Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы заметно возросло социально-медицинское значение условно-патогенных микроорганизмов (УПН) и обусловленных ими острых кишечных инфекций (ОКИ), т.к. значительный удельный вес этих инфекций приходится на детей раннего возраста, особенно новорожденных. В этиологической структуре этих заболеваний доминирует К. pneumoniae, на её долю приходится от і 1,2 до 54,2 (Поликарпов Н. А. и соавт., 1985; Белокрысенко С. С., 1990, 1993; Кашуба Э. А. исоавт., 1994).
Клебсиеллезы отличаются тяжелым течением, нередко с развитием генерализованных форм (Несветов A.M., 1974; Лєбензон G.C. и соавт., 1986; Garcia G.М., 1985), не только у детей, ко и у взрослых (Фролов 8. М. и соавт., 1994).
Вместе с тем диагностика кишечных форм клебсиеллезной инфекции значительно сложнее, чем при другой локализации, т.к. факт выделения К.pneumoniae не может служить основанием для микробиологического диагноза, необходимо еще доказательство их этиологической значимости в каждом конкретном случае.
В этой связи исследователями используется различные подходы, з том числе и методический подход, основанный на определении патогенных свойств предполагаемого возбудителя (Бондаренко В.М. и соавт. ,1987; 1988; Поликарпов Н. А., 1987; Арутюнян Н. М., 1988; БаркусМ.М., 3990; Mesta A.M. et al.,1985; Gupta R. et al., 1990; Yokocfli et al.. 1995).
Несмотря на имеющийся значительный фактический материал, касающийся факторов патогенности, отсутствуют критерии оценки патогенности К.pneumoniae, подкрепленные данными о их роли в патогенезе кишечной инфекции, т.к. не разработан методический подход к изучению явления патогенности К. pneumoniae, основанный на механизмах взаимодействия микро- и макроорганизма и, как следствие, не разработаны диагностические препараты, направленные на тестирование факторов патогенности и выявление антител к ним.
Цель работы: Обосновать патогенетическую роль ведущих факторов патогенности и на их основе разработать критерии оценки этиологической значимости К. pneumoniae при острых кишечных инфекциях у детей первого года жизни.
Задачи исследования: !i' ,;""
изучить роль К. pneumoniae в этиологии острых кишечных инфекций у'детей первого года жизни;
разработать критерии оценки этиологической значимости К. pneumoniae
при острых кишечных инфекциях;
установить взаимосвязь совокупности факторов патогенности штаммов и отдельных клинических проявлений острого кишечного клебсиеллеза;
выявить неспецифические клеточные и гуморальные факторы, участвующие в защите от инфекции у детей первого года жизни;
экспериментально доказать роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе клебсиеллезной инфекции;
установить роль ведущих факторов патогенности К. pneumoniae: фимбрий I и III типов, лигюполисахаридз и термолабильного энтеротоксина в патогенезе острой кишечной инфекции;
экспериментально обосновать и разработать комплекс диагностических препаратов, основанных на тестировании факторов патогенности К. pneumoniae и выявлении антител к ним.
Научная jjouHaHa^ Выявлен комплекс факторов и признаков патогенности К. pneumoniae и на его основе разработали критерии оценки для обосноваьия этиологической значимости штаммов при острых кишечных инфекциях у детей первого года жизни.
Впервые доказано, что штаммы К. pneumoniae способны к продукции ряда факторов патогенности С различной частотой и интенсивностью. Создана коллекция, включающая референс-штаммы и штаммы-продуценты факторов и признаков патогенное, подтвержденная 9 патентами и авторскими свидетельствами, 11 справками о депонировании в Государственной коллекции (Патент РФ N17B&965, 1777607; А. С. N504 3033, N504 3065, N504 3066, N504 1189, N94 01 8327, №4 030872. NS4 030870).
Впереые установлено наличие прямой корреляционной зависимости медду степенью адгезии, типом фимбрий и типом энтеротоксигенности. Выявлено отсутствие корреляции между массивностью выделения и вирулентностью штаммов. Впервые установлено наличие избирательной гемолитической активности штаммов в отношении IKA) и IV (АВ) групп крови человека, преобладание больных с этими ке группами крови.
Впервые по данным электронной микроскопии дана характеристика поверхностных структур штаммов фекального происхождения, позволившая выявить типы фимбрий. Впервые экспериментально доказано участие фимбрий I и III типов и адгезивном процессе (Патент N1777607, А. С. N5043066).
Установлено участие фимбриальных адгезинов в регуляции диарейного синдрома, опосредованно, через стимуляцию продукции термолабільного энтеротоксина.
Впервые виявлено и экспериментально доказано, что комплекс факторов патогенности штаммов определяет клинические К'рмы и проявления инфекции. Выраженность отдельных симптомов заболевания зависит от интен-
Сивности продукции определяющих их факторов патогенности (Патент N1707615).
