Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Классификация и разнообразие бактерий, растущих при различной концентрации кислорода 6
1.1. Разнообразие,грибов, растущих при различной концентрации. кислорода 9
Глава 2. Энергетический метаболизм грибов и бактерий в анаэробных условиях 16
2.1. Энергетика анаэробного роста прокариот 16
2.2. Брожение - анаэробный энергетический метаболизм у грибов 18
2.2.1. Брожение у дрожжевых и мицелиальных грибов 18
2.2.2. Биохимия брожения у хитридиомицетов 22
2.3. Диссимиляторное восстановление нитратов и нитритов у грибов 23
2.4. Выделение закиси азота грибами в условиях гипоксии 26
Глава 3. Особенности роста дрожжевых и мицелиальных грибов в анаэробных условиях 29
3.1. Влияние содержания диоксида углерода в атмосфере на рост грибов 30
3.2. Влияние состава культуральной среды на рост грибов в анаэробных условиях 35
Глава 4. Анаэробиоз в почвах и возможность развития в этих условиях грибов 36
Глава 5. Объекты и методы 44
5.1. Объекты исследования 44
5.2. Методы исследования 49
5.2.1. Определение биомассы мицелия грибов в почвах 49
5.2.2. Выделение чистых культур грибов в анаэробных условиях и определение численности их колониеобразующих единиц в почвах 50
5.2.3. Выделение микроскопических грибов в полевых условиях 55
5.2.4. Определение радиальной скорости роста грибов в аэробных и анаэробных условиях 55
5.2.5. Определение биомассы гриба Fusarium oxysporum lldnl при
росте на жидкой среде в аэробных и анаэробных условиях 56
5.2.6. Идентификация культур грибов 56
5.2.7. Изучение культурально-морфологических особенностей роста грибов в анаэробных условиях на агаровых средах 58
5.2.8. Электронная микроскопия клеток Fusarium oxysporum 11 dnl 59
5.2.9. Определение активности спиртового брожения у грибов 60
5.2.10. Определение активности выделения закиси азота факультативно-анаэробными грибами на питательных средах и в стерильной почве 61
Глава 6. Результаты и обсуждение 66
6.1. Влияние восстановительного режима в почвах на биомассу и численность грибов 66
6.2. Численность колоний микроскопических грибов, выделяемых в анаэробных условиях из почв 69
6.3. Видовое разнообразие факультативно-анаэробных микроскопических грибов в почвах 71
6.4. Способность к спиртовому брожению у факультативно-анаэробных мицелиальных грибов 81
6.5. Радиальная скорость роста и накопление биомассы грибами в анаэробных условиях 83
6.6. Культурально-морфологические особенности роста грибов в анаэробных условиях 86
6.7. Выделение закиси азота факультативно-анаэробными грибами 99
Заключение 107
Выводы 113
Список литературы 115
- Разнообразие,грибов, растущих при различной концентрации. кислорода
- Брожение у дрожжевых и мицелиальных грибов
- Влияние содержания диоксида углерода в атмосфере на рост грибов
- Выделение чистых культур грибов в анаэробных условиях и определение численности их колониеобразующих единиц в почвах
Введение к работе
Для почвы, как среды обитания микроорганизмов, характерно наличие множества местообитаний, различных по своим свойствам (по содержанию газов в почвенном воздухе, элементов питания, воды). Среди них значительную часть составляют отдельные микрозоны, агрегаты (> 5^ мм), или целые горизонты, где часто возникают восстановительные условия, а в болотных и пойменных почвах они могут преобладать в течение продолжительных периодов времени (Орлов, 1987).
Традиционно считается, что бактерии единственные организмы, функционирующие в условиях лимитированного обеспечения кислородом в почвах. Облигатно-анаэробные грибы представлены группой хитридиомицетов (виды родов Caecomyces, Piromyces, Neocalimastix, Anaeromyces, Orpinomyces), которые обитают в рубце жвачных животных. (Trinci et al., 1994). В то же время известно, что существуют не только дрожжевые, но и мицелиальные микроскопические грибы способные к брожению, что позволяет им быть активными при ограниченном поступлении или отсутствии кислорода и наличии легкодоступных Сахаров» (Bartnicki-Garsia Nickerson, 1961; Tabak, Cooke, 1968; Curtis, 1969; Gunner, Alexander 1964; Лаврентьев, Кураков, 2004).
