Содержание к диссертации
Введение
Обзор литратуры 9
Этапы формирование биопленки бацилл 9
Структура матрикса биопленки бацилл 15
Регуляторная сеть, контролируящая формирование биопленки 21
Сигнальные пути для инициации образования биопленок бацилл 32
Мультистабильный статус биопленки бацилл 36
Дисперсия биопленок у бацилл 44
Заключение 48
Материалы и методы 50
1. Штаммы, использованные в работе 50
2. Среды и условия культивирования 51
3. Дополнительные компоненты среды 52
4. Анализ биопленок 53
5. Определение роста планктонной культуры 53
6. Подсчет свободных спор 54
7. Подготовка биопленок для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) 54
8. Сканирующая электронная мкроскопия 54
9. Связывание красителя Конго Ред пленками Bacillus subtils 55
10. Статистическая обработка результатов 56
Результаты исследований 57
Обсуждение результатов 86
Заключение 94
Выводы 96
Список использованных источников 97
- Структура матрикса биопленки бацилл
- Дисперсия биопленок у бацилл
- Результаты исследований
- Обсуждение результатов
Структура матрикса биопленки бацилл
Жесткий внеклеточный матрикс, который составляет биопленка B. subtilis, содержит экзополисахариды (EPS) и белки [Branda et al., 2006]. Гены, ответственные за синтез EPS входят в оперон epsA-O (eps) [Branda et al., 2001; Kearns et al., 2005; Branda et al., 2006]. Молекулярная структура экзополисахаридов матрицы B. subtilis не выяснена, однако известно, что дефектные по EPS мутанты бацилл образуют плоские колонии и чрезвычайно хрупкие пластинки [Branda et al., 2006]. Эти мутанты способны расти и формировать цепочки из клеток и все же содержат частично внеклеточный материал благодаря наличию дополнительных матричных компонентов [Branda et al., 2006]. Мутации в генах ферментов, участвующих в синтезе матрицы, pgcA (ген -фосфоглюкомутазы) и gtaB (ген UTP-глюкозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы), также приводят к нарушениям в образовании биопленки [Branda S.S. et al., 2004; Lazarevic V. et al., 2005]. Действительно, мутанты дефектные в синтезе уридин дифосфат-галактозы (UDP-Gal), который является метаболитом предшественником, необходимым для биосинтеза EPS [Chai Y. et al., 2012], не формируют биопленку. UDP-Gal является токсичным промежуточным продуктом в метаболизме галактозы, который обычно преобразуется в нетоксичную UDP-глюкозу с помощью UDP-глюкозо-4 эпимеразы (GalE). Когда нарушают ген galE, рост на галактозе токсичен, потому что накапливается UDP-Gal. Интересно, что мутанты galE, выращенные в условиях, индуцирующих биопленку, или мутанты galE, которые отличаются сверхэкспрессией гена eps могут выживать даже в присутствии галактозы, потому что UDP-Gal шунтируется по пути формирования EPS [Chai Y. et al., 2012]. Из 15 генов в опероне epsA-O 16 изучено только 13 [Ren D. et al., 2004; Nagorska K. et al., 2010; Nagorska K. et al., 2008; Blair K.M. et al., 2008].. Наиболее изученным генным продуктом этого оперона, является EpsE, бифункциональный белок, который координирует процесс биосинтеза EPS с прекращением подвижности [Blair K.M. et al., 2008]. В дополнение к активности гликозилтрансферазы, необходимой для биосинтеза EPS, белок EpsE ингибирует вращение жгутиков, взаимодействуя с белком ротора жгутиков, FliG [Blair K.M. et al., 2008; Guttenplan S.B. et al., 2010].
Ингибирование движения происходит независимо от гликозилтрансферазной активности EpsE. Этот механизм регуляции гарантирует, что клетки отключают подвижность, когда формируется матрица биопленки [Blair K.M. et al., 2008]. Интересно, что в биопленках экзополисахариды EPS, а не подвижность важны для распространения бактерий в колонии: считается, что EPS создают градиенты осмотического давления, что позволяет колониям распространяться и приобретать питательные вещества [Seminara A. et al., 2012]. Это может объяснить дефект роста, наблюдаемый в колониях мутантов, которые не способны продуцировать EPS [Aguilar C. et al., 2010]. Другой внеклеточный полимер, -поли-DL-глутаминовая кислота (PGA), производится в биопленках в обильном количестве у некоторых штаммов B. subtilis, и может усилить образование матрицы биопленки [Morikawa M. et al., 2006; Stanley N.R. et al., 2005]. Тем не менее, PGA не требуется для морфологии морщинистой колонии [Branda S.S. et al., 2006; Kobayashi K. et al., 2007].
