Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7-51
Глава І . Неокислитешюе дезаминирование ароматических аминокислот 7
Глава 2. Свойства l-фенилаланин-аммиак-лиазы Ю
Глава 3. Биологическая роль ь-фшилаланин-аммиак-лиазы у растений 24
Глава 4. Регуляция ь-фшилаланин-ашиак-лиазной активности у высших растений 33
Глава 5. Фенилаланш-ашлиак-лиаза дрожей 39
Глава б . Возможное применение l-фенилаланин-аммиак-лиазы 47
Заключение 51
Экспериментальная часть 52-119
Методика 52
Результаты 62-105
Глава I. Подбор пигментных дрожей, обладающих l-фенилаланин-аммиак-лиазной активностью ..62
Глава 2. Условия образования l-фенилаланин-аммиак- -лиазы дрошами sporobolomyces salmoni- соьшштамм 2557 73
Глава 3. Локализация l-фенилаланин-ашиак-лиазы в клетках дрожжей sporobolomyces salmoiti-color штамм 2557 90
Глава 4. Некоторые свойства l-ішилаланин-аммиак-лиазы свободных и иммобилизованных клеток дрожжей sporobolomyces salmonicolor штамм 2557 92
Обсуждение результатов 106
Выводы 118
Список литературы
- . Неокислитешюе дезаминирование ароматических аминокислот
- . Возможное применение l-фенилаланин-аммиак-лиазы
- Подбор пигментных дрожей, обладающих l-фенилаланин-аммиак-лиазной активностью
- Локализация l-фенилаланин-ашиак-лиазы в клетках дрожжей sporobolomyces salmoiti-color штамм 2557
Введение к работе
Ферментная активность микроорганизмов используется в практической деятельности человека с давних времен. В нашей стране и за рубежом микробные ферменты применяются в различных областях народного хозяйства: в промышленности, в сельском хозяйстве, в медицине.
Микроорганизмы в качестве источников ферментов имеют ряд преимуществ по сравнению с растениями и животными. Использование микроорганизмов дешевле, кроме того, микроорганизмы обладают ферментами, отсутствующими у других организмов.
В промышленности и медицине в последнее время используются иммобилизованные ферменты микроорганизмов. Однако помимо иммобилизации очищенных ферментов, эффективным является способ иммобилизации целых клеток микроорганизмов. В этом случае используемый фермент более стабилен, так как он защищен веществами клетки.
Широкое применение ферментов в различных областях народного хозяйства делает актуальным поиски новых продуцентов среди микроорганизмов и установление условий максимального проявления ферментативной активности.
Одним из ферментов, который может найти применение в медицине для лечения фенилкетонурии, подавления роста злокачественных клеток является ь-фенилаланин-аммиак-лиаза.
Цель настоящей работы состояла в нахождении активного продуцента Ъ-фенилаланин-аммиак-лиазы среди пигментных дрожжей и подборе оптимальных условий для проявления активности фермента. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:
изучить распространение L-фенилаланин-аммиак-лиазы у пигментных дрожжей;
подобрать синтетические среды для культивирования наиболее активного продуцента L-фенилаланин-аммиак-лиазы;
получить иммобилизованные препараты клеток активного продуцента L-фенилаланин-аммиак-лиазы;
изучить свойства L-фенилаланин-аммиак-лиазы в свободных и иммобилизованных клетках дрожжей.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Из обследованных 116 штаммов пигментных дрожжей, принадлежащих к различным родам и видам, выявлено 54 продуцента L-фенилаланин-аммиак-лиазы. Найдены виды дрожжей с высокой L-фенилаланин-аммиак-лиазной активностью, о которых в литературе ранее не упоминалось: Rhodotorula pilimanae, Sporobolomy-ces holsaticus, Sporobolomyces odorus, Sporobolomyces salmonicolor . Показано, что при разрушении клеток Sporobolomyces salmonicolor штамм 2557 L-фенилаланин-аммиак-лиаза обнаруживается в их растворимой фракции. Впервые получены, препараты иммобилизованньк в полиакриламидном геле клеток S.salmonicolor 2557, обладающих L-фенилаланин-аммиак-лиазной - и L-тирозин--аммиак-лиазной активностью. Условия проявления L-фенилаланин-аммиак-лиазной активности у свободных и иммобилизованных клеток S.salmonicolor 2557 практически одинаковы. Иммобилизованные клетки S.salmonicolor 2557 разрушают L-фенилаланин так же интенсивно, как и свободные клетки. Стабильность ь-фе-нилаланин-аммиак-лиазы ишлобилизованньк клеток S.salmonicolor 2557 выше, чем свободньк.
ГРАФИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ
Найденные дрожжи S.salmonicolor 2557 по L-фенилаланин--аммиак-лиазной активности в 1,5-2,0 раза превосходят Rhodo-torula texensis , с которьши работали зарубежные исследователи (Kawaquchi et al., 1971). Подобранные условия культивирования S.salmonicolor 2557, а также способ иммобилизации их клеток позволяют получить препараты с высокой Ь-фенилаланин-аммиак--лиазной активностью, которая сохраняется в течение длительного времени (более 8 месяцев). Полученные результаты могли бы использоваться в медицине.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ (государственный регистрационный номер 0I8II004030) и включена в координационный план АН СССР (шифр координационного плана АН СССР 2-28-9-5 б).
. Неокислитешюе дезаминирование ароматических аминокислот
Этот фермент был назван автором тиразой. Теперь его называют L-тирозин-аммиак-лиазой (сокращенно ТАЛ; К.Ф.4.3.1). После открытия аммиак-лиаз ароматических аминокислот было проведено изучение таксономического распределения ФАЛ и ТАЛ. Эти ферменты широко распространены у высших растений, где они участвуют в синтезе фенолов и лигнина. ФАЛ-и-ТАЛ-активности найдены в водорослях (Loffelhardt et al., 1973), в аскомицетах (Vance, 1975) и в 12 видах бази-диомицетов, разрушающих древесину (Power et al. , 1965).Среди микроорганизмов МЛ-и-ТАЛ-активности обнаружены у некоторых штаммов красных дрожжей Rhodotorula , Rhodosporidiumn Sporo-bolomyces (Ogata et al. , 1967a; Gilbert , Tully, 1982; Moore et al., 1968; Camm , Towers , 1969; Sawada et al. , 1973) и у двух представителей актиномицетов - продуцентов митомицина (Ernes , Vining , 1970; Neraec, Zelinka , 1981). У бактерий аммиак-лиазы ароматических аминокислот не обнаружены (Hirai, 1921; Ogata et al. , 1967; Agrawal , Mahadevan, 1981). Некоторые бактерии способны использовать L-фенилаланин в качестве единственного источника азота (Escherichia coli, Plavobacterium arborescens » Corynebacterium pseudodiphthericum, Pseudomonas polycolor ) или в качестве единственного источника углерода и азота (Aerobacter aerogenes , Alcaligenes faecalis, Achromobacter polymorph , Micrococcus urea , Sarcina lutea t Pseudomonas fluorescens). Однако в этом случае разложение L -фенилаланина идет по другому пути через образование фенилпи-рувата, а не транс-коричной кислоты (Ogata et al. , 1967а).
У растений наиболее высокий уровень ФАЛ обнаружен в папоротнике Pteridium aguilinum Наибольшая активность ТАЛ найдена у злаковых, что соответствует их способности превращать ь-ти-розин в лигнин в отличие от двудольных растений (Koukol» Conn » Постоянное соотношение активностей ФАЛ и ТАЛ найдено при очистке ФАЛ из кукурузы, обе активности уменьшались с одинаковой скоростью в присутствии боргидрида натрия ( Havir et al., 1971). Напротив, при выделении и очистке ФАЛ из пшеницы (Young , Ueish , 1966) и ячменя (Kindl , 1970) ТАЛ - активность уменьшается, в то время как ФАЛ - активность сохраняет свое первоначальное значение. Предполагают, что в этом случае за дезамини-рование L-фенилаланина и L-тирозина ответствены два различных фермента. Сравнение ФАЛ-и-ТАЛ - активностей у некоторых базидиомице-тов показало, что активность ФАЛ преобладает во всех случаях (Bandoni et al., 1968). Свойства фермента из Ustilago hor-dei оказались близки свойствам фермента из высших растений. Однако полученный препарат ФАЛ совершенно не дезаминировал L -тирозин (Subba Rao et al., 1967). У Rhodotorula glutinis и Sporobolomyces pararoseus, в отличие от базидиомицетов и некоторых высших растений, один и тот же фермент, по-видимому, ответственен за дезаминирование как L-фенилаланина, так и L-тирозина (Ogata et ai.,I967b ; Parkhurst , Hodgins , 1971). Ay Sporobolomyces roseus за дезаминирование этих аминокислот, вероятно, отвечают два разных фермента (Camm, Towers, 1969).