Установлено, что острая кишечная инфекция у детей первого года жизни характеризуется поражением всех отделов желудочно-кишечного тракта, с преимущественным вовлечением в патологический процесс толстого и тонкого кишечника. Острый период сопровождается антигенемией, обусловленной наиболее часто липополисахаридом и фимбриальным адгези-ном III типа в крови, термолабильным энтеротоксином и липополисахаридом в копрофильтрате.
Впервые экспериментально доказано, что исход инфекции зависит от исходного уровня сбалансированности системы А03-П0Л и имеет решающее значение на первых этапах инфекции. Дефицит активных форм кислорода приводит к развитии генерализованных форм инфекции, а высокий уровень - к избытку высокотоксичных продуктов перекисного окисления липидов, приводящих к быстрым летальным исходам.
Впервые экспериментально обоснован и разработан комплекс диагностических препаратов, иммуноферментных тест-систем и питательных сред для тестирования факторов патогенности К. pneumoniae и антител к ним (Патент N1814769, N1742322; А.С. N93-052668; N94030871).
Теоретическая значимость работы. Комплексный подход к изучению факторов патогенности К. pneumoniae позволил доказать, что патогенность является не видовым признаком К.pneumoniae, а лабильной характеристикой штамма, выполняющегсЗмножественную патогенетическую функцию. Факторы патогенности находятся во взаимодействии друг с другом.
У штаммов клебсиелл фекального происхождения впервые охарактеризованы типы фимбрий , продуцируемые ими адгезины, доказано их участие в адгезивном процессе, что позволяет рассматривать возможность развития направления по созданию антиадгезивных препаратов для лечения и профилактики клебсиеллезов.
Вскрыт ранее неизвестный один из механизмов регуляции диарейно-го синдрома. Фимбриальные адгезины I и III типов стимулируют продукцию термолабильного энтеротоксина, активирующего образование аденилатцик-лазы, которая» через усиление синтеза циклического аденозиннонофосфа-та, нарушает транспорт ионов и воды через мембраны клеток.
Установлено, что у детей первого года жизни, имеющих несовершенную защитно-адаптационную систему, основными механизмами защиты от инфекции являются локальная иммунная защита и неспецифические факторы -фагоцитоз и процессы свободнорадикального окисления. Доказано, что тяжесть течения и исход инфекции зависит от исходного состояния сбалансированности системы А03-П0Л и имеет решающее значение на первых
этапах инфекции.
Практическая значимость работы. На основании результатов исследования разработаны и внедрены в работу практических лабораторий методы лабораторной диагностики острых кишечных инфекций у детей раннего возраста: - Диагностика, прогнозирование течения и лечение острых кишечных инфекций условно-патогенной и смешанной этиологии (Методические рекомендации. Утв. МЗ РСФСР 23.11.90г.).
Определение адгезивных свойств граиотрицательных бактерий (Информационно-методическое письмо. Утв. ГКСЗН РФ 20.01.93г.).
Определение факторов патогенности условно-патогенных энтеробактерий и оценка их этиологической значимости при острых кишечных инфекциях у детей раннего возраста (Методические рекомендации. Утв. ГКСЭН РФ 28.11.94г.).
На основании результатов исследования разработан комплекс диагностических препаратов, иммуноферментных тест-систем и питательных сред для тестирования факторов патогинности К. pneumoniae и антител к ним:
Проект ВФС и ЭПР на тест-систему иммуноферментную для выявления антител к липополисахариду К. pneumoniae (Разрешение на проведение Государственных испытаний. Протокол ГФК РФ N1 от 05.04.95г.).
Проект ВФС и ЭПР на тест-систему иммуноферментную для обнаружения термола&ильного энтеротоксина энтеробактерий (На рассмотрении в ГФК РФ,. N113 от 09.12.94г.).
Проект ВФС и ЭПР на тест-систему иммуноферментную для выявления антител к термолабільному энтеротоксину энтеробактерий (Утв. Уч. советом РНИИМП, протокол N10 от 28.12.95 г. Рекомендована к рассмотрению в ГФК РФ).
Проект ВФС и ЭПР на питательную среду для определения термолабильного энтеротоксина энтеробактерий (На рассмотрении в ГФК РФ, N3 от 06.01.95г.).
Проект ВФС и ЭПР на питательную среду для тестирования ДНК-азы энтеробактерий (На рассмотрении в ГФК РФ).
Данные, полученные в результате настоящих исследований, используются в учебном процессе: на ФУВ при Ростовском государственном медицинском университете на циклах "Бакте'>иология" и "Иммунология", при чтении лекций по спецкурсу "Инфекционная иммунология" и "Тропические болезни с основами иммунодиагностики" для студентов 4 и 5 курсов биолога -почвенногс факультета Ростовского государственного университета.