Химический состав синтезированного полисахарида по продуктам eps-оперона в настоящее время не ясен. Когда штамм B. subtilis NCIB3610 выращивают в среде, содержащей глутаминовую кислоту и глицерин, моносахариды, присутствующие в углеводной биомассе являются галактозой, глюкозой и N-ацетилгалактозой (GalNAc). Распространенность каждого сахара в значительной степени зависела от целостности eps-оперона [Chai et al., 2012]. В соответствии с этими данными, гены, 17 участвующие в метаболизме галактозы важны для формирования биопленки [Chai et al., 2012]. В отличие от этих данных, анализ полисахаридной биомассы штамма NCIB3610, выращенного в бульоне TY (среда LB с добавлением магния сульфат и сульфат марганца), выявил EPS зависимый от оперона манноза-доминирующий профиль моносахаридов [Jones et al., 2014]. Поэтому молекулярную природу полисахарида, продуцируемого компонентами eps-оперона еще предстоит установить, и он может зависеть от доступных субстратов. В дополнение к EPS, произведенному с использованием продуктов eps-оперона, штаммы B. subtilis, обычно используемые для анализа формирования биопленки синтезируют внеклеточный полисахарид левана. Леван - гомополимер фруктозы и его синтез зависит от левансахаразы, кодируемой геном sacB [Benigar et al., 2014]. Во время роста в присутствии сахарозы леван может быть включен в матрицу пленки [Dogsa et al., 2013] и может частично компенсировать отсутствие продуктов eps-генного кластера. Образование левана на основе того, что сахароза продуцируется растениями, и его присутствие в матрице может быть актуальным для формирования биопленки B. subtilis в естественной среде в ризосфере [Dogsa et al., 2013]. Поэтому логично сделать вывод, что спектр экзополисахаридов В. subtilis, которые входят в матрицу биопленки, может варьировать в зависимости от условий роста.
Структурную целостность матрицы обеспечивают два секретируемых белка, TasA и TapA, которые кодируются опероном из трх генов tapA-sipWasA (оперон tapA) [Branda et al., 2006]. TasA впервые описан как споровый белок с антимикробной активностью (он также называется CotN) [Stover and Driks, 1999]. TasA является функциональным амилоидным белком, собирается в длинные волокна [Romero et al., 2010], который секретируется во внеклеточное пространство с помощью сигнальной пептидазы SipW, где он самособирается в волокна, которые 18 прикрепляются к клеточной стенке с помощью белка TapA [Romero et al., 2011].
Белок TasA может полимеризоваться in vitro и способен связываться с антителом, специфичным для амилоидных агрегатов, что привело к описанию TasA как амилоидоподобного белка [Romero et al., 2010]. Когда TasA очищается из планктонных клеток B. subtilis, он находится в олигомерном состоянии в растворе. Волокнообразование стимулируется гидрофобной поверхностью [Romero et al., 2010] или кислым раствором [Chai et al., 2013]. Вторичная структура белка TasA изменяется между его олигомерным и волокнистым состояниями; в олигомерном состоянии белок богат -спиралью, а при формировании волокна наблюдается уменьшение -спиралей наряду с одновременным ростом -структур [Chai et al., 2013]. Это явление, которое ранее описано для эукариотических амилоидоподобных белков [амилоидный пептид А- [Fraser et al., 1991] для болезни Альцгеймера, Киназа PI3 [Zurdo et al., 2001] и белок прион сирийского хомяка.
Мутанты, дефектные по гену tasA, не образует биопленки, но их дефект не такой существенный, как у мутантов с дефектом eps-оперона. tasA-Мутанты также продуцируют клеточные цепи, которые уже не удерживаются вместе, делеция гена tasA производит биопленку, фенотип который отличается от фенотипа сформированного EPS делеционным штаммом [Branda et al., 2006]. Анализ показал, что удаление гена tasA связано с отсутствием формирования морщинистой биопленки. Сделано заключение о вкладе ТаsА белка в формирование матрицы.