Таким образом, ФАЛ-и-ТАЛ - активности обнаружены в основном у эукариот. Исследованные прокариотные организмы - бактерии не проявляют ни ФАЛ-ни-ТАЛ- активности. Свойства L-Фшилалмш-Ашиак-Лиазы ФАЛ вьщелена и очищена до гомогенного состояния из различных организмов. Свойства высокоочищенных препаратов ФАЛ подробно изучены. ФАЛ, вьщеленная из клубней картофеля, семядолей горчицы, дрожжей и патогенного гриба Rhizoctonia solani, имеет молекулярную массу от 24000Д до 330000Д и константу седиментации 11,3-11,93 S (Havir, Hanson, 1968а; Gupta, Acton, 1979; Hod-gins , 1971; Kalghatgi, Subba Rao, 1975). Молекулярная масса ФАЛ из Streptomyces verticillatus несколько ниже - 226000Д, а ее константа седиментации - IOS (Ernes, Vining, 1970). Установлено, что ФАЛ из картофеля, кукурузы и Rhodotorula glutinis состоит из четырех одинаковых субъединиц с молекулярной массой 80000-83000Д (Havir, Hanson, 1968а; Tanaka, Uritani, 1977), а ФАЛ из горчицы имеет субъединицы с молекулярной массой 55000Д (Gupta, Acton, 1979). ФАЛ, вьщеленная из Rhizoctonia solani , имеет такую же молекулярную массу, что и фермент из клубней картофеля (330000), но состоит из неидентичных субъединиц с молекулярной массой 70000 и 90000Д (Kalghatgi, Subba Rao, 1975). Конформация ФАЛ, выделенной из разных источников, более или менее асферична (Havir , Hanson, 1968а; Ernes, Vining,1970). В экстракте ацетонового порошка, приготовленного из освещенных тканей клубней картофеля, содержится два вида ФАЛ, на долю одного из них приходится лишь I0J5 от общей активности фермента (Havir, Hanson , 1968а). Эти две формы ФАЛ проявляют различную чувствительность к фенольным ингибиторам (Minamikawa , 1965). В проростках калужницы ФАЛ существует в двух формах, - II которые осаждаются из экстракта при различных концентрациях сульфата аммония. ФАЛ-активность в препаратах бобовых сеянцев, выращенных на свету и в темноте, при осаждении сульфатом аммония обнаруживается в различных фракциях (Attridge, 1973). ФАЛ, выделенная из разных источников (стебли ячменя,клубни картофеля, дрожжи, Streptomyces verticillatus, Rhizoctonia solani ), была активна в границе значений рН от 8,0 до 10,6 (Koukol, Conn, 1961; Havir , Hanson,1968b; Ogata et al.,I967 b; Ernes, Vining, 1970; Kalghatgi, Subba Rao , 1975). Оптимальные значения рН лежат в пределах от 8,5 до 9,2. Наибольшая активность ФАЛ наблюдается при 44-46С (Kalghatgi, Subba Rao, 1975). Действие препаратов фермента, полученных из различных источников, значительно отличается по кинетике реакции. Изучение зависимости первоначальной скорости реакции от концентрации субстрата показало значительное отклонение от кинетики Михаэ-лиса-Ментен для ФАЛ, выделенной из клубней картофеля, стебля ячменя , Rhizoctonia solani.
. Возможное применение l-фенилаланин-аммиак-лиазы
ФАЛ может иметь большое практическое применение в медицине для количественного определения L-фенилаланина в крови,для подавления роста раковых клеток - неоплазм, при лечении фенил-кетонурии.
Количественное определение Ъ-фенилаланина в плазме и сыворотке крови больного проводят с помощью ФАЛ, выделенной из дрожжей Rhodotorula glutinis (Shen , Abell , 1977). Количество аминокислоты определяют спектрофотометрически по изменению поглощения при 278 нм, что соответствует максимуму поглощения транс-коричной кислоты.
