Введение к работе
Актуальность проблемы. Холерные вибрионы биовара эльтор, выделяемые из внешней среды, относятся к двум разным вариантам, один из которых способен вызывать эпидемии, тогда как второй эпидемически безопасен. В этой связи в системе эпидемиологического надзора за холерой важнейшее значение имеет как своевременное выделение штаммов холерного вибриона из различных объектов внешней среды, так и оценка их эпидемической значимости. В последние годы решению этих задач в значительной мере способствует использование полимеразной цепной реакции (ПЦР). Тем не менее, к моменту начала наших исследований не было информации об использовании в ПЦР видоспецифического генного маркера для идентификации вибрионов вида Vibrio cholerae. Основным же критерием эпидемически опасных штаммов V. cholerae 01 считалось присутствие в их геноме структурных генов ctxAB (или vctAB), кодирующих биосинтез холерного токсина [Гинцбург A.M. с соавт., 1987; 1988; Четина Е.В. с соавт., 1992; 1993; Подосинникова Л.С., 1993; Онищенко Г.Г. с соавт. 1996; Грижебовский А.Л., 1997; Балахонов СВ., 2000; Давыдова Н.А. с соавт., 1999; 2001], локализованных в геноме нитевидного фага СТХф [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996]
Однако гены ctxAB не могут использоваться в качестве единственной генетической метки эпидемически опасных штаммов, так как они не уникальны не только для возбудителя холеры, но и для вида V. cholerae. Так, указанные гены присутствуют в хромосоме 2,0-4,0% штаммов V.cholerae не 01/не 0139 серогрупп [Ломов Ю.М. с соавт., 1992; Москвитина Э.А. с соавт., 1992; Воронежская Л.Г., 1994; Said В. et al., 1995; Kaper J.B. et al., 1995; Chakrarjorty S. et al., 2000; Dalsgaard A. Et al., 2001;], а также у ряда штаммов другого вида V. mimicus [Kaper J.B. et al, 1986; Farugue S.M. et al., 1999; Boyd E.F. et al., 2000], которые не способны вызывать эпидемии холеры.
Более того, так как вирулентность возбудителя холеры полидетерминантна, наличие генов ctxAB в геноме V. cholerae не является достаточным условием для развития инфекционного процесса, поскольку у этого возбудителя имеются другие ключевые гены вирулентности, без
4 которых развитие активного инфекционного процесса при холере невозможно.
Отсутствие к началу нашей работы ПЦР-тест-системы, позволяющей идентифицировать вибрионы вида Vibrio cholerae и наиболее полно оценивать их эпидемический потенциал, послужило основанием для разработки комплексного ПЦР-анализа, дающего возможность выявлять в геноме изучаемых штаммов видоспецифический ген и ключевые гены вирулентности, без которых развитие холерной инфекции невозможно. В качестве видоспецифического нами был взят хромосомный ген hapA, кодирующий биосинтез растворимой гемагглютинин/протеазы (РГ/П) и присутствующий в хромосоме всех штаммов вида V. cholerae. Для получения более полной и объективной информации об эпидзначимости вибрионов в качестве генных маркеров вирулентности, кроме гена ctxA, были использованы гены tcpA и toxR. Основанием для их выбора служит тот факт, что оба гена относятся к ключевым генам патогенности. Продукт гена tcpA - основная субъединица токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА), которые обеспечивают колонизацию вибрионами тонкого кишечника человека, без чего развитие инфекции невозможно. Ген toxR обусловливает экспрессию генов ctxA и tcpA. Более того, комплексный ПЦР-анализ вибрионов позволит решить и другие задачи, связанные с большой вариабельностью генома холерных вибрионов. Так, ГЩР-тестирование основных генов вирулентности (ctxA, tcpA и toxR) среди штаммов, выделенных из различных регионов, будет служить основой для определения тактики и необходимого объема противохолерных мероприятий.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - комплексное ПЦР-тестирование штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров, выделенных из объектов внешней среды, от больных и носителей, на наличие в их геноме видоспецифического гена hapA и трех основных генов вирулентности (ctxA, tcpA, toxR) для их идентификации и оценки эпидемической значимости.
1. Определить возможность использования комплексной ПЦР, основанной на амплификации 4 генетических детерминант (видоспецифи-
чесного гена hapA и основных генов вирулентности - ctxA. tcpA и to.\R). для идентификации и оценки эпидемической значимости различных штаммов V. cholerae eltor.
2. С помощью комплексного ПЦР-анализа определить сходство и различие в наборе основных генов вирулентности в геноме штаммов V. cholerae eltor, выделенных на административных территориях Нижнего Поволжья с различным эпидемическим потенциалом.
З.С целью ретроспективного анализа эпидемиологической ситуации на территории Нижнего Поволжья, Дагестана и Туркменистана изучить распространенность генов ctxA, tcpA, toxR и hapA среди штаммов холерного вибриона, выявленных из различных источников в указанных регионах.
-
Провести ПЦР-тестирование штаммов V. cholerae eltor, лишенных гена ctxA, на присутствие в их хромосоме генов других токсинов: zot и асе.
-
Разработать мультиплексную ПЦР.
-
Изучить молекулярно-генетические особенности штаммов V. cholerae классического биовара, выделенных во время вспышки холеры в 1942 году.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Для идентификации и наиболее полной оценки эпидемической значимости штаммов V. cholerae eltor, выделенных от больных, носителей и из объектов внешней среды в благополучные и неблагополучные по холере годы разработан новый методический прием, основанный на выявлении с помощью ПЦР видоспецифического гена hapA и трех основных генов вирулентности ctxA, tcpA и toxR. Эффективность использования комплексного ПЦР-анализа для решения указанных задач доказана при тестировании 90 музейных штаммов холерного вибриона с различной эпидемической значимостью.
Установлено присутствие гена hapA в геноме всех изученных
штаммов, независимо от источника их выделения, что подтверждает его
стабильность и видоспецифичность. Штаммы, выделенные из объектов
внешней среды в период эпидосложнений, - гетерогенны по набору генов
вирулентности ctxA, tcpA, toxR. На основании их сочетания в геноме
ПЦР-тестируемых штаммов предложена следующая оценка их
эпидзначимости: а) штаммы с генотипом ctxA+ tcpA+ toxR+ - эпидемически опасны; б) штаммы с генотипом ctxA" tcpA" toxR' или ctxA" tcpA" toxR+ — эпидемически безопасны; в) штаммы с генотипом ctxA" tcpA+ toxR+ или
ctxA' tcpA'toxR1 - потенциально опасны.
Впервые получены сведения о распространенности генов ctxA, tcpA, toxR и hapA среди штаммов V. c/iolerae eltor, выделенных на территориях Нижнего