Фенотипические и генотипические особенности представителей группы STAPHYLOCOCCUS INTERMEDIUS, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания животных и человека Балбуцкая Анна Александровна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 14

1.1. Таксономическое положение и распространенность стафилококков группы Staphylococcus intermedins (SIG) 14

1.2. Биохимическая активность и методы видовой идентификации 16

1.3. Экология, эпидемиологическое значение и роль представителей

группы SIG в патологии животных 20

1.4. Роль SIG в патологии человека 23

1.5. Биологические свойства возбудителей

1.5.1. Факторы патогенности SIG 26

1.5.2. Чувствительность к антибактериальным средствам 31

1.6. Популяционная структура S. pseudintermedius 33

Заключение 34

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 36

2.1. Бактериальные штаммы 36

2.2. Фенотипические методы исследования 37

2.2.1. Изучение факторов патогенности SIG 37

2.2.2. Изучение биохимических свойств 40

2.2.3. Определение чувствительности к антибактериальным средствам 41

2.2.4. Идентификация изолятов SIG методом MALDIOF-MS 42

2.3. Генотипические методы исследования 43

2.3.1. Постановка ПЦР (выделение ДНК, амплификация, электрофорез) 43

2.3.2. Идентификация и дифференциация культур, методами ПЦР и секвенирования 44

2.3.3. Детекция генов, кодирующих детерминанты патогенности 45

2.3.4. Определение гена тесА и структурных компонентов кассет 47

2.4. Изучение патогенности S. pseudintermedius на экспериментальных

моделях 49

ГЛАВА 3. Результаты исследования 51

3.1. Общая характеристика изолятов SIG 51

3.2. Морфологические и культурально-биохимические свойства представителей SIG 55

3.3. Протеомный анализ методом MALDIOF-MS

3.4. Дифференциация стафилококков SIG генотипическими методами 60

3.5. Определение факторов патогенности 65

3.6. Чувствительность SIG к антибактериальным средствам 68

3.7. Определение гена тесА и структурных компонентов кассет SCC 69

3.8. Исследование структурного полиморфизма гена spa 69

3.9. Изучение патогенности S. pseudintermedius на экспериментальных моделях 72

Выводы 96

Практические рекомендации 98

Перспективы дальнейшей разработки темы 99

Список литературы

• Таксономическое положение и распространенность стафилококков группы Staphylococcus intermedins (SIG)
• Чувствительность к антибактериальным средствам
• Идентификация изолятов SIG методом MALDIOF-MS
• Дифференциация стафилококков SIG генотипическими методами

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Подсчитано, что более 60% открытых в
последние десятилетия инфекционных болезней человека по своему

происхождению являются зоонозами. В 2004 г. ВОЗ было дано определение вновь возникающим возбудителям зоонозных заболеваний, как патогенам впервые открытым, впервые выделенным или встречавшимся прежде, но проявляющим повышенную способность вызывать заболевания или увеличившим ареал географического распространения, изменившим свою хозяйскую специфичность или механизм передачи (Cutler S. et al., 2010).

Среди возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний человека и животных ведущее место занимают представители рода Staphylococcus. В конце XX века развитие молекулярных методов исследования позволило значительно расширить номенклатуру видов, образующих род, в том числе наиболее патогенных его представителей – группы коагулазопозитивных стафилококков. Исследование биологических свойств изолятов золотистого стафилококка, изолированных от различных видов животных и птиц, позволило выделить еще 6 самостоятельных таксонов: S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi ssp. coagulans, S. lutrae, S. hyicus и S. pseudintermedius (Hajek V., 1976; Varaldo P. et al., 1988; Devriese L. et al., 1978; Igimi S. et al., 1990; Foster G. et al., 1997). Последний коагулазоположительный вид S. pseudintermedius был дифференцирован от близкородственных ему видов S. intermedius и S. delphini методом ДНК-ДНК гибридизации в 2005 г. (Devriese L. et al., 2005).

Группа S. intermedius (SIG) включает три вида: S. intermedius, S. delphini и S. pseudintermedius (Sasaki T. et al., 2007). Биологическими хозяевами микроорганизмов группы SIG являются дикие млекопитающие и птицы, а также домашние и сельскохозяйственные животные и птицы, экологически тесно связанные с человеком. Показана возможность передачи представителей вышеназванной группы как от животных к человеку, так и от человека к человеку (Guardabassi L. et al., 2004; van Duijkeren, E. et al., 2011). Ряд авторов указывает, что роль основного источника S. pseudintermedius для человека принадлежит мелким домашним животным, у которых он является не только частью нормальной микрофлоры, но и возбудителем различных гнойно-воспалительных

4 заболеваний (Hanselman В. et al., 2009; De Lucia M. et al., 2011). Недавно показано, что S. pseudintermedius может вести себя как типичный нозокомиальный патоген, вызывающий вспышки заболеваний среди животных в ветеринарных клиниках (Sasaki Т. et al., 2007; van Duijkeren E., 2011). Обнаружено, что у человека представители некоторых видов SIG могут являться возбудителями абсцесса мозга, бактериемии, инфекционного эндокардита, менингита, пневмонии, остеомиелита, инфекций мочевыделительной системы и других заболеваний (Pottumarthy S. et al., 2004; Durdik P. et al., 2010; Wang N. et al., 2013). Клинические признаки инфекций, вызванных S. pseudintermedius, сходны с клиническими проявлениями заболеваний, вызванных S. aureus. Показано, что возбудители SIG могут являться этиологическим агентом пищевых токсикоинфекций (Khambarty F. et al., 1994). Тем не менее, реальный удельный вес этих видов стафилококка в патологии человека и животных неизвестен из-за отсутствия общепринятой схемы дифференциации коагулазоположительных видов стафилококка.