Подавление роста некоторых неоплазм у животных и человека наблюдается при удалении L-фенилаланина из пищевого рациона. Это обусловлено тем, что неоплазмы содержат больше данной аминокислоты, чем нормальные ткани. Однако при этом уровень L-фенилаланина в плазме крови уменьшается очень медленно. Применение ФАЛ из Rhodotorula glutinis подавляет рост, деление и жизнеспособность муриновых и лейкомных лимфоцитов у животных и не оказывает влияния на нормальные неделящиеся лимфоциты. Очищенный препарат ФАЛ в крови мышей вызывает гибель 80% злокачественных клеток (Abell et al., 1973). Такое действие ФАЛ оказывает, создавая в делящихся злокачественных клетках дефицит незаменимой аминокислоты - L-фенилаланина (Abell et al. , 1972; Stith et al., 1973).
Классическая фенилкетонурия вызывается нарушением в функционировании гидроксилазы фенилаланина - фермента, превращающего L-фенилаланин в L-тирозин. Это заболевание характеризуется избытком L-фенилаланина в крови и спинномозговой жидкости. Болезнь вызывает существенные необратимые нейропсихические расстройства. Использование гидроксилазы фенилаланина для лечения фенилкетонурии не имеет практического значения из-за трудностей, связанных с выделением и очисткой фермента из тканей млекопитающих. Психические расстройства, сопровождающие заболевание, предотвращаются, если больным давать пищу с пониженным содержанием L-фенилаланина. С этой целью применяют аминокислотные смеси, лишенные L-фенилаланина. Для их приготовления может использоваться ШАЛ. Показано, что ацетоновые препараты клеток Rhodotorula texensis , активные по ФАЛ, разрушают L-фе-нилаланин в гидролизатах сыра и яиц (Kawaquchi et al., 1971). Однако даже при использовании обедненной пищи у больных фенил-кетонурией содержание L-фенилаланина увеличивается при инфекционных заболеваниях. Поэтому вызывает большой интерес способность ФАЛ in vivo в крови разрушать L-фенилаланин до транс--коричной кислоты, которая может через почки выводиться из организма (Gimenez et al., 1977).
Это может использоваться не только при лечении фенилкетонурии, но и для подавления роста неоплазм (V/ieder et al. , 1979; Marconi et al., 1980). Однако очищенная ФАЛ, введенная в кровь животного вызывает тяжелые иммунологические реакции, и, кроме того, содержание в крови фермента быстро уменьшается. Эти негативные моменты могут быть преодолены при иммобилизации фермента. ФАЛ, выделенная из Rhodotorula glutinis и связанная с ме-токсиполиэтиленгликолем в крови мышей и кроликов, оказывает более слабое антигенное действие и обладает большей стабиль ностью по сравнению со свободным ферментом (Wieder et al. , 1979). Иммобилизованные ферменты в крови разрушаются медленно, что делает возможным их многократное использование. Иммунологические реакции против иммобилизованных антигенов минимальны. Рад работ посвящен подбору носителей для ФАЛ, так как многие биополимеры оказывают токсическое действие на организм. ФАЛ из Rhodotorula glutinis адсорбировали в стенки аеси-метричных полых волокон или же ковалентно связывали с внутренней стенкой пористых нейлоновых трубок (Pedersen et al.,I978). Фермент в полых волокнах обладает более высокой активностью, чем в нейлоновых трубках. Это объясняется тем, что в первом случае с носителем связывается гораздо больше активного фермента, чем во втором. МЛ, иммобилизованная в полые волокна, имеет такое же значение константы Михаэлиса-Ментен, что и фермент в свободном состоянии (Km = 5,0»10 М). Авторы создали реактор, состоящий из полых волокон с иммобилизованной ФАЛ, для изучения деградации L-фенилаланина в крови in vivo и in vitro (Amb-rus et al., 1978). Реактор вводили собакам между бедренной артерией и веной. За 2 часа 50% циркулирующего в крови собак L-фенилаланина было разрушено и этот уровень поддерживался 2 дня. Хорошим носителем для ФАЛ служат также волокна триацетата целлюлозы (Marconi et al., 1980). Фермент, выделенный из Rhodotorula rubra и связанный с волокнами триацетата целлюлозы, в крови животных (рН=7,5) проявляют 68% своей максимальной активности и сохраняют ее более 50 дней. Таким образом, опыты in vivo и in vitro на животных пока - 50 зали, что содержание L-фенилаланина в крови может быть сокращено при использовании иммобилизованной АЛ. Эффективными носителями фермента являются ассиметричные полые волокна и триацетат целлюлозы. Никаких побочных явлений, связанных с использованием этих веществ, в организме животных не наблюдается. Дальнейшие исследования в этой области должны прояснить перспективы применения иммобилизованной ФАЛ в медицине.