Грибы доминируют по биомассе во многих почвах и поэтому неизбежно попадают в ситуации, характеризующиеся пониженным парциальным давлением кислорода или анаэробными условиями. Мицелиальные микромицеты рассматривали в большинстве случаев как аэробные организмы, поэтому информация о видовом разнообразии факультативно-анаэробных грибов, их обилии и особенностях состава в почвах разных типов крайне ограничена. Существует всего* несколько сообщений о выделении микроскопических грибов (Fusarium solani, Trichoderma harzianum) из почв, торфа и органических материалов при
анаэробных условиях (Marchant et al., 1994; Wainwright et al., 1994; Сизова и др., 1998).
Недостаточно сведений имеется о морфологии грибов при росте в анаэробных условиях, причем описание их развития дано, как правило, для условий жидкой культуры (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1961; Tabak, Cooke, 1968; Curtis, 1969; Marchant et al., 1994). Крайне ограничена информация о характере роста факультативно-анаэробных микромицетов на твердой среде, которая более адекватна условиям почвы.
В последнее десятилетие установлено, что существуют грибы, которые в условиях лимитированного обеспечения кислородом, способны к образованию закиси азота (Shoun et al., 1992, Кураков и др., 1997; Пахненко и др., 1999). В связи с этим, актуальным представлялось изучить возможность выделения закиси азота различными видами факультативно-анаэробных грибов, определить удельную активность этого процесса непосредственно в почве.
Целью работы было определение разнообразия факультативно-анаэробных мицелиальных микроскопических грибов в почвах, особенностей их роста и активности образования закиси азота.
В задачи исследования входило:
Оценка количества жизнеспособного грибного мицелия в почвах с длительным восстановительным режимом.
Определение численности колониеобразующих единиц и разнообразия микроскопических грибов, выделяемых в анаэробных условиях, из почв разных типов.
Определение скорости роста и культурально-морфологических особенностей мицелиальных микроскопических грибов в анаэробных условиях на твердой среде.
Определение удельной активности образования закиси азота факультативно-анаэробными грибами в почве.
Научная новизна. Впервые проведена оценка разнообразия факультативно-анаэробных микроскопических грибов в почвах разных типов. Способность роста в анаэробных условиях впервые показана для представителей Trichoderma aureoviride, Т. atroviride, Т. viride, Т. polysponim, Umbelopsis (Могtierella) isabellina, Zygorhynchus heterogamies, Clonostachys rosea f. rosea, Sphaerostilbella aureonitens, Paecilomyces lilacinus, Humicola grisea, Tolypocladium inflatum, Acremonium strictum, Clonostachys grammicospora, Absidia glauca, Actinomucor elegans, Lecanicillium lecanii, Aspergillus terreas. Дана сравнительная оценка радиальной скорости роста грибов в аэробных и анаэробных условиях и охарактеризованы культурально-морфологические особенности и ультраструктура митохондрий у микромицетов при развитии на твердых средах в условиях анаэробиозиса. Показано,- что в почвах при длительном восстановительном режиме сохраняет жизнеспособность довольно значительная часть мицелия, грибов. Впервые установлена удельная активность образования закиси азота (в расчете на единицу биомассы) грибами при функционировании непосредственно» в почвенных условиях.
Практическая значимость. Разработаны приемы по выделению грибов из почв- и других местообитаний в анаэробных условиях. Создана коллекция факультативно-анаэробных микроскопических грибов, которая используется на кафедрах биологии почв и микробиологии МГУ в учебном процессе и для поиска природных изолятов с высокой активностью спиртового брожения. Определена удельная активность образования закиси* азота грибами в почве, что важно для расчетов баланса этого парникового газа в атмосфере.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Докучаевских молодежных чтениях «Почвы и, биоразнообразие» (Санкт-Петербург, 2001); Второй научной конференции «Актуальные вопросы биотехнологии» (Москва, 2001); 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI, века» (Пущино, 2002); 17th World-Congress of Soil Science (Thailand, Bangkok, 2002); Первом съезде медицинских микологов (Москва, 2003); XIV и XV Конгрессах Европейских Микологов (Кацивели, Украина, 2003 и Санкт-Петербург, 2007).