Оставшийся белок, кодируемый в опероне, является TapA-белком, который образует минорный компонент TasA-волокон и требуется для их сборки [Romero et al., 2011; 2014]. TapA обнаружен во фракции клеточной стенки клеток, выращенных в виде пелликул или колоний, и он участвует не только в прикреплении волокон TasA к клеточной стенке клетки, но и в сборке амилоидных волокон [Romero D. et al., 2011].. Помимо локализации 19 в клеточной стенке, TapA может быть очищен как минорный компонент амилоидного волокна [Romero D. et al., 2011].. В отсутствие гена tapA, не только TasA-волокна дикого типа не способны образовываться, но и уровень TasA белка также уменьшается [Romero et al., 2011]. Эти данные указывают, что TapA белок необходим для стабильности TasA, возможно из-за того, что амилоидоподобная форма волокна TasA более устойчива к протеолитическому расщеплению, чем в разобранном олигомере. Согласно этим выводам, ТapA-белок необходим для образования биопленок [Romero et al., 2011].
Сигнальная пептидаза SipW наряду с TasA расщепляет также предшественник белка TapA [Stover et al., 1999; Tjalsma et al., 1998], распознавая N-концевую сигнальную последовательность, чтобы белки могли высвободиться из мембраны и сформировать амилоподобные волокна, связанные с клеточной стенкой. Мутации в гене sipW у B. subtilis штаммов приводят к дефекту прикрепления к стеклянным или поливинилхлоридным поверхностям в лабораторных условиях [Hamon et al., 2004]. Пептидаза SipW представляет собой бифункциональный белок, сигнальная пептидазная активность которой способна процессировать белки TasA и TapA, но С-концевой домен белка SipW функционирует, чтобы активировать экспрессию eps-оперона. Такая активация необходима для прикрепления клеток к поверхности.
Дисперсия биопленок у бацилл
Последняя стадия цикла развития биопленки - это ее разборка. Этот процесс тоже контролируется и зависит от состояния окружающей среды. Существует как минимум два механизма, с помощью которых это происходит. Во-первых, эта стадия контролируется на уровне транскрипции оперонов, необходимых для производства матрицы биопленки, которые не экспрессируются и, во-вторых, на уровне макромолекул в матрице биопленки, которые подвергаются деградации. Было показано, что некоторые клетки выключают механизмы экспрессии генов матрицы и способны вернуться в состояние плангтонных подвижных клеток [Vlamakis et al., 2008, 2013; Norman et al., 2013]. На уровне экспрессии генов это происходит путем регулируемого включения состояния SlrR-high в состояние SlrR-low. В соответствии с этим, уровень SlrR снижается по мере созревания биопленки – это фенотипописан и он связан с нестабильностью этого белка [Chai et al., 2010a]. Нестабильность регулятора SlrR соответствует двум основным механизмам: (i) это происходит в результате расщепления клеточной протеазой ClpCP и (ii) как результат ауторазрушения [Chai et al., 2010a].
При анализе в структуре регуляторного белка SlrR был идентифицирован консервативный мотив, который встречается в семействе репрессоров типа LexA, которые подвергаются авторасщеплению при восприятии определенного клеточного сигнала [Little, 1984]. Действительно, сайт-направленная мутация аминокислот в этой консервативной последовательности приводила к увеличению стабильности белка-регулятора SlrR. Однако хотя SlrR несет мотив типа LexA, у него отсутствует каталитический домен, который необходим для протеолитической активности [Newman, 2013]. Поэтому согласно альтернативной модели регуляторный белок SlrR способен агрегировать и подвергаться протеолитическому расщеплению ClpCP-протеазой [Newman, 2013]. Уничтожение регулятора SlrR позволит глобальному 45 регулятору SinR взаимодействовать с областями промоторов оперонов матрицы, тем самым останавливая биосинтез компонентов матрицы, TasA и экзополисахаридов. Второй метод дисперсии биопленки включает деградацию или разрушение макромолекул во внеклеточной среде. В этом процессе могут участвовать внеклеточные протеазы [Marlow et al., 2014a]. Важно подчеркнуть, что функциональная роль протеаз в разрушении белковых компонентов матрицы биопленки пока еще экспериментально не установлена, но поддерживается данными, что субтилизиноподобная протеиназа наттокиназа B. subtilis Natto способна разрушать амилоидный пептид [Hsu et al., 2009]. Следовательно, можно предположить, что такой фермент будет участвовать в разборке амилоидоподобных волокон TasA в матрице.