Подбор пигментных дрожей, обладающих l-фенилаланин-аммиак-лиазной активностью
Изучение данных, представленных в литературе, показало, что L-фенилаланин-аммиак-лиаза обнаружена только у пигментных дрожжей. Бесцветные дрожжи не содержат этого фермента. Поэтому при поиске культур, обладающих L-фенилаланин-аммиак-лиазой, нами было проверенно 116 штаммов пигментных дрожжей из коллекции кафедры биологии почв МГУ. Дрожжи имели окраску колоний от коричневой до желто-оранжевой и розово-красной. При идентификации на кафедре биологии почв МГУ они были отнесены к следующим родам: Cryptococcus (Kutz) Phaff et Spencer , Phaffia Miller et al.f Rhodosporidium Banno, Rhodotorula Harrison f Sporobolomyces Kluyver et van Neil , Tilletiopsis Derx.
He все проверенные культуры дрожжей обладали L-фенилала-нин-аммиак-лиазной активностью (табл. I). L-Фенилаланин-аммиак-лиаза обнаружена у 54 штаммов пигментных дрожжей. Наибольшее количество активных культур было среди представителей родов Sporobolomyces и Rhodotorula (табл. 2). Таблица 2 (сводная) Проявление L-фенилаланин-аммиак-лиазной активности у пигментных дрожжей при выращивании их на сусле Дрожжи Количество проверенных штаммов Из них обладают МЛ-актив-ностью Транс-коричная к-та, мг/л, за 20 часов при биомассе 10 мг/мл Из данных таблиц I и 2 видно, что в пределах одного рода встречались неактивные и малоактивные виды, а также вцды с высокой активностью фермента. Среди семи видов, относящихся к роду Rhodotorula , четыре вида (Rh. rubra, Eh. aurantiaca, Rh. lactoea , Rh. minuta ) или совсем не обнаруживали L-фенилаланин-аммиак-лиазную активность, или были малоактивными. Все проверенные штаммы двух других видов ( Rh. pallida, Rh. pili-manae ) проявляли значительную L-фенилаланин-аммиак-лиазную активность. Среди представителей гетерогенного вида Rh. glutinis встречались штаммы неактивные или малоактивные, а также штаммы с высокой L-фенилаланин-аммиак-лиазной активностью. Все проверенные штаммы Cryptococcus macerans , Phaffia rhodozyma , Rhodosporidium capitatum и Tilletiopsis washingtonensis были лишены L-фенилаланин-аммиак-лиазной активности. штаммов дрожжей, отмеченных в таблице I звездочками и представленные для наглядности в таблице 3, обладали наибольшей активностью фермента. Для этих культур проводили идентификацию продукта ферментативной реакции по его поглощению в ультрафиолетовой зоне спектра и хроматографическим методом. Спектры поглощения и значения Rf свидетеля-транс-коричной кислоты - и продукта реакции совпадали (максимальное поглощение обнаружено при 278 нм, значения Rf 0,72-0,76). Это позволило сделать вывод, что во всех случаях в результате реакции образовалась транс-коричная кислота.
Теоретически вычисленное количество транс-коричной кислоты, которое может образоваться из имеющегося в реакционной смеси L-фенилаланина, равно 360 мг/л. Из таблицы 3 видно, что 8 штаммов (Sporobolomyces holsaticus 2551, Sporobolomyces hol-saticus 0бь-65, Sporobolomyces pararoseus 2553, Sporobolomyces odorus 2646, Sporobolomyces salmonicolor 2556, Sporobolomyces salmonicolor 2557, Rhodotorula glutinis 4 И Rhodotorula giutinis Tp-I6I) за 20 часов превращали в транс-коричную кислоту более 2/3 L-фенилаланина. Остальные 18 штаммов образовывали меньше транс-коричной кислоты.