Разнообразие,грибов, растущих при различной концентрации. кислорода
Для почвы, как среды обитания микроорганизмов, характерно наличие множества местообитаний, различных по своим свойствам (по содержанию газов в почвенном воздухе, элементов питания, воды). Среди них значительную часть составляют отдельные микрозоны, агрегаты ( 5 мм), или целые горизонты, где часто возникают восстановительные условия, а в болотных и пойменных почвах они могут преобладать в течение продолжительных периодов времени (Орлов, 1987).
Традиционно считается, что бактерии единственные организмы, функционирующие в условиях лимитированного обеспечения кислородом в почвах. Облигатно-анаэробные грибы представлены группой хитридиомицетов (виды родов Caecomyces, Piromyces, Neocalimastix, Anaeromyces, Orpinomyces), которые обитают в рубце жвачных животных. (Trinci et al., 1994). В то же время известно, что существуют не только дрожжевые, но и мицелиальные микроскопические грибы способные к брожению, что позволяет им быть активными при ограниченном поступлении или отсутствии кислорода и наличии легкодоступных Сахаров» (Bartnicki-Garsia Nickerson, 1961; Tabak, Cooke, 1968; Curtis, 1969; Gunner, Alexander 1964; Лаврентьев, Кураков, 2004).
Грибы доминируют по биомассе во многих почвах и поэтому неизбежно попадают в ситуации, характеризующиеся пониженным парциальным давлением кислорода или анаэробными условиями. Мицелиальные микромицеты рассматривали в большинстве случаев как аэробные организмы, поэтому информация о видовом разнообразии факультативно-анаэробных грибов, их обилии и особенностях состава в почвах разных типов крайне ограничена. Существует всего несколько сообщений о выделении микроскопических грибов (Fusarium solani, Trichoderma harzianum) из почв, торфа и органических материалов при анаэробных условиях (Marchant et al., 1994; Wainwright et al., 1994; Сизова и др., 1998).
Недостаточно сведений имеется о морфологии грибов при росте в анаэробных условиях, причем описание их развития дано, как правило, для условий жидкой культуры (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1961; Tabak, Cooke, 1968; Curtis, 1969; Marchant et al., 1994). Крайне ограничена информация о характере роста факультативно-анаэробных микромицетов на твердой среде, которая более адекватна условиям почвы. В последнее десятилетие установлено, что существуют грибы, которые в условиях лимитированного обеспечения кислородом, способны к образованию закиси азота (Shoun et al., 1992, Кураков и др., 1997; Пахненко и др., 1999). В связи с этим, актуальным представлялось изучить возможность выделения закиси азота различными видами факультативно-анаэробных грибов, определить удельную активность этого процесса непосредственно в почве. Целью работы было определение разнообразия факультативно-анаэробных мицелиальных микроскопических грибов в почвах, особенностей их роста и активности образования закиси азота. В задачи исследования входило: 1. Оценка количества жизнеспособного грибного мицелия в почвах с длительным восстановительным режимом. 2. Определение численности колониеобразующих единиц и разнообразия микроскопических грибов, выделяемых в анаэробных условиях, из почв разных типов. 3. Определение скорости роста и культурально-морфологических особенностей мицелиальных микроскопических грибов в анаэробных условиях на твердой среде. 4. Определение удельной активности образования закиси азота факультативно-анаэробными грибами в почве. Научная новизна. Впервые проведена оценка разнообразия факультативно-анаэробных микроскопических грибов в почвах разных типов. Способность роста в анаэробных условиях впервые показана для представителей Trichoderma aureoviride, Т. atroviride, Т. viride, Т. polysponim, Umbelopsis (Могtierella) isabellina, Zygorhynchus heterogamies, Clonostachys rosea f. rosea, Sphaerostilbella aureonitens, Paecilomyces lilacinus, Humicola grisea, Tolypocladium inflatum, Acremonium strictum, Clonostachys grammicospora, Absidia glauca, Actinomucor