamorphum Hylemon et al., 1973. К этому виду отнесен штамм серных спирилл Д-416 (=DSM 12826).
Дополнение к описанию вида: штамм Д-416 обладает уреазной активностью; основные жирные кислоты - гексадекановые (16:0) и гексадеценовые (16:1) кислоты, а так же такие кислоты как пентадекановые (15:0) и гептадекановые (17:0). Типовой штамм АТСС 15280т= DSM 12825T=IFO 12012т Диагноз Simplispira psychrophila comb, no v. (базоннм Aquaspirillum psychrophilum (Terasaki, 1973; Terasaki, 1979) Simplispira psychrophila (psy.chro phila. Gr. adj. psychros - холод; Gr. adj. phila - предпочитать, любить; M.L. fem. adj. psychrophila — предпочитающий холод). Описание вида Simplispira psychrophila идентично описанию вида Aquaspirillum psychrophilum в работе Hylemon et al.,1973. Типовой штамм DSM 11588Т=АТСС 33335T=IFO 13611T=LMG 5108т.