В целых неповрежденных клетках дрожжей активность L-фе-нилаланин-аммиак-лиазы не обнаружена. Зарубежные исследователи при работе с Ъ-фенилаланин-аммиак-лиазой обычно использовали ацетон. Нами в литературе не найдено данных об использовании других веществ с этой целью. В настоящей работе впервые показано, что активность L-фенилаланин-аммиак-лиазы проявляется также при обработке клеток дрожжей толуолом (табл. 4). Таблица 4 L-Фенилаланин-аммиак-лиазная активность в зависимости от условий обработки клеток Культура Транс-коричная к-та, мг/л, за 20 часов при биомассе 10 мг/мл с клетками j с ацето j } новыми без добавле-;с добавлени-jnpenapa-ния толуола !ем толуола ! тами Sporobolomyces salmonicolor 20 300 280 2557 Sporobolomyces odorus 2646 20 300 270 Толуол, добавленный в реакционную смесь в количестве 1-10%, увеличивает проницаемость клеток дрожжей и позволяет выявить L-фенилаланин-аммиак-лиазную активность. Дальнейшая работа проводилась с одним из наиболее активных по L-фенилаланин-аммиак-лиазе штаммов - Sporobolomyces salmonicolor 2557. Сведений в литературе по ФАЛ у этого вида дрожжей не найдено. Во всех опытах к суспензиям клеток дрожжей добавляли толуол.
Из данных таблицы 5 видно, что в присутствии исследуемых аминокислот (за исключением D-тирозина) ъ-фенилаланин-аммиак -лиазная активность дрожжей S.saimonicolor 2557 повышается на сусле в 2-2,5 раза, а на синтетической среде в 3 раза. D-Тиро-зин оказывает значительно более слабое влияние на активность фермента. Влияние D-фенилаланина на активность фермента не изучалось, так как это вещество достать не удалось. Таким образом, L- и DL-фенилаланин и L- и DL-тирозин оказывают индуцирующее действие на L-фенилаланин-аммиак-лиаз-ную активность S.saimonicolor 2557. В дальнейших опытах использовали культуры дрожжей, выращенные на средах с индукторами в виде DL-фенилаланина или L-тирозина. Максимальная L-фенилаланин-аммиак-лиазная активность обнаружена в стационарной фазе роста культуры дрожжей. Клетки из молодых культур S.saimonicolor 2557 проявляют незначительную L-фенилаланин-аммиак-лиазную активность (рис. 3). S.saimonicolor 2557 растут на сусле при начальных значениях рН от 3,0 до 8,0 (рис. 4). Максимальный рост дрожжей наблюдается при начальном рН=6,5-7,0. Наибольшее количество транс--коричной кислоты обнаружено на сусле с начальньм рН от 5,0 до 7,0. Развитие S.saimonicolor 2557 на сусле с начальным значением рН 3,0-4,0 вызывает подкисление среды. При росте дрожжей на сусле с начальньм рН 5,0-7,0 значения рН сначала уменьшаются, но как только достигается стационарная фаза роста,значения рН возрастают.
Локализация l-фенилаланин-ашиак-лиазы в клетках дрожжей sporobolomyces salmoiti-color штамм 2557
Данные, представленные в литературе, и полученные нами результаты показывают, что L-фенилаланин-аммиак-лиазная активность в дрожжах обнаруживается только при разрушении клеток или при обработке их веществами, увеличивающими клеточную проницаемость. Сведений о распределении L-фенилаланин-аммиак-лиазы в клетках дрожжей не найдено. Нами проводилось изучение локализации фермента в дрожжах S.salmonicolor 2557. Клетки S.salmonicolor 2557, обработанные толуолом или ацетоном, после двукратного промывания в трис-HCI буфере(рН=8,8) сохраняют первоначальный уровень L-фенилаланин-аммиак-лиазной активности (табл. 12). Это позволяет предположить, что L-фенилаланин-аммиак-лиаза у s.saimonicolor 2557 - фермент внутриклеточный. Ацетон и толуол увеличивают клеточную проницаемость для Ь-фенилаланина. Более детальное изучение распределения L-фенилаланин-аммиак-лиазной активности проводили после трехкратного разрушения клеток на Френч-прессе. Крупные частицы отделяли, промывали трис-HCI буфером (рН=8,8) и ультрацентрифугировали при I50000g в течение 2 часов (2 раза). В полученной мембранной фракции было обнаружено 4,5% L-фенилаланин-аммиак-лиазной активности, а в растворимой фракции - 95,5% активности фермента (табл. 13). Полученные результаты позволяют предположить, что в клетках дрожжей S.saimonicolor 2557 L-фенилаланин-аммиак-лиаза находится в растворимой фракции, так же как у большинства растений (Ruis , Kindl , 1971; Amrhein , Zenk , 1971). Лишь незначительная часть КЛЕТОК ДРОЖЕЙ SPOROBOLOMYCES SALMO NICOLOR ШТАММ 2557 Нами показано, что дрожжи S.Salmonicolor 2557 обладают не только L-фенилаланин-аммиак-лиазной активностью, но и высокой L-тирозин-аммиак-лиазной активностью. Они осуществляют неокислительное дезаминирование L-тирозина с образованием пара-кума-ровой кислоты. Идентификацию продукта реакции проводили хрома-тографическим и спектрофотометрическим методами. Спектры поглощения в ультрафиолетовой зоне образующегося вещества и его значения при хроматографии совпадали с характеристиками свидетеля- пара-кумаровой кислоты (максимальное поглощение обнаружено при 308 нм, Rf=0,65-0,67). Это позволило заключить, что в результате реакции из L-тирозина образуется пара-кумаровая кислота.