elegans, Lecanicillium lecanii, Aspergillus terreas. Дана сравнительная оценка радиальной скорости роста грибов в аэробных и анаэробных условиях и охарактеризованы культурально-морфологические особенности и ультраструктура митохондрий у микромицетов при развитии на твердых средах в условиях анаэробиозиса. Показано,- что в почвах при длительном восстановительном режиме сохраняет жизнеспособность довольно значительная часть мицелия, грибов. Впервые установлена удельная активность образования закиси азота (в расчете на единицу биомассы) грибами при функционировании непосредственно» в почвенных условиях. Практическая значимость. Разработаны приемы по выделению грибов из почв- и других местообитаний в анаэробных условиях. Создана коллекция факультативно-анаэробных микроскопических грибов, которая используется на кафедрах биологии почв и микробиологии МГУ в учебном процессе и для поиска природных изолятов с высокой активностью спиртового брожения. Определена удельная активность образования закиси азота грибами в почве, что важно для расчетов баланса этого парникового газа в атмосфере.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Докучаевских молодежных чтениях «Почвы и, биоразнообразие» (Санкт-Петербург, 2001); Второй научной конференции «Актуальные вопросы биотехнологии» (Москва, 2001); 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI, века» (Пущино, 2002); 17th World-Congress of Soil Science (Thailand, Bangkok, 2002); Первом съезде медицинских микологов (Москва, 2003); XIV и XV Конгрессах Европейских Микологов (Кацивели, Украина, 2003 и Санкт-Петербург, 2007).
Брожение у дрожжевых и мицелиальных грибов
Способностью получать энергию путем анаэробного брожения обладают и эукариоты. Дрожжевые грибы, как и большинство других, в присутствии кислорода осуществляют аэробное дыхание. Без доступа воздуха они сбраживают углеводы до этанола и С02, т. е. осуществляют спиртовое брожение. Наиболее хорошо изучены в этом аспекте дрожжи Saccharomyces cerevisae. При росте в анаэробных условиях дрожжи превращают глюкозу в пировиноградную кислоту по гликолитическому пути. Чистый выход АТФ при спиртовом брожении составляет 2 моль АТФ на 1 моль глюкозы, что значительно меньше выхода АТФ при дыхании - 38 моль АТФ (Шлегель, 1983; Гусев, Минеева, 2004). При смене аэробных условий на анаэробные скорость превращения глюкозы возрастает в 3-4 раза. Переход от анаэробного метаболизма к аэробному сопровождается снижением скорости этого процесса, и образование спирта прекращается. Это явление носит название эффекта Пастера (Готтшалк, 1982).
Процесс гликолиза включает реакцию окисления фосфоглицеринового альдегида, в которой образуется восстановленный пиридиннуклеотид НАД-Н. В отсутствии кислорода НАД-Н окисляется до НАД1" при декарбоксилировании пирувата и превращении образовавшегося при этом ацетальдегида в этанол. Образовавшийся НАД может принимать участие в окислении следующей молекулы фосфоглицеринового альдегида (Бабьева, Чернов, 2004).
Разложение Сахаров до этилового спирта, важнейший в хозяйственном плане из известных процессов брожения, осуществляется не только дрожжами, но и многими другими организмами, в том числе мицелиальными микроскопическими грибами (Мюллер, Лёффлер, 1995).
Из 62 родов аскомицетных дрожжей представители 21 рода являются активными бродильщиками, а среди них есть виды, сбраживающие несколько Сахаров (глюкозу, сахарозу, галактозу, мальтозу, лактозу, раффинозу, трегалозу). У видов родов Hanseniaspora, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora - 100% штаммов способны к брожению. Среди дрожжей-базидиомицетов встречаются только слабые бродилыцики - представители родов Mrakia, Trichosporonoid.es, Xanthophyllomyces. Некоторые дрожжи способны, сбраживать легкодоступные полисахариды, состоящие из гексозных остатков. Например Kluyveromyces fragilis сбраживает инулин (полифруктозан), a Schwanniomyces occidentalis и Saccharomyces fibuliger активно сбраживают крахмал (Бабьева, Чернов, 2004).