Представители группы, как и S. aureus, имеют разнообразный набор факторов
патогенности, в том числе гемолизины, эксфолиатины и энтеротоксины.
Некоторые представители SIG могут содержать стафилококковые хромосомные
кассеты mec (SCCmec), несущие в своем составе mecA ген, oпределяющий
устoйчивость к -лактамным антибиoтикам, и гены резистентности к другим
классам антимикробных средств. Полагают, что приобретение новых свойств
позволило наиболее успешным эпидемическим клонам S. pseudintermedius
получить широкое географическое распространение, циркуляция одного из
которых, а именно ST 71, установлена на территории многих стран мира (Perreten
V. et al., 2010). Как показали немногочисленные исследования,

множественнорезистентные представители этого эпидемического клона чаще колонизируют организм человека и могут являться этиологическим агентом различных гнойно-воспалительных заболеваний (Stegmann R. et al., 2010; Paul N. et al., 2011). Накопленные данные по геномике микроорганизмов свидетельствуют о том, что большинство бактериальных эпидемий вызвано ограниченным числом клонов, обладающих специфическими эпидемическими и патогенными свойствами, поэтому их идентификация имеет большое эпидемиологическое значение (Raoult D. et al., 2014).

5 Целенаправленных исследований по изучению видов, входящих в группу S. intermedius, в РФ ранее не проводилось, за исключением цикла работ по изучению S. intermedius, выполненных в лаборатории стафилококковых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН под руководством профессора А.К. Акатова в 80-х гг. прошлого века с использованием фенотипических методов исследования (Акатов A.K. и др., 1983).

Степень разработанности темы. До настоящего времени не существует
общепринятых методов и схемы дифференциации группы S. intermedius и других
коагулазоположительных видов стафилококка, отсутствуют сведения о
распространении этих микроорганизмов на территории РФ, неизвестен их
удельный вес в инфекционной патологии животных и человека. Отсутствует
информация о циркуляции метициллинустойчивых генетических линий
представителей SIG на территории нашей страны и, соответственно, о частоте их
выделения. Учитывая данные ряда иностранных публикаций, в которых
отмечается быстрое приобретение изолятами SIG генов устойчивости к разным
классам антибиотиков и быстрое распространение метициллинустойчивых клонов
с множественной лекарственной устойчивостью в разных странах, можно
предположить развитие подобного сценария и на территории РФ. Все эти
обстоятельства определяют актуальность исследований данной работы,
посвященной изучению биологических свойств представителей SIG, разработке
методов их дифференциации, молекулярно-генетической характеристике

представителей группы, выявлению циркулирующих в России эпидемических клонов метициллинустойчивых S. pseudintermedius (MRSP), исследованию факторов патогенности и разработке биологических моделей для их изучения.

Целью работы явилось изучение биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов, входящих в группу S. intermedius, для совершенствования методов микробиологической диагностики вызываемых ими заболеваний и мониторинга эпидемически успешных генетических линий патогенов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить видовой спектр микроорганизмов рода Staphylococcus, изолированных от различных видов домашних и сельскохозяйственных животных, а также птиц, находящихся в тесном контакте с человеком, в центральном регионе РФ.

2. Выявить частоту распространения представителей SIG среди животных-носителей и животных с различными формами стафилококковой инфекции, изучить их фенотипические свойства: биохимическую активность, наличие секретируемых факторов патогенности, чувствительность к антибактериальным средствам.

3. Сравнить дифференцирующую способность различных генетических локусов и определить оптимальные мишени для видовой идентификации представителей SIG.

4. Выявить клональность популяции SIG:

- определить наличие генов токсинов, обладающих суперантигенной
активностью, специфичных для SIG и S. aureus: lukF/S-I, siet, se-int, sea, seb, sec,
sed, see и tsst-1;

- определить наличие гена mecA и структурных компонентов кассет mec
(SCCmec);

- исследовать структурный полиморфизм вариабельного фрагмента гена
протеина А.

5. Разработать экспериментальную модель для изучения роли факторов
патогенности в патогенезе различных нозологических форм заболеваний,
вызванных SIG.

Научная новизна. Собрана коллекция представителей SIG, циркулирующих на территории центрального региона РФ и выделенных от животных и птиц со стафилококковой инфекцией различной локализации и от животных-носителей. Получена комплексная микробиологическая, биохимическая и генетическая характеристика включенных в коллекцию изолятов.

Впервые показано, что для улучшения качества идентификации

представителей SIG методом MALDI-TOF-MS необходимо использовать в качестве метода пробоподготовки предварительную экстракцию белков с

7 добавлением муравьиной кислоты и ацетонитрила, а также дополнить базу данных прибора масс-спектрами изолятов SIG различного происхождения.

Разработана схема видовой дифференциации коагулазоположительных стафилококков. Установлено, что наиболее эффективными генетическими мишенями для дифференциации представителей группы S. intermedius и других коагулазоположительных видов являются гены термонуклеазы (nuc) и каталазы (kat).

Обнаружено, что подавляющее большинство изолятов S. pseudintermedius несли, как минимум, три гена токсинов с суперантигенной активностью: lukF/S-I, siet и se-int. 6,4% изолятов S. pseudintermedius несли ген, кодирующий энтеротоксин С S. aureus и 10% - энтеротоксин Е S. aureus.

Впервые в центральном регионе РФ идентифицированы

метициллинустойчивые изоляты S. pseudintermedius, принадлежащие к трём различным клонам, один из которых соответствует основному европейскому эпидемическому клону MRSP ST71, циркулирующему на территории многих стран мира.