L-Тирозин-аммиак-лиазная активность, так же как L-фенил-аланин-аммиак-лиазная активность, проявляется в клетках дрожжей только в присутствии веществ, увеличивающих проницаемость клеточной стенки (табл. 14). Максимальная L-тирозин-аммиак-лиазная активность, так же как L-фенилаланин-аммиак-лиазная активность, обнаружена в стационарной фазе роста культуры S.salmonicolor 2557 (рис. 3). Свойства L-фенилаланин-аммиак-лиазы изучали не только в свободных,но и в иммобилизованных клетках дрожжей S.salmonicolor 2557. Иммобилизованные препараты клеток имеют ряд преимуществ: они сохраняют ферментативную активность в течение длительного времени и могут использоваться многократно. Нами были подобраны условия иммобилизации дрожжей S.salmonicolor 2557 в полиакриламидном геле и получены препараты иммобилизованных клеток, которые обнаруживают L-фе-нилаланин-аммиак-лиазную и L-тирозин-аммиак-лиазную активность такую же, как свободные клетки (табл. 15). Таблица 15 L-Фенилаланин-аммиак-лиазная и Ь-тирозин-аммиак-лиазная активности свободных и иммобилизованных клеток s.salmonicolor 2557, выращенных на сусле и на подобранной синтетической среде Из данных таблицы 15 видно, что клетки S.saimonicolor 2557, выращенные на сусле и на подобранной синтетической среде, проявляют одинаковую удельную активность как ь-фенилаланин-ам-миак-лиазы, так и L-тирозин-аммиак-лиазы. Высокая L-фенилаланин-аммиак-лиазная активность свободных клеток S.saimonicolor 2557 сохраняется при нагревании реакционных смесей вплоть до 60С, а иммобилизованных препаратов -- до 65С (нагревание в0,05 М трис-HCI буфере, рН=8,5). Дальнейшее увеличение температуры приводит к падению ь-фенилаланин -аммиак-лиазной активности (рис. 8). Полная инактивация фермента обнаружена при 75С как у свободных, так и у иммобилизованных клеток S.saimonicolor 2557. Иммобилизованные клетки s.saimonicolor 2557 в течение длительного времени сохраняют более высокую L-фенилаланин-ам-миак-лиазную активность, чем свободные клетки. За 8 месяцев хранения при +4 или +бС в 0,15 М трис-НСІ буфере (рН=8,8) свободные клетки теряют 50% L-фенилаланин-аммиак-лиазной активности, тогда как препараты иммобилизованных клеток сохраняют первоначальный уровень активности фермента. В ацетоновых препаратах L-фенилаланин-аммиак-лиазная активность быстро утрачивается и через 4 месяца практически отсутствует (табл. 16). L-Фенилаланин-аммиак-лиазная активность S.saimonicolor 2557 зависит от концентрации клеток в реакционной смеси. Наибольшая активность фермента обнаружена при содержании белка от 3,0 мг/мл и выше в случае иммобилизованных клеток и от 7,0 мг/мл и выше в случае свободных клеток (рис. 9