Дрожжи в процессе брожения наряду с основными продуктами (этанол, С02) образуют множество других метаболитов, которые синтезируются как побочные соединения при катаболизме углеводов, обмене аминокислот. Хотя эти соединения обычно накапливаются в культуральной среде в очень незначительных количествах и трудно идентифицируются, они могут иметь большое практическое значение, например, для пищевой промышленности. Обязательные побочные продукты метаболизма дрожжей - высшие спирты (сивушные масла). Механизм синтеза высших спиртов связан с образованием алифатических аминокислот (валин, лейцин, изолейцин). Он включает удаление с аминокислот и их предшественников- аминогрупп (трансаминирование), образующаяся аминокислота декарбоксилируется и восстанавливается до спирта. Чаще всего встречаются спирты: пропиловый, изоамиловый, бутиловый, изобутиловый. Летучие жирные кислоты, такие как уксусная, пропионовая, масляная, изомасляная, изовалериановая - также обычные минорные продукты метаболизма дрожжей. Большое практическое значение имеют выделяемые дрожжами альдегиды и кетоны, особенно ацетоин и диацетил. Среди других побочных продуктов большое значение имеют также длинноцепочечные жирные кислоты, эфиры и меркаптаны (Бабьева, Чернов, 2004).
Итак, среди конечных продуктов брожения дрожжей в небольших количествах часто можно обнаружить разнообразные соединения, летучие жирные кислоты, высшие спирты, альдегиды, эфиры, меркаптаны.
Универсальным источником азота для дрожжей являются соли аммония. Ион аммония используется дрожжами, как в присутствии, так и отсутствии кислорода. В аэробных условиях дрожжи могут использовать различные источники азота - мочевину, амины, аминокислоты и нитраты (Бабьева, Чернов, 2004; Шлегель, 1983). В анаэробных условиях предпочтительным соединением является ион аммония. Дрожжи Candida utilis растут в аэробных и анаэробных условиях на средах как с аммонием, так и с нитратом (Фурина и др., 1997).
Одним из первых сообщений о возможности микроскопических грибов сбраживать сахар с образованием этанола и углекислого газа была работа Боргардта А.И. (Боргардт, 1911). Опыты с Penicillium glaucum, Aspergillus niger, Mucor piriformis показали способность этих организмов превращать сахарозу в анаэробных условиях в этанол и СОг. Было отмечено, что Mucor stolonifer, М. piriformis переходят к брожению только в»том случае, если до этого в аэробных условиях росли на сахаре, а не на крахмале.
При росте в аэробных условиях грибы способны утилизировать широкий спектр разнообразных органических соединений в качестве источника углерода и энергии (Suihko, 1983). В анаэробных условиях они используют в первую очередь легкодоступные моносахара. Так, Мисог гоихіі в анаэробных условиях рос на галактозе, фруктозе, маннозе, глюкозе, но не использовал ксилозу, мальтозу, глюкозамин, этанол, органические кислоты, глицерол, дисахара, крахмал. В аэробных условиях гриб утилизирует все эти соединения (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1962b).
Для некоторых грибов из отделов хитридиомикота и зигомикота сообщали о способности осуществлять молочнокислое брожение (Griffins, 1995).
Итак, биохимия брожения у мицелиальных грибов изучена намного слабее, чем у дрожжей, хотя в последние годы появляются такие исследования в связи с интересом к проблеме биоконверсии целлюлозных субстратов в этанол (Christakopoulus et al.,1989; Pushalkar, Rao, 1998).