Показано наличие внутривидовых различий у метициллинчувствительных изолятов S. pseudintermedius исследованной популяции на oсновaнии фeнотипичеcких и гeнетичеcких иccледoвaний.

Впервые разработаны экспериментальные модели воспроизведения как локализованных, так и системных заболеваний, вызванных S. pseudintermedius, у белых мышей, кроликов 8-9 месячного возраста, 2-3 месячных щенков собак и цыплят различного возраста. На всех экспериментальных моделях показана зависимость тяжести течения инфекции от дозы возбудителя и набора факторов патогенности.

Теоретическая и практическая значимость работы. Коллекция изолятов SIG может быть использована для дальнейших генетических исследований, детекции факторов патогенности и вирулентности этой группы микроорганизмов, расшифровки механизмов адаптации к новым хозяевам. Впервые доказано, что наиболее эффективным методом дифференциации представителей группы S. intermedius и других коагулазоположительных видов стафилококка является

8
метод секвенирования katА гена, который позволяет достоверно

идентифицировать 100% образцов.

Впервые на территории РФ показана циркуляция штаммов S.

pseudintermedius, несущих гены энтеротоксинов С и Е, гомологичные генам соответствующих токсинов S. aureus.

Экспериментальные модели стафилококковых инфекций у различных видов животных, вызванных S. pseudintermedius, могут быть использованы для разработки схем лечения и испытания новых препаратов для терапии.

Результаты исследований нашли отражение в методических рекомендациях: «Методические наставления по идентификации, определению факторов патогенности и генов антибиотикорезистентности у Staphylococcus intermedius», одобренные секцией «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН «27» апреля 2011 г. (протокол № 2). Методические наставления на ежегодной выставке ВВЦ удостоены серебряной медали в 2011 г.

«Методическое пособие по идентификации и видовой дифференциации коагулазоположительных стафилококков методом ПЦР», одобренное секцией «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН «05» октября 2013 г. (протокол № 5).

Методология и методы исследования. Методологической основой
диссертационного исследования послужили экспериментальные и специфические
методы исследования: бактериологические, биохимические,

патологоанатомические, молекулярно-генетические, биоинформационный,

статистический, MALDI–TOF–MS. Исследования проводились на современном сертифицированном оборудовании.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На территории центрального региона РФ среди коагулазоположительных
стафилококков, изолированных от различных видов домашних и

сельскохозяйственных животных и птиц, находящихся в тесном бытовом контакте с человеком, доминирующим видом является Staphylococcus pseudintermedius. Основным источником данного возбудителя для человека

9 являются собаки. Главный экотоп в организме хозяина – слизистая оболочка ротовой полости.

2. Разработанная на основе молекулярно-генетических технологий схема идентификации и дифференциации представителей SIG и других коагулазоположительных видов стафилококка позволяет повысить качество диагностики стафилококковых инфекций.

3. Популяция вида S. pseudintermedius в центральном регионе России является гетерогенной. Представители вида отличаются наличием разнообразного набора факторов патогенности, 23% культур обладают множественной устойчивостью к антибиотикам.

4. Разработанные схема и модель генерализованной и локализованной экспериментальных инфекций для изучения патогенного потенциала S. pseudintermedius показали зависимость тяжести течения инфекции от дозы возбудителя и набора факторов патогенности.

Степень достоверности и апробация работы. Основные положения

диссертационной работы доложены на ХIII и XV Международных научно-
производственных конференциях «Проблемы сельскохозяйственного
производства на современном этапе и пути их решения», Белгород, Россия, 19-22
мая 2009 и 15–16 мая 2013 гг.; 22^nd European Congress of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases (ECCMID), London, United Kingdom, 31 March-3 April 2012;
VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным
участием «Молекулярная диагностика 2014», Москва, Россия, 18-20 марта 2014 г.;
VI Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва,
Россия, 24-26 марта 2014 г.; XVIII Международной научно-производственной
конференции «Проблемы и перспективы инновационного развития
агроинженерии, энергоэффективности и IT-технологий», Белгород, Россия, 15-16
мая 2014 г.; Российско-Китайской научно-практической конференции по
медицинской микробиологии и клинической микологии (XVIII Кашкинские
чтения), Санкт-Петербург, Россия, 9-11 июня 2015 г.

Обсуждение диссертационной работы состоялось на заседании лабораторий микробиологии, молекулярной биологии, биохимии и иммунологии ФГБНУ «ВНИИЭВ им. Я.Р. Коваленко» 17.06.2015 г. и на совместной научной

10 конференции отделов бактериальных инфекций и медицинской микробиологии ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ 23.06.2015 г.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 научных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационного исследования.

Личное участие автора в получении результатов. Все этапы диссертационной работы, подготовка основных публикаций по выполненной работе, оформление диссертации и автореферата выполнены Балбуцкой А.А. самостоятельно. Отдельные этапы были проведены в сотрудничестве с ведущим научным сотрудником лаборатории анализа геномов Ворониной О.Л. ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Москва); с сотрудниками лаборатории микробиологии Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова (Москва) Анкирской А.С. и Любасовской Л.; секвенирование выполнено на базе ЦКП «Геном» ИМБ РАН (Москва).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и 5 приложений. Список литературы включает 176 источников литературы, в том числе 18 отечественных, 148 иностранных и 10 ссылок на электронные ресурсы. Диссертация включает 16 таблиц и 17 рисунков.