. Положения, выносимые на защиту:
-
Патогенность клебсиелл является не видовым признаком, а лабильной характеристикой штамма, выполняющего множественную патогенетическую функцию. Клебсиеллы способны к продукции ряда факторов патогенное, с различной частотой и интенсивностью, каждый из которых выполняет определенные функции и находится во взаимодействии друг с другом (Патент N1788965. 1777607; АС N5043033. N5043065. N5041189, N94018327. N94030872; N94030870).
-
В патогенезе острой кишечной клебсиеллезной инфекции определенную роль играют термолабильный энтеротоксин, фимбриальные адгезины I и III типов и липополисахарид,
Фимбрии I и III типов К.pneumoniae являются ответственными за адгезию. Их участие в адгезивном процессе реализуется через секретиру-. емые адгезины. обеспечивающие связывание мякроорганизма с клетками микроорганизма (Патент N1777607, А. С. N5043066).
Фимбриальные адгезины принимают участие в регуляции диарейного синдрома. Механизм регуляции опосредованный: адгезины стимулируют продукцию термолабильного знтеротоксина, активирующего образование аденн-латциклазы. которая через усиление синтеза циклического аденозинмоно-фосфата нарушает работу (Na*-Kf) насоса.
Липополисахарид является структурным фактором патогенности. активирующим процессы СР0, путем стимуляции образования АФК и подавлением активности ферментов антиоксидантной системы.
-
Совокупность определенных факторов патогенности определяет клинические формы и проявления инфекции. Выраженность отдельных симптомов заболевания зависит от интенсивности продукции определяющих их факторов патогенности (Патент N1707615).
-
Факторы патогенности К. pneumoniae индуцируют образование иммуноглобулинов и антител, секреторных и сывороточных.
-
У детей первого года жизни основными механизмами, участвующими в защите от инфекции, являются локальная иммунная защита и неспецифические факторы: фагоцитоз и процессы СР0. Процессы СР0 в динамике заболевания характеризуются фазностью, антибатными и компенсаторными изменениями показателей, отражающих сбалансированность системы А03-П0Л. Тяжесть течения и исход инфекции зависят от исходного состояния сбалансированности системы А03-П0Л и имеют решающее значение на первых этапах инфекции.
Процессы СРО являются одним из пусковых механизмов в сложной системе взаимодействия микро- и макроорганизма.
6. Факторы патогенности К. pneumoniae могут быть использованы п;,и
разработке препаратов для диагностики острых кишечных инфекций и направленного поиска средств лечения и профилактики (Патенты N18114768, N1742322, 17889656, 1777607; А. С. N93-052668, 5043066; Заявки на патент N94030871. пр. от 05.08794).
7. Б этиологической структуре острых кишечных инфекций детей первого года жизни доминируют условно-патогенные энтеробактерии, среди которых ведущими являются К. pneumoniae. Не все <чтаииы К. pneumoniae, выделенные из фекалий, являются истинными этиологическими агентами острых кишечных инфекций.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
VI Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитолога (Нижний Новгород, 1991); - Всероссийских конференциях и симпозиумах по проблемам: "Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний" (Звенигород, 1990); "Химия белка" (Тбилиси, 19Э0); "Бактериальные токсины" (Юрмала. 19В9); "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990, 1992, 1991);
Пленумах: Всероссийского научкот общества гастроэнтерологов (Ростов-на-Дону, 1991, 1995); Проблемной комиссии научного Совета по микробиологии АМН СССР по программе "Плазмида" (Нальчик, 1990) и "Генетика и молекулярная биология бактерий" (Москва, 1991);
Всесоюзных семинарах: "Клинико-лабораторные проблемы современной химиотерапии и профилактика инфекций" (19S0); Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" (1991);по современным методам диагностики соматических и инфекционных заболеваний (Ростов-на-Дону. 1991, Уфа, 1S92);
Международных симпозиумах, конференциях и конгрессах: "Нуклеаэы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1989); Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях" (Москва, 19Э2); lit) International Congress of immunoreabili-talion (Sochi, 1994); 7Ui International congress of Bacteriology ancf Applied Microbiology Division (Prague, 1S94);
Заседании Ростовского отделения микробиологического общества (1S9SK
По материалам диссертации опубликовано 69 работ, из них в центральной печати - 38, центральной периодичееккой - ,11, за рубежом - 4, получено 5 патентов и 8 положительных решений на выдачу патентов, 2 рацпредложения отраслевого значения, 12 справок на штаммы, депонированные в Государственной коллекции; издано 3 методических документа; подготовлена НТД (ВФС и ЭПР) на 5 диагностичских препарата.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 398 страницах машинописного текста, включая иллюстрации из 65-ти таблиц и 76-ти рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания используемых