Влияние содержания диоксида углерода в атмосфере на рост грибов
На развитие грибов существенное влияние оказывает содержание диоксида углерода в атмосфере (Stotzky, 1965). Обнаружено линейное понижение роста Alternaria tenuis, Fusarium roseum, Botrytis cinerea, Cladosporium herbarum, Rhizopus stolonifer при низком давлении 02 (ниже 4%) и повышенном С02. При полном отсутствии кислорода рос лишь Rhizopus stolonifer. Рост A. tenuis, В. cinerea, С. herbarum, R. stolonifer в атмосфере 10, 20, 30 и 45% СО2 + 21% 02 уменьшался линейно с увеличением концентрации С02 и ингибировался на 50% в атмосфере 20% С02. Рост F. roseum, однако, стимулировался при 10% С02 и ингибировался на 50% при 45% С02, когда концентрация кислорода была 2% и, таким образом, лимитировала рост. Диоксид углерода в небольших концентрациях стимулировал рост всех грибов, кроме Rhizopus, и прорастание спор всех грибов, за- исключением представителей рода Alternaria (Wells, Uota, 1970).
Высокое давление С02 вызывает резкие морфологические изменения у Mucor rowcii на твердых средах. Опыты проводились в атмосфере N2 и С02, контроль - воздушная атмосфера. При росте в атмосфере С02 М. rowcii образуют почкующиеся дрожжеподобные структуры, тогда как в культурах, инкубированных в атмосфере N2 развивается типичный, нитчатый мицелий (твердая среда с гидролизатом казеина). Культуры, выращенные в атмосфере С02 на среде с сульфатом аммония содержали-небольшую часть мицелия, а в атмосфере азота только малую долю сферических клеток. Показана важная роль витаминов для? анаэробного роста, так при совместном внесении одновременно тиамина и никотиновой кислоты прирост биомассы был на порядок выше, по сравнению с вариантами без добавок или при добавлении тиамина или никотиновой кислоты по отдельности (Bartnicki-Garsia; Nickerson; 1961).
При изучении влияния разных концентраций кислорода- и. углекислого газа на рост и морфологию Fusarium oxysporum и F. eumartii оказалось, что первый более устойчив к низким концентрациям кислорода. Fusarium oxysporum оставался жизнеспособным в течение 13 недель, тогда как F. eumartii только- в течение 21 суток анаэробиоза. Оба. организма устойчивы, к высоким концентрациям С02 и росли в атмосфере с содержанием С02 до 80%. Только один из 20 штаммов этих двух видов проявлял явную морфологическую реакцию на низкое давление кислорода (73 мм рт ст) в чистой культуре. Она заключалась в появлении сильно1 изогнутого, более часто ветвящегося мицелия с неравномерной толщиной гиф (Hollis, 1948; Toler et-al., 1966).
Диоксид углерода, находящийся, в- воздухе, стимулировал рост Aspergillus niger, A. flavus, Rhizopus nigricans, Penicillium chrysogenum. Стимулирующее действие С02 воздуха ясно проявляется на первых стадиях роста, на набухании и прорастании конидий. Степень стимулирования роста диоксидом углерода различна у разных грибов, у представителей родов Aspergillus и Penicillium выше, чем у Rhizopus (Баринова, 1953). Рост Mucor rouxii на питательной среде в атмосфере без кислорода, но с высоким содержанием диоксида углерода идет в дрожжеподобной форме, а в отсутствие С02 в виде мицелия (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1961).
Штаммы Rhizopus oryzae и трех других видов рода Rhizopus характеризовали более слабым ростом в атмосфере С02, чем М. rouxii. При этом они росли в виде мицелия, дрожжеподобных клеток не образовывали. Виды родов Zygorhynchus, Phycomyces, Mortierella, Cunninghamella, Sporodinia и Circinella не развивались в атмосфере С02 на жидкой среде с дрожжевым экстрактом, пептоном и глюкозой. С02 не всегда является необходимым фактором для дрожжеподобного роста у грибов. М. subtilissimus развивался в анаэробных условиях в форме дрожжеподобных клеток при полном отсутствии С02 (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1962а).