Таксономическое положение и распространенность стафилококков группы Staphylococcus intermedins (SIG)

В соответствии с классификацией, представленной в 9-м издании «Определителя бактерий» D.H. Bergey [12], последнем из изданий, опубликованных в России, род Staphylococcus относится к 17 группе -грамположительные кокки, к подгруппе - факультативно анаэробные кокки. Кроме стафилококков в эту группу были включены роды Aerococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Melissococcus, Pediococcus, Saccharococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus и Vagococcus, собранные в одну группу на основании только двух признаков - сферическая форма клеток и положительная реакция при окраске по Граму. Развитие молекулярных методов исследований в конце XX и начале XXI веков позволило пересмотреть таксономическое положение рода Staphylococcus. На основании результатов ДНК-ДНК гибридизации, определения величины геномов, а также сходства последовательностей гена рибосомной РНК (16S рРНК) род Staphylococcus был объединен вместе с родами Gamella, Macrococcus и Salinococcus в семейство Staphylococcaceae, которое в свою очередь относится к порядоку Bacillales, классу Bacilli, типу Firmicutes [31].

Современная номенклатура бактерий рода Staphylococcus представлена 51 видом и 27 подвидами [106].

Стафилококки распространены повсеместно (в воздухе, пыли, на поверхности различных объектов внешней среды). Для многих представителей рода характерен выраженный дуализм. С одной стороны - они комменсалы и являются представителями нормальной микрофлоры наружных покровов и слизистых оболочек домашних и диких млекопитающих, птиц и человека. С другой стороны - способны вызывать огромное многообразие гнойно-воспалительных заболеваний у животных и человека [7]. На основании способности коагулировать плазму крови путем продукции плазмокоагулазы, которая активирует преобразование фибриногена в фибрин, род Staphylococcus делят на две группы: коагулазоположительные и коагулазоотрицательные стафилококки.

В конце XX века значительно изменилась номенклатура наиболее патогенных представителей рода - группы коагулазоположительных стафилококков (КПС). Изучение экологии золотистого стафилококка первого и главного представителя этой группы, исследование биохимических свойств изолятов стафилококка, выделенных от различных диких и домашних животных, позволило ряду исследователей выделить их в самостоятельные таксоны: S. intermedins, S. delphini, S. schleiferi ssp. coagulans, S. lutrae и S. hyicus.

Долгое время наиболее патогенным видом считался только S. aureus, характеризующийся выраженной полигостальностью. Было известно, что S. aureus способен вызывать заболевания не только у человека, но и широкого круга млекопитающих, птиц и земноводных, при этом все грамположительные кокки, изолированные от них и проявляющие диагностически важные характеристики, такие как продукция коагулазы, ДНК-зы или Р-гемолизина идентифицировали, как S. aureus. Но в 1976 г. Hajek V. обнаружил, что стафилококки, изолированные от голубей, собак, лисиц, норок и лошадей отличались от S. aureus и S. epidermidis биохимическими свойствами и строением клеточной стенки. Он предложил выделить эту группу микроорганизмов в самостоятельный вид S. intermedius, название которого было образовано из двух латинских слов: наречие inter -«между», «среди» и прилагательное mediums - «средний», в результате intermedius означает «промежуточный». Выделение S. intermedius в самостоятельный вид имело большое эпидемиологическое значение, так как позволило разделить наиболее значимые для патологии животных и человека коагулазоположительные виды стафилококка. Вместе с тем, Hajek V. [76], а вскоре после него и другие ученые [46], отмечали значительную фенотипическую гетерогенность изолятов S. intermedius, связывая это в той или иной степени с их происхождением. Несколько позднее был описан еще один коагулазоположительный вид - S. delphini, вызывавший гнойные поражения кожи у дельфина [164]. И только в 2005 г. Devriese L. с соавторами, используя метод ДНК-ДНК гибридизации при анализе изолятов стафилококка, полученных от кошки, собаки, лошади и попугая, выделили в самостоятельный таксон -Staphylococcus pseudintermedius. Авторы дифференцировали данный вид от близкородственных ему видов S. intermedins и S. delphini [48].

Поскольку секвенирование гена 16S рРНК - генетической мишени, наиболее широко используемой для видовой идентификации многих бактерий, не позволило дифференцировать эти три близкородственных вида, они были объединены в "S. intermedins группу" (SIG) [23; 145]. Некоторые ученые полагают, что после таксономических изменений в классификации коагулазопозитивных стафилококков в 2005 г., основывающихся на молекулярно-генетических исследованиях, все изоляты, выделенные от собак (а, вероятно, и от кошек) и описанные до 2005 г., как S. intermedins, в настоящее время следуют считать S. pseudintermedius [34; 49; 59]. Молекулярно-генетические исследования и последующий филогенетический анализ коллекций изолятов SIG, выделенных до 2005 г., показали, что S. intermedins является доминирующим видом у диких голубей, a S. delphini является основным возбудителем инфекций у лошадей и домашних голубей [23; 145].

Учитывая изменения таксономического положения S. intermedins, при анализе данных литературы, опубликованных до 2005 г., мы позволили себе, как и некоторые другие авторы, для характеристики изолятов S. intermedins употреблять название вида S. (pseud)intermedins, ввиду того, что они могли бы быть переклассифицированы в S. pseudintermedius.