.Еще два механизма разборки на уровне макромолекул предложены. Первый основан на самостоятельном производстве D-аминокислот на последнем этапе биопленки [Kolodkin-Gal et al., 2010]. D-аминокислоты вызывали разборку путем включения в клеточную стенку пептидогликана и блокирования встраивания TapA в клеточную стенку, что приводило к высвобождению и дальнейшей деградации волокон TasA из клетки [Kolodkin-Gal et al., 2010; Romero et al., 2011]. Тем не менее, имеются другие данные, что добавление D-аминокислот приводило к в неправильному включению D-аминокислот в белки, которые вели к снижению клеточного роста [Leiman et al., 2013]. Инкорпорация D-аминокислот в белки может быть предотвращена в присутствии функциональной D-аминоацил-тРНК-деацилазы, которая удаляет D-аминокислоты из неправильно заряженных тРНК [Soutourina et al., 2004]. Штамм B. subtilis, используемый в первоначальном анализе содержал мутацию в гене D-аминоацил-тРНК -деацилазы (а именно dtd), которая предотвращала экспрессию этого фермента [Leiman et al., 2013]. Когда была устранена мутация D-аминокислоты, ингибирование биопленки не наблюдалось [Leiman et al., 2013]. Второй механизм разборки биопленки – 45 это самостоятельное производство полиамина норспермидина [Kolodkin Gal et al., 2012]. Было высказано предположение, что во внеклеточной среде норспермидин взаимодействует с экзополисахаридный компонент биопленочной матрицы, разрушая его и освобождая клетки [Kolodkin-Gal et al., 2012]. Аннотирование геномной последовательности B. subtilis показало, что у этих бактерий отсутствует биосинтетический путь, необходимый для синтеза норспермидина и, в соответствии с этим, обнаружение норспермидина в образцах биопленки невозможно [Hobley et al., 2014]. Кроме того, анализ показал, что гетерологичное добавление низких концентраций норспермидина может заменить полиамин, спермидин при формировании биопленки [Burrell et al., 2010; Hobley et al., 2014]. Поэтому вопрос о разборке биопленки B. subtilis остается пока обсуждаемой темой. В дальнейшем исследовании необходимо определить, является ли уменьшение биомассы биопленки результатом организованного процесса разборки или просто результат начала споруляции большинством клеток после исчерпания запасов питательных веществ.
Одной из наиболее важных проблем в изучении биопленок является поиск новых методов для изучения их дисперсии [Karatan and Watnick, 2009; Mirani et al., 2013]. Эти знания могут быть полезными при искоренении хронических инфекций, опосредованных биопленкой, для предотвращения закупорки трубопроводов [Karatan and Watnick, 2009; Mirani et al., 2013] и др. Идет активный поиск небольших молекул, которые могут эффективно вызывать рассеивание биопленки. Молекулы должны соответствовать определенным критериям, которые необходимо учитывать для практического применения и прежде всего быть безвредными для человека. Различные D-аминокислоты, экзогенно добавленные в культуры, вызывают дисперсию биопленок B. subtilis из-за их негативного влияния на организацию клеточной стенки бактерий и прикрепление внеклеточного матрикса клеток [Kolodkin-Gal et al., 2010]. Подобный эффект 47 приписывают определенным D-аминокислотам, таким как D-серин, которые могут замещать остатки D-аланина из пентапептида, который участвует в сборке пептидогликан клеточной стенки бацилл, отрицательно влияя на активность некоторых антибиотиков клеточной стенки, таких как ванкомицин [Pereira et al. , 2007]. Имеются данные, что токсичность D-аминокислот возникает при добавлении к клеточным культурам B. subtilis [Cava et al., 2011; Hochbaum et al., 2011]. Молекулярная основа этой токсичности зависит от их способности замещать свои L-изомеры во время синтеза белка и вызывать общую неправильную работу белков. Токсическое действие D-аминокислот следует дополнительно изучить при дисперсии биопленки или синтезе клеточной стенки.