Диморфизм - превращение мицелиального типа роста в дрожжеподобный, и наоборот, - свойственен также видам Fusarium. Он отмечен при росте на средах с повышенным содержанием Сахаров, с органическими кислотами, при пониженной температуре и других условиях культивирования. При росте мицелия в таких условиях установлены изменения морфологии клеток - их размеров, структуры клеточного содержимого, наблюдается почкование и образование гигантских клеток. Все эти изменения мицелия имеют приспособительный характер и являются реакцией на определенные условия среды (Билай, 1977). Бергес и Фентон (Burges, Fenton, 1953) изучали влияние С02 на рост Penicillium nigricans, Gliomastix convoluta, Zygorhynchus vuillemini. Рост оценивали по радиальной скорости и сухому весу. Повышение концентрации С02 выше, чем 5%, при содержании кислорода 20%, значительно ингибировало рост Penicillium nigricans. Местообитание этого вида ограниченно, как правило, верхними 5 см почвы. Такая атмосфера однако оказывала гораздо более слабый эффект на Z. vuillemini, обильный до глубины 10 см. G. convoluta, который встречается по всему профилю, занимал промежуточное положение. Учитывая, что концентрации С02 в почве после дождя достигают 3,5 - 9,2%, скорее устойчивость грибов к повышению концентрации диоксида углерода, а не к низкой кислорода может определять вертикальное распределение почвенных грибов (Burges, Fenton, 1953).
Выделение чистых культур грибов в анаэробных условиях и определение численности их колониеобразующих единиц в почвах
Согласно данным выделения грибов из почв при анаэробных условиях инкубации посевов, численность микромицетов, способных развиваться в отсутствии кислорода в 50-200 раз ниже, чем в посевах, инубируемьгх в обычных условиях (от полутора до нескольких сотен КОЕ в 1 г почвы). Колонии грибов вырастали только при низких разведениях свежих образцов почв 1:10 - 1:50, либо при посеве мелкозема. Из высушенных образцов почв, в которых, как известно, резко снижается биомасса живого мицелия, грибы не выделялись. При посеве в анаэробных условиях почвы, инкубировавшейся в течение одного года при анаэробиозисе, грибы, не выделялись. В тоже время, при инкубации, посевов в атмофере воздуха количество КОЕ грибов в них достигало 2-3 тысяч в 1 г. На основании этих данных и результатов, люминесцентной микроскопии живого мицелия, и спор, можно сделать вывод о-том, что в анаэробных условиях грибы развиваются-и формируют колонии на средах из фрагментов мицелия, а не из спор.
Все выделенные нами в анаэробных условиях культуры грибов росли и в аэробных условиях, т.е. это представители факультативно анаэробных организмов.
Систематическая принадлежность этих грибов была установлена на основе культурально-морфологических признаков, а нескольких десятков штаммов - и анализе последовательности 26s рДНК (Di/D2 домен). Способностью к росту в анаэробных условиях обладают представители родов Mucor, Rhizopus, Zygorhynchus, Umbelopsis, Mortierella, Actinomucor, Fusarium, Trichoderma, Clonostachys, Acremonium, Humicola, Paecelomyces. Доминировали виды Mucor hiemalis, Mucor circineloides, Rhizopus arrhizus var. arrhizus, Fusarium solani, F. oxysporum, Trichoderma atroviride, T. polysporum, T. harzianum, T. aureoviride, T. viride, T. koningii. Реже встречались Zygorhynchus moelleri, Z. heterogamus, Clonostachys rosea f. rosea, Acremonium strictum, Actinomucor elegans, Mucor racemosus и виды родов Umbelopsis и Mortierella. Редко выделялись в анаэробных условиях (меньше 7% от общего числа колоний, либо единичные колонии) виды Paecilomyces lilacinus, Humicola grisea, Sphaerostilbella aureonitens, Clonostachys grammicospora, Aspergillus terreus, Tolypocladium inflatum, Acremonium strictum, Lecanicillium lecanii. Таким образом, факультативно-анаэробные грибы относятся к обычным, часто выделяемым из почв видам микросокопических грибов. Они представляют узкую группу светлоокрашенных митотических грибов и зигомицетов, для многих из которых отмечена способность к выживанию в неблагоприятных условиях, многие являются оппортунистическими видами.