Исторически изучение этой группы микроорганизмов началось с изучения особенностей их биохимической активности. Было показано, что микроорганизмы SIG обладают высокой гликолитической активностью и способны ферментировать с образованием молочной кислоты сахарозу, маннит, мальтозу, маннозу, трегалозу, галактозу, глюкозу, лактозу, рибозу в аэробных условиях. Они синтезируют аргинингидролазу, образуют пирролидониламидазу и 3-галактозидазу, интенсивно образуют уреазу, восстанавливают нитраты в нитриты. дают вариабельную реакцию в тесте на продукцию ацетоина (Фогес-Проскауэра) и отрицательную - на цитохромоксидазу. Большинство представителей группы не образуют Р-глюкозидазу и р-глюкуронидазу, не ферментируют эскулин, арабинозу, ксилозу, целлобиозу, раффинозу, ксилитол, рамнозу, сорбит, салицин, целлобиозу, инулин, крахмал. Все представители SIG чувствительны к акрифлавину и новобиоцину [37; 48; 49; 145].

В последние годы были предприняты многочисленные попытки разработки схемы дифференциации КПС на основании фенотипических признаков, однако разработать чёткие критерии идентификации так и не удалось. Наибольшие разногласия среди ученых вызывала биохимическая характеристика представителей SIG. При изучении различных коллекций изолятов этой группы выяснилось, что из-за вариабельной экспрессии ими биохимических признаков как в пределах одного вида, так и между видами невозможна их четкая дифференциация внутри группы [119; 145]. Вследствие чего до настоящего времени не существует коммерческих диагностических тест-систем, позволяющих дифференцировать эти виды SIG. Сходство биохимических и фенотипических свойств S. pseudintermedius и S. aureus при проведении дифференцирующих тестов в рутинной микробиологической практике может приводить к ошибочной идентификации S. pseudintermedius, как непигментированного S. aureus [170].

Чувствительность к антибактериальным средствам

Идентификацию чистых культур микроорганизмов рода Staphylococcus, изолированных из различных образцов патологического материала, проводили с помощью набора «STAPHYtest 24» («PLIVA - Lachema Diagnostika s.r.o», Brno, Чехия). Биохимическая тест-система включает ячейки с высушенными питательными средами и субстратами для 24 тестов. Для проведения тестов готовили суспензию из чистой суточной культуры второй степени мутности по шкале МакФарланда (6х108 КОЕ/мл). Мутность суспензии определяли с помощью оптического прибора Densi-La-Meter (Erba Lachema s.r.o, Чехия). Бактериальную суспензию в лунки вносили согласно инструкции. Пластинку и контрольную чашку инкубировали при температуре +37С в течение 24 часов.

В качестве дополнительных тестов изоляты проверяли на резистентность к новобиоцину и полимиксину, продукцию ацетоина, оксидазную активность.

Диагностические диски НОВОБИОЦИН (PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o., Чехия) предназначены для дифференциации коагулазоотрицательных стафилококков по размеру зон задержки роста. Тест основан на природной резистентности некоторых видов коагулазоотрицательных стафилококков к новобиоцину. Для постановки теста использовали 3-х часовые бульонные культуры исследуемых штаммов, доводили их до мутности 0,5 по шкале МакФарланда. Стерильным ватным тампоном делали посев суспензий на чашках с агаром Мюллера-Хинтон («HiMedia», Индия), затем раскладывали диски с новобиоцином. Чашки инкубировали 24 часа при температуре +37С, после чего измеряли диаметры зон задержки роста. Штаммы считали резистентными при размере зоны 16 мм, чувствительными, если зона задержки роста была 16 мм.

Продукцию ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) определяли с помощью ВП-теста, обнаружение бактериальной цитохромоксидазы проводили с помощью ОКСИ-теста согласно инструкциям производителя (PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o., Чехия).

При оценке «STAPHYtest 24» ориентировались по входящим в набор для идентификации цветным шкалам. Оценку идентификации проводили при помощи компьютерной программы «Микроб-2» (PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o., Чехия). Эта программа производит идентификацию каталазоположительных кокков и оценку её качества. В программе также учитывались результаты дополнительных тестов (микроскопия, характер колоний, наличие пигмента, гемолиз и т. д.).

Чувствительность к антибактериальным препаратам определяли диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон («HiMedia», Индия), интерпретировали результаты в соответствии с МУК 4.2.1890-04 от 04.03.2004 г. [11]. В работе использовали бумажные диски с доксициклином, клиндамицином, эритромицином, хлорамфениколом, ципрофлоксацином, фузидиевой кислотой и гентамицином.

Резистентность изолятов к оксациллину определяли с помощью следующих методов: 1) диско-диффузионный метод с использованием бумажных дисков, содержащих 1 мкг/мл оксациллина («bioMrieux», Франция) [11]; 2) инкубация при 30С на агаре Мюллера-Хинтон с добавлением оксациллина от 0,5 до 500 мкг/мл [18]. 2.2.3. Идентификация изолятов SIG методом MALDIOF MS