Другая небольшая молекула, описанная для дисперсии биопленки B. subtilis, представляет собой полиамин норспермидин [Kolodkin-Gal et al., 2012]. Норспермидин специфически взаимодействует с экзополисахаридом внеклеточного матрикса, разрушая уже существующие биопленки. Впоследствии мутанты, неспособные продуцировать норспермидин, образовывали долгоживущие биопленки [Kolodkin-Gal et al., 2012]. Однако обнаружение норспермидина в биопленках B. subtilis оказалось затруднительным для воспроизведения в других лабораториях, что также вызывает обеспокоенность относительно способности B. subtilis продуцировать полиамин [Hobley et al., 2014]. В целом, эти исследования показывают, что D-аминокислоты и норспермидин, как специфические триггеры биопленки, нуждаются в дальнейшем уточнении. При определенных условиях эти молекулы могут влиять на рост или ингибировать образование биопленки [Hofer, 2014].
Результаты исследований
Исследовали влияние состава сред культивирования на образование биопленок штаммом B. subtilis (рис. 4). В качестве сред для культивирования использовали среду LB, среду BGM, среду ВМ, среду MSgg, а также среду Е. Одновременно проводили исследование образования биопленок на соответствующих средах с добавлением глюкозы в конечной концентрации от 0,01% до 1% (рис. 4). Оптимальной являлась синтетическая E-среда, которая позволила повысить уровень биопленки B. subtilis в 7 раз относительно среды LB.
Очевидно, что высокое содержание энергетически богатых питательных веществ в среде культивирования не способствовало образованию биопленок и переход культуры к формированию биопленок обусловлен ограниченными условиями, прежде всего дефицитом питательных веществ. Добавление в среду 1% глюкозы во всех вариантах состава сред выращивания вызывало снижение интенсивности образования биопленок, свидетельствуя что биосинтез компонентов матрикса биопленки подвергается регуляции по механизму катаболитной репрессии. Максимальный уровень биопленки был получен на Е-среде. Все последующие исследования мы проводили на Е-среде.
Изучали динамику роста, формирования биопленки и споруляции штамма B. subtilis на оптимальной среде (рис. 5).
Установили, что образование биопленки начинается на 12 ч роста бактерий и достигает максимума в стационарной фазе роста, дисперсия 59 биопленки происходит, когда наступает фаза отмирания клеточной культуры. При этом споры появляются в среде в фазе созревания биопленки на 46 час и активная споруляция происходит на этапе дисперсии биопленки после 50 час. То есть оба эти энергозатратных процесса, образование биопленки и споруляция, регуляторно разделены и не происходят одновременно, а развиваются последовательно в соответствии с ограничением и сигналами внешней среды.
Для выяснения оптимальных условий культивирования для образования биопленок исследовали влияние температуры и рН на этот процесс. Исследовали динамику формирования биопленок B. subtilis 168 при температуре культивирования в диапазоне от 4 до 50 С (рис. 6).
Полученные нами данные показали, что биопленки B. subtilis 168 образуются в диапазоне температур от 22 С до 45 С (рис. 8). Этот диапазон температур является наиболее благоприятным для формирования функционально-активных биопленок с максимальным уровнем при температуре 37 С. По данным литературы биопленки бацилл активно колонизируют системы отопления и тепловые насосы, что значительно ограничивает их работоспособность и теплоотдачу, то есть для их 60 формирования и роста благоприятна среда с повышенной температурой [Tian et al., 2012].
Далее изучали влияние рН среды на интенсивность образования биопленок штаммом B. subtilis 168. Измерения проводили на 48 час роста культуры (рис. 7). Установили, что оптимальным для формирования биопленок является рН 7.4. При повышении рН среды до 8.0 наблюдали снижение уровня образования биопленок в среднем на 6%, последующее повышение рН до рН 8.5-9.0 приводило к резкому снижению уровня биоплнки.
Таким образом, оптимальным рН для формирования биопленок является рН среды, значение которого ближе к нейтральному. По-видимому, при этом значении рН в естественных условиях существования B. subtilis 168 в поверхностных слоях почвы происходит активная колонизация биопленками бацилл корней растений с формированием взаимовыгодных симбиотических взаимоотношений [Choudhary, Johri, 2009]. Эти исследования интенсифицируются в последнее время и обещают новые перспективы в агробиотехнологии, что подчеркивает их актуальность. Более того, почвенные штаммы B. subtilis в настоящее время рассматривают как эффективное средство биоконтроля в защите растений 61 от почвенных патогенов, но эффективность контроля в большой степени зависит от уровня содержания металлов в ризосферной почве, поэтому необходимы знания о влиянии металлов на формирование биопленок бацилл [Yang et al., 2018].