Факультативно-анаэробные митоспоровые микромицеты относились к отделу Ascomycota порядку Hypocreales семействам Nectriaceae (более 7 видов), Нуросгеасеае (6 видов), Clavicipitaceae (2 вида) и порядку Eurotiales семейству Trichocomaceae (3 вида) и отделу Zygomycota порядку Mucorales семействам Mucoraceae (8 видов) и Umbelopsidaceae (1 вид) и порядку Mortierellales семейству Mortierellaceae (1 вид) (Kirk et al., 2008).
В литературе крайне мало сообщений о выделении мицелиальных грибов непосредственно из природных объектов в анаэробных условиях. В единственной работе методом световой1 микроскопии отмечен рост гриба вокруг почвенных частиц, помещенных на поверхность олиготрофной среды с силикагелем и инкубированных в анаэробных условиях (атмосфера С02 и смесь СОг+Н2). Выделенный гриб был идентифицирован как Fusarium solani (Mart.) Sacc. (Wainwright et al, 1994). Из образцов торфа верхового болота при анаэробных условиях был выделен гриб Trichoderma harzianum (Сизова и др., 1998). Гриб, предварительно идентифицированный как F. solani, изолировали после длительной (более года) инкубации в атмосфере N2 в жидкой минеральной среде с красителями тканей в качестве источника углерода, инокулированной почвой и органическими субстратами (Marchant et al, 1994). В данной работе при изоляции грибов из образцов почв, торфов и с поверхности зеленых и сфагновых мхов способность к росту в анаэробных условиях впервые установлена у представителей Trichoderma aureoviride, Т. atroviride, Т. viride, Т. polysporum, Umbelopsis (Могtierella) isabellina, Zygorhynchus heterogamus, Sphaerostilbella aureonitens, Clonostachys rosea f. rosea, Paecilomyces lilacinus, Hwnicola grisea, Tolypocladium injlatum, Acremomum strictum, Clonostachys grammicospora, Absidia glauca, Actinomucor elegans, Lecanicillium lecanii, Aspergillus terreus.
Все выделенные штаммы росли на твердой среде с глюкозой, содержащей витамины и микроэлементы, в атмосфере молекулярного азота в виде мицелия, стелящегося по поверхности. Скудный воздушный мицелий образовывали лишь виды родов Fusarium, Trichoderma, Clonostachys, Acremonium, Humicola, Paecilomyces и Sphaerostilbella aureonitens. Наиболее часто встречаемые значения толщины мицелия в анаэробных условиях меньше, чем при росте в анаэробных условиях. Наблюдали изменение диаметра гиф, появление вздутий, тонких участков и усиленного ветвления. Уменьшение толщины мицелия отмечено другими исследователями у грибов, подвергающихся действию неблагоприятных факторов внешней среды, например, при их росте в почве по сравнению с питательной средой.
При росте в атмосфере N2 грибы росли в виде светлого стелющегося мицелия (зигомицеты), а митосторовые грибы формировали небольшие колонии с воздушным мицелием. Микромицеты не образовывали типичных половых и бесполых спороношений, характерных для роста в атмосфере воздуха. Наблюдали образование одиночных спор, по типу бластоспор или артроспор, у Zygorhynchus moelleri, Trichoderma harzianum, Sphaerostilbella aureonitens, Fusarium solani, F. oxysporum, Humicola grisea, Rhizopus arrhizus var. arrhizus и Mucor circinelloides. Введение в атмосферу N2 до 30% C02 приводило к переходу Mucor circinelloides к дрожжевому росту. Аналогичное явление было описано ранее для Mucor rouxii (Amylomyces roiaii) (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1961).
Все изученные штаммы факультативно-анаэробных грибов осуществляют спиртовое брожение в анаэробных условиях. Максимальной скоростью образования этанола обладают представители мукоровых -Mucor, Rhizopus и Zygorhynchus. Они накапливают в среде количество этанола, близкое к количеству, образуемому природными штаммами сахаролитических дрожжей. Среди других продуктов брожения у грибов отмечены ацетат и менее летучие спирты и кислоты с 3- и 4-углеродистыми цепочками. В условиях анаэробиоза в митохондриях грибов {Fusarium oxysporum) происходила редукция крист, они уменьшались в размерах или вообще не обнаруживались в отдельных клетках, что свидетельствовало о переходе микромицета к брожению.