Исследования проводили в лаборатории микробиологии Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова совместно с Анкирской А.С. и Любасовской Л., а также в лаборатории микробиологии Центральной ветеринарной лаборатории земли Гессен, г. Гиссен, Германия. Идентификацию микроорганизмов изучаемой коллекции осуществляли методом MALDIOF-MS на масс-спектрометре «AutoflexIII» («Braker Daltonics», Германия) с программным обеспечением «Biotyper» (версия 3.0). Для анализа использовали изолированные колонии, полученные при посеве на плотные питательные среды. Пробоподготовку проводили двумя методами согласно протоколу производителя прибора: 1) метод прямого нанесения образца на мишень; 2) метод предварительной экстракции белков: - для приготовления суспензии в пробирку Eppendorf объемом 2,0 мл добавляли 300 мкл деионизированной воды и несколько колоний суточной культуры исследуемого микроорганизма. Затем добавляли 900 мкл абсолютного этанола; - пробирки центрифугировали при 13000 об./мин. в течение 2 мин., удаляли надосадочную жидкость, повторяли центрифугирование и удаляли оставшуюся надосадочную жидкость пипетированием; - к осадку добавляли 30 мкл 70% муравьиной кислоты, затем 30 мкл ацетонитрила; - встряхивали пробирки на вортексе в течение 5-10 сек. и центрифугировали при 13000 об./мин. в течение 2 мин.; - 1 мкл супернатанта помещали на две ячейки стальной мишени масс спектрометра и высушивали при комнатной температуре; - сверху на каждый образец наносили матрицу (а-циано-4-гидроксикоричная кислота и 50,0% ацетонитрил/2,5% трифторуксусная кислота), высушивали при комнатной температуре. Мишень помещали в масс-спектрометр. Калибровку прибора проводили с использованием известных значений масс охарактеризованных белков Е. coli. Анализ полученных масс-спектров, сопоставление их с имеющимися спектрами в базе данных производителя прибора проводили с помощью программного обеспечения MALDI «Biotyper» (версия 3.0). Данное программное обеспечение позволяет осуществлять идентификацию микроорганизмов и рассчитывать коэффициент достоверности {score). В соответствие с рекомендациями производителя прибора результаты идентификации с уровнем достоверности 1,700 считали недостоверными. Уровень достоверности со значением score от 1,7 до 1,999 свидетельствовал о вероятной идентификации до рода, score от 2,000 до 2,299 - о достоверной идентификации до рода и недостоверной до вида, score от 2,300 до 3,000 - о достоверной видовой идентификации.

Для идентификации, типирования, выявления детерминант патогенности и резистентности использовали метод ПЦР с визуализацией продуктов амплификации в агарозном геле. Выделение ДНК проводили по методике, разработанной Дмитренко О.А. с соавторами [8]. Все праймеры использованные в работе были синтезированы в ЗАО «Евроген» (Россия). Амплификацию проводили в объеме 25 мкл реакционной смеси, в состав которой входили: 2,5 мкл амплификационного буфера (Юх) рН=8,6; 2,5 мМ каждого дезоксирибонуклеотидфосфата (смесь dATP, dGTP, dTTP, dCTP); 0,4 мкл Taq-полимеразы (5ед/мкл) фирмы «Силекс» (Россия); по 1 мл каждого праймера; 1 мкл вносимой ДНК ( 20 нг). Количество MgCb могло меняться в зависимости от условий реакции. Деионизированную воду добавляли до необходимого объема 25 мкл. В некоторых реакциях был увеличен объем ДНК-матрицы до 2 мкл. Амплификацию ДНК проводили на термоциклере «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Детекцию продуктов амплификации осуществляли методом гель 44 электрофореза в 1,5% агарозном геле («LE BioWhittaker», Франция) с окраской фрагментов ДНК бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в 1х ТАЕ буфере («Fermentas», Литва) при 100 В. DNA-Ladder (100-1500 н.п.) («Fermentas», Литва) использовали для определения размера ампликонов. Гель фотографировали в УФ-свете с помощью гель-документирующей системы «DNA Analizer» (Россия).

Идентификация изолятов SIG методом MALDIOF-MS

Согласно данным Таблицы 10, большинство из 119 исследованных культур проявляли ДНК-азную и протеазную активность (97±1,6%), продуцировали лецитиназу (82,3±3,5%), ферментировали маннит в аэробных условиях (81 ±3,6%). При определении наличия фактора слипания (Clumping-фактора) положительными оказались 73±4,1% изолятов. 76±3,9% культур были способны расти в анаэробных условиях. Фибринолитической активностью обладали 30±4,2% изолятов.

Рост в анаэробной среде 91 (76±3,9%) - 14 (24±3,9%) 117 изолятов SIG изучаемой коллекции были протестированы на наличие генов, кодирующих синтез пирогенных токсинов с суперантигенной активностью: энтеротоксинов А, В, С, D, Е и TSST S. aureus (sea, seb, sec, sed, see, tsst), специфического энтеротоксина SE-int (se-int), эксфолиативного токсина S. intermedius (siet) и лейкоцидина (lukS, lukF). Данные ПЦР со специфическими праймерами для каждого вида токсинов показали наличие гена se-int у 107 (91,5±2,6%) изолятов, siet был обнаружен у 114 (97±1,6%) изолятов. 112 (96±1,8%) содержали гены lukS и lukF. 6,4% изолятов S. pseudintermedius сформировали ампликоны с праймерами, выявляющими энтеротоксин С S. aureus и 10% с праймерами, специфичными для индикации энтеротоксина Е S. aureus. У изолятов S. intermedius, S. delphini и S. schleiferi ssp. coagulans гены энтеротоксинов С и Е не обнаружены. Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена sec у исследуемых нами изолятов S. pseudintermedius позволило установить, что все изоляты продуцировали энтеротоксин С подтипа canine. Таким образом, 6,4% изолятов S. pseudintermedius содержали гены, кодирующие специфический энтеротоксин S. intermedius и SECcanme- Еены sea, seb, sed и tsst-1 не были обнаружены ни у одного из изолятов, исследуемой коллекции. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей различных подтипов энтеротоксина С S. aureus при использовании программы ClustalW2 [159] выявил высокую степень гомологии (96-99%) подтипа canine с другими вариантами SEC.

Таким образом, гены токсинов se-int, siet, lukS и lukF были выявлены почти у всех исследованных изолятов S. pseudintermedius, независимо от вида животных, локализации и проявления инфекционного процесса, что свидетельствует о высоком патогенном потенциале S. pseudintermedius. Четыре изолята S. schleiferi ssp. coagulans содержали гены токсина siet, из них два изолята - lukS и lukF. У изолятов S. delphini выявили наличие только генов lukS и siet. У изолята S. intermedius был обнаружен ген, кодирующий эксфолиативный токсин (Приложение 4).