Мы исследовали влияние ионов двухвалентных металлов на формирование биопленок штаммом B. subtilis 168. Бактерии выращивали в круглодонных 96-луночных планшетах при температуре 37 С в течении 48 час без качания. В среду культивирования вносили ионы Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ в конечных концентрациях 2, 3, 5, 10 и 15 мМ.
Внесение ионов Ca2+ в концентрации до 5 мМ приводило к повышению уровня образования биопленок B. subtilis 168 (до 25%) на 36 час роста. С увеличением концентрации экзогенного кальция до 10-15 мМ происходило частичное ингибирование (до 35%) пленкообразования. Отметим, что согласно полученным нами данным, кальций эффективно действует именно на стадии начала созревания биопленки B. subtilis (рис. 8). Предполагается, что ионы Ca2+ играют важную роль в адгезии клеток бацилл при формировании биопленки [He et al., 2016].
Имеются данные, что присутствие кальция в среде влияет на пути регуляции B. subtilis 168, участвующие в образовании жгутиков и синтезе компонентов матрицы биопленки [Oomes et al., 2009]. При анализе транскриптома B. subtilis 168 авторы обнаружили 305 генов, на экспрессию 62 которых влияет кальций, включая гены биосинтеза матрицы и гены, кодирующие биосинтез полисахаридов оболочки споры [Oomes et al., 2009]. Показано, что взаимодействие между микроорганизмами и ионами Ca2+ увеличивало как степень, так и скорость развития биопленки с увеличением концентрации Ca2+ в среде, причем влияние Ca2+ на развитие биопленки было наиболее заметным на стадии быстрого роста биопленки [Tian et al., 2012]. Авторы отмечают, что концентрация Ca2+ коррелирует также с морфологией биопленки B. subtilis 168. Аналогичные данные получены нами при внесении в среду ионов Mn2+, присутствие которых необходимо в начале созревания биопленки B. subtilis 168, повышение уровня пленкообразования наблюдали до 36 час при концентрациях Mn2+ 2-3 мМ (рис. 9).
Соли Ca2+ и Mn2+ входят в состав исходной среды культивирования, в которой их концентрация не превышает 1 мМ. Отсутствие выраженного ингибирования при внесении ионов Ca2+ и Mn2+ указывает на их нетоксичность в отношении формирования биопленок. Имеются данные, что экзогенное присутствие ионов Mn2+ способствует образованию устойчивых биопленок у бацилл путем соучастия в активации фосфореле, необходимого для фосфорилирования глобального фактора транскрипции Spo0A, предположительно, выступая в качестве кофактора сигнального 63 пути с гистидинкиназой KinD и белковых компонентов фосфореле, фосфотрансфераз Spo0F и Spo0B [Shmesh, Chai., 2013]. Эффект стимуляции ионами марганца при образовании биопленки обнаружен для многих бацилл и позволил авторам предположить, что такой сигнальный путь для формирования биопленки высококонсервативен для этой группы микроорганизмов.
Изучали влияние ионов Mg2+ в конечных концентрациях 2, 3, 5, 10 и 15 мМ на формирование биопленки B. subtilis 168 (рис. 10). Установлено, ионы Mg2+ в концентрации 2-5 мМ способствуют образованию биопленки на ранних стадиях ее формирования, повышение концентрации магния в среде до 15 мМ приводило к снижению уровня образования биопленок (на 60%) у B. subtilis 168.
Обсуждение результатов
B. subtilis являются подвижными спорообразующими грамположительными бактериями, способными образовывать устойчивые биопленки и споры, являющиеся основной формой существования в окружающей среде и важные для выживания этих бактерий в естественных условиях. Очевидно, биопленки наряду со спорами являются преобладающим образом жизни бактерий в естественной среде, образование которых представляет сложный и строго регулируемый процесс. Традиционно B. subtilis считается почвенным микроорганизмом, локализованным преимущественно в ризосфере и колонизирует корни и листья растений, защищая их от почвенных патогенов [Chen et al., 2013; Garcia-Gutierrez et al., 2013; Zeriouh et al., 2013]. Общим признаком биопленок B. subtilis является обилие архитектурных особенностей, сложность которых определяется высокой степенью клеточной специализации и межклеточной коммуникации, образуя в совокупности сообщество аналогичное по строению для сложных многоклеточных организмов [Lopez et al., 2009d]. При формировании биопленки клетки B. subtilis переходят из планктонного в неподвижное состояние, при этом подавляется экспрессия жгутиковых генов и индуцируется экспрессия генов, необходимых для образования внеклеточного матрикса, что обусловлено индукцией и кооперативным взаимодействием множества внешних сигналов, например, истощение питательных веществ в окружающей среде, низкий уровень кислорода или поверхностное сцепление и др. [Cairns et al., 2013; Kolodkin-Gal et al., 2013]. При изучении физиологии биопленки B. subtilis нами показано, что образование биопленки начинается в фазе замедления роста и достигает максимума на 48 час в стационарной фазе роста, дисперсия биопленки происходит, когда наступает фаза отмирания клеточной культуры, активная споруляция происходит после 60 час. То есть оба эти энергозатратные процессы, образование биопленки и споруляция, регуляторно разделены и не 87 происходят одновременно, а развиваются последовательно в соответствии с поступающими сигналами условий внешней среды. Биопленки развиваются в диапазоне температур от 20 до 45С и рН 6,5 – 8,5, за пределами этих показателей начинается споруляция.
По мере развития биопленки клетки бацилл теряют подвижность, прилипают друг к другу и к поверхности, выделяя внеклеточный матрикс. Неподвижные клетки заключены в самопродуцируемый внеклеточный матрикс, необходимый для формирования устойчивых биопленок. В процессе созревании на поверхности биопленки появляются обширные складки (морщины), а также воздушные домены для споруляции и распространения спор.
Трехмерная архитектура биопленки B. subtilis до сих пор не понятна. Образование внеклеточного полисахаридного матрикса по химическому составу варьирует в зависимости от условий роста. Структурную целостность матрицы обеспечивают два секретируемых белка, TasA и TapA, которые кодируются опероном из трх генов tapA-sipWasA (оперон tapA) [Branda et al., 2006]. TasA является функциональным амилоидным белком, который секретируется во внеклеточное пространство с помощью сигнальной пептидазы SipW, где он самособирается в волокна, которые прикрепляются к клеточной стенке с помощью белка TapA [Romero et al., 2011]. Дополнительный внеклеточный белок, необходимый для формирования биопленки - бактериальный гидрофобин BslA [Hobley et al., 2013], он ответственен за поверхностную гидрофобность биопленки и формирование морфология биопленок бацилл. Белок BslA секретируется на заключительных этапах созревания биопленки и самособирается в гидрофобный слой снаружи биопленки [Hobley et al., 2013]. Белок BslA действует в синергетическом взаимодействии с TasA и EPS для полной сборки биопленки. Вся эта архитектура обеспечивает устойчивость биопленки к внешним воздействиям. Мы показали, что биопленка B. subtilis устойчива к 88 широкому диапазону температуры и рН, к воздействию таких агентов как H2O2 (окислительный стресс), ионы тяжелых металлов, NaCl (1М) (солевой стресс), ЭДТА и этанол.
Клетки, заключенные в биопленки, формируют субпопуляции генетически идентичных, но фенотипически отличных клеток [Lopez and Kolter, 2010a]. В итоге, внутри биопленки формируются субпопуляции специализированных клеток, которые реагируют на различные сигналы и служат различным целям на благо всего сообщества, эффективно минимизируя энергозатраты и предотвращая энергоемкий процесс споруляции. В каждой субпопуляции активизируются в ответ на специализированные сигналы разные факторы транскрипции (Spo0A, DegU и др.), ответственные за специфические каскады экспрессии внутри биопленки B. subtilis (рис. 2). Дифференциация на эти субпопуляции является ключевым требованием для формирования трехмерной архитектуры колоний.
В планктонной, свободно живущей популяции все клетки подвижны, биопленки формируются, когда клетки становятся неподвижными. При этом мастер-регуляторы Spo0A, DegU активируются, что уменьшает популяцию подвижных клеток. Существует два различных уровня активации для мастер-регулятора Spo0A P. Низкий уровень активации (Spo0A-ON) приводит к формированию матрикса, а более высокий уровень способствует споруляции [Fujita et al., 2005]. Клетки Spo0A-ON предотвращают подвижность жгутиков путем активации eps-оперона. Такие клетки Spo0A-ON также являются каннибалами, секретируют пептидные токсины (Skf и Sdp), которые убивают чувствительные клетки. Мертвые клетки служат источником питательных веществ и задержки споруляции [Guttenplan et al., 2010]. В расщеплении белков мертвых клеток участвуют внеклеточные протеинызы, синтез которых контролирует фактор транскрипции DegU. 89 При фосфорилировании DegU-P действует как ингибитор и активатор экспрессии в зависимости от его статуса фосфорилирования [Murray et al., 2009]. Уровень активации DegU P связывают с изменением осмолярности и присутствии специфических пептидных сигналов [Ogura et al., 2003]. Активация DegU P происходит при ограничении вращения жгутика в клетках, которые прикреплены к поверхности и формируют биопленку [Cairns et al. al., 2013]. Активация DegU-ON (DegU P) приводит к субпопуляции клеток, которые специализируются на секреции экзопротеаз, участвующих в расщеплении крупных биополимеров на доступные питательные олигопептиды для всего сообщества [Veening et al., 2008]. Субпопуляция клеток DegU-ON положительно регулируют экспрессию белка матрицы BslA на поверхности биопленки, необходимого для ее целостности и эластичности [Hobley et al., 2013, Marlow et al., 2014].
Клетки DegU-ON преимущественно локализуются на поверхности прикрепленной к агару биопленки, что способствует формированию слоя BslA, который покрывает биопленку.
В наших экспериментах в присутствии ионов двухвалентных металлов изменилась динамика развития биопленки – максимального уровня биопленка достигает на 36 час роста и дальше начинается дисперсия биопленки. Такая динамика сохранялась при внесении в среду 1 М хлористого натрия и ЭДТА, кроме того мутанты degU- показали большую устойчивость к этим соединениям. Инактивация фактора транскрипции DegU приводит к ранней дисперсии биопленки и увеличению ее резистентности. Эти данные могут указывать на важность этого фактора транскрипции для синтеза белка гидрофобина BslA для его функционирования в биопленке.
При использовании в наших исследованиях регуляторных мутанов биопленки spo0A- и degU-штаммов формировались, но на более низком уровне по сравнению с контрольным вариантом биопленок штамма дикого типа. Это свидетельствует о том, что оба фактора транскрипции участвуют 90 в контроле цикла развития биопленок, причем вклад Spo0A белка преимущественно на стадии инициирования пленкообразования. Об этом также свидетельствуют данные о влиянии ионов металлов (Са) на уровень биопленок. Активация Spo0A требует фосфорилирующего действия пяти различных киназ (KinA-E), которые ответственны за перенос фосфатной группы на мастер-регулятор Spo0A через фосфореле [Jiang et al., 2000].
Активация киназ KinA-E регулируется действием специфических сигналов. Некоторые из них сейчас идентифицированы. Так, KinC индуцирует низкие уровни активауии Spo0A P в ответ на изменение содержания катионов калия [Lopez et al., 2009d]. KinD чувствителен к содержанию ионов марганца, [Beauregard et al., 2013; Shemesh and Chai, 2013]. Он также чувствителен к содержанию внеклеточных полисахаридов и запускает споруляцию при достижении их критического порога [Aguilar et al., 2010]. KinB активируется при нарушении транспорта электронов из за определенных воздействий окружающей среды (например, из-за низкого содержания кислорода или большого количества ионов железа). KinA реагирует на уровни NAD/NADH в цитоплазме [Kolodkin-Gal et al., 2013].
Очевидно, что уровень активации определяется совокупным входом сигналов, и, по-видимому, в этом процессе участвуют, в том числе, в качестве кофакторов ионы металлов. Характер ответа spo0A-мутантов на действие металлов отличается от ответа биопленки штамма дикого типа: в присутствии в среде ионов Са2+ и Mn2+ мы наблюдали ингибирование биопленки на уровне 15-20%. Полученные данные могут свидетельствовать о важной роли этих металлов в активации фосфореле, направленного на фосфорилирование фактора транскрипции Spo0A.