Полученные результаты позволяют высказать гипотезу о возможности межвидовой передачи геномных островов между S. aureus и S. pseudintermedius. 3.6. Чувствительность SIG к антибактериальным средствам

Как видно из данных представленных на Рисунке 8, 117 (100%) культур были чувствительны к фузидиевой кислоте, 97,5±1,4% - ципрофлоксацину, 88±3% -гентамицину, 85±3,3% - хлорамфениколу. 25-26±4% изучаемых изолятов проявили устойчивость к эритромицину и клиндамицину и 18±3,5% -доксициклину. Мультирезистентными оказались 23±3,9% изолятов. Среди изучаемых изолятов SIG и S. schleiferi ssp. coagulans множественной устойчивостью к антибиотикам обладали культуры S. pseudintermedius, выделенные от больных животных, и 1 изолят S. delphini был устойчив к 4 антимикробным препаратам (Приложение 5).

Для выявления метициллин/оксациллин устойчивых изолятов фенотипическими методами исследовали 35 культур SIG, которые были устойчивы к двум и/или более антибиотикам. Среди них только 1 изолят из Германии оказался устойчивым к оксациллину при определении чувствительности диско-диффузионным методом. МІЖ оксациллина в отношении данного изолята составила 500 мкг/мл. Еще для 5 изолятов МІЖ оксациллина составила 0,5 мкг/мл. Все остальные изоляты были не способны к размножению на среде с содержанием 0,5 мкг/мл оксациллина и выше. Согласно критериям Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) [127], изоляты S. pseudintermedius, у которых МІЖ оксациллина при тестировании была 0,5 мкг/мл и выше, а при постановке диско-диффузионного метода зона задержки роста была 17 мм, мы рассматривали как резистентные к оксациллину. Таким образом, доля MRSP изолятов составила 5,5%.

Отобранные изоляты для определения чувствительности к метициллину/оксациллину фенотипическими методами были исследованы методом ПЦР на наличие гена тесА. 6 изолятов S. pseudintermedius, фенотипически устойчивые к оксациллину, образовывали ампликоны размером 286 н.п., что свидетельствовало о наличии у них тесА гена. 2 изолята содержали комплекс тес класса А, у которых был обнаружен SCCmec III типа. 4 других -комплекс тес класса В и несли в своем составе SCCmec IV с дополнительным комплексом рекомбиназ ccrl. Таким образом, на территории центрального округа Российской Федерации впервые идентифицированы метициллинустойчивые изоляты S. pseudintermedius.

Наличие одинакового набора факторов патогенности у подавляющего большинства изолятов позволяло предположить, что исследованные изоляты имеют близкое филогенетическое родство. Для определения гетерогенности коллекции изолятов S. pseudintermedius был исследован структурный полиморфизм вариабельного фрагмента гена протеина А. При амплификации гена spa ПЦР-продукт образовали только 17 изолятов S. pseudintermedius, из них 4 MRSP изолята. Согласно данным секвенирования были выявлены восемь spa профилей, 5 из которых в соответствии с классификацией Moodley А. с соавторами [116] относились к spa типам t02, ЮЗ, t05, t09, tl5. Были определены три новых, ранее не описанных профиля нуклеотидных повторов, названные нами newl, new2 и new3. Величина каждого повтора вариабельного участка spa соответствовала 30 н.п., в отличие от вариабельного участка spa гена S. aureus, размер повторов которого составляет 24 н.п. В соответствии с данными Таблицы 11, три изолята принадлежали к spa типу t02, один определен как ЮЗ, два изолята - Ю5, один - t09 и один - tl5. К spa типу newl были отнесены 7 изолятов, к spa типам new2 и 3 по одному изоляту S. pseudintermedius.

Обнаруженные spa типы Ю2, ЮЗ, Ю5, tl5, newl и new3 были близкородственными. Так, единичная нуклеотидная замена в седьмом кодоне последнего повтора отличает spa тип Ю2 от ЮЗ. Spa тип newl также отличается от t02 наличием синомной замены в 3 кодоне повтора гОЗ. Типы t02, t05, tl5 и new3 отличаются количеством повторов гОЗ в центральной области spa ген: Spa профиль Ю2 содержит три гОЗ повтора, Ю5 - 4 повтора, tl5 - 5 повторов и new3 -6 повторов гОЗ. Spa профиль типа Ю9 отличается от spa типа Ю2 наличием замен в 3 кодоне повтора гОЗ и в 7 и 10 ко донах повтора г02, а также дуплекацией этого повтора. Из 17 изолятов только 2 имели существенно отличающиеся профили повторов, в том числе референтный штамм S. pseudintermedius LMG 22219т и штамм, выделенный на территории Германии.

При изучении структурных различий тандемных повторов вариабельного фрагмента гена spa нам не удалось проанализировать штаммы внутри всей изучаемой популяции S. pseudintermedius, так как данный ген был обнаружен только у 15% изолятов. Полученные результаты позволяют предположить, что вариабельный фрагмент spa может иметь нуклеотидные замены в местах посадки праймеров, что не позволило амплифицировать необходимый участок гена. Однако возможна и другая альтернатива - отсутствие этого гена. В настоящее время в базе данных NCBI имеются полногеномные последовательности только двух штаммов S. pseudintermedius, однако spa аннотирован у одного из них.

Дифференциация стафилококков SIG генотипическими методами

С другой стороны, следует иметь в виду, что популяции микроорганизмов, циркулирующих в разных географических зонах, могут иметь отличия. Таким образом, возможно предположить, что у большинства изолятов S. pseudintermedius исследуемой нами популяции ген spa отсутствует. Поиск подходящих праймеров для амплификации вариабельного фрагмента гена spa у изолятов нашей коллекции является предметом дальнейших исследований.

Таким образом, гетерогенная популяция была разделена на несколько групп: Проведенные молекулярно-генетические исследования, позволили отнести MRSP к трём разным генетическим клонам. Клон spa типа Ю2, несущий SCCmec III, присутствующий в составе эпидемической линии MRSP, циркулирующей на территории ряда европейских стран. Клоны spa типов ЮЗ и Ю5, несущие SCCmec IV с дополнительным комплексом рекомбиназ ссг\. Данный мобильный генетический элемент (МГЭ) характерен для эпидемического штамма MRSA, превалирующего в стационарах РФ; а также клон, не содержащий spa, но с тем же МГЭ. Выявлена значительная гетерогенность популяции MSSP, как по содержанию и особенностям структуры вариабельного фрагмента гена spa, так и по наличию различных факторов патогенности. Среди MSSP выявлены изоляты, принадлежащие к spa типам t02, ЮЗ, t09, tl5, newl, new2 и пелуЗспособные быть эффективными реципиентами SCC/wec.

Следующим этапом нашей работы была разработка экспериментальных моделей локализованных и системных заболеваний. Для экспериментального заражения были выбраны изоляты S. pseudintermedius, которые обладали сходными фенотипическими признаками, но отличались набором генов патогенности. Установлено, что наиболее восприимчивыми к действию S. pseudintermedius оказались беспородные лабораторные белые мыши. Даже при подкожном введении возбудителя у некоторых особей возникал генерализованный инфекционный процесс, который заканчивался гибелью 40% животных. Изолят S. pseudintermedius, вызвавший гибель наибольшего количества мышей, кроме одного из определяющих факторов патогенности - гена, кодирующего протеин А, содержал ген энтеротоксина С S. aureus. Внутрибрюшинное введение возбудителя суточным цыплятам вызывало гибель 62% птиц. Наиболее патогенным для цыплят оказался изолят, содержавший специфические для SIG токсины. В отличии от мышей, наличие у изолятов S. pseudintermedius гена, кодирующего протеин А, не вызывало выраженного патогенного эффекта у цыплят, что объясняется неспособностью протеина А связывать IgY птиц, и, следовательно, препятствовать фагоцитозу [ПО]. Разработана модель септического артрита на 2-3 месячных цыплятах. Экспериментальная модель локализованной гнойной инфекции была воспроизведена на беспородных щенках 2-3 месячного возраста и 8-9 месячных кроликах, у которых подкожное и внутрикожное введение S. pseudintermedius вызывало развитие локальных абсцессов и признаков общей интоксикации организма.

Представители S. pseudintermedius, подобно MRSA ST 398, имеют широкий круг хозяев, способны вызывать заболевания у людей, контаминировать продукты животного происхождения, кроме того, способны приобретать гены устойчивости к антимикробным препаратам и детерминант патогенности, а отдельные клоны MRSP получили эпидемическое распространение на территории целого ряда европейских государств и стран Северной Америки. Таким образом, S. pseudintermedius может представлять опасность, как вновь формирующийся патоген животных и человека.

Адаптация стафилококков к специфичному хозяину определяется генетическими механизмами, которые недостаточно изучены. Важной характеристикой некоторых генетических линий S. aureus является их способность колонизировать и вызывать инфекционные заболевания у различных хозяев. Примером может служить метициллинустойчивый S. aureus ST398, который первоначально считался патогенным только для свиней, а в последующем оказался способным вызывать заболевания у других сельскохозяйственных животных и птиц, животных-компаньонов и человека. И наоборот, S. aureus ST5, клон, который изолировали первоначально только от человека, является основным патогеном у кур [60]. Эволюция этих вирулентных клонов, их успешная адаптация к новым хозяевам и широкое распространение иллюстрируют чрезвычайную важность адаптивных способностей успешных бактериальных патогенов.

Анализ филогенетических связей между представителями рода Staphylococcus показал принадлежность коагулазоположительных видов SIG и S. aureus к разным кластерам, тогда как S. epidermidis и S. aureus обнаружили более близкое филогенетическое родство [99]. Однако именно представители SIG и S. aureus обладают множеством общих свойств и способны обмениваться мобильными генетическими элементами. В настоящее время высока степень риска интенсивного распространения инфекций, вызванных S. pseudintermedius, в человеческом обществе из-за повсеместного распространения домашних животных и постоянной близости с ними человека. В промышленно развитых странах мелкие домашние животные давно стали неотъемлемой частью жизни многих семей, число животных растет пропорционально числу жителей городов. Традиционными и наиболее распространенными животными-компаньонами являются собаки и кошки. По данным социологического опроса 2014 г., 59% россиян являются владельцами домашних животных. При этом наиболее популярными животными являются беспородные и породистые кошки и собаки, их держат 43% и 29% российских семей соответственно. Количество животных-компаньонов в России постоянно увеличивается [3]. В современных социально-экологических условиях возможна дальнейшая эволюция возбудителя, в результате которой определенные эпидемические клоны S. pseudintermedius будут способны не только колонизировать и вызывать инфекционные болезни у человека, но и циркулировать в человеческой популяции, что, возможно, приведет к трансформации инфекции из зооноза в антропоноз. Следует иметь в виду, что в последние годы в клинических лабораториях чаще регистрируют случаи тяжелых гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных S. pseudintermedius, у людей с вторичными иммунодефицитами различного происхождения, число которых также неуклонно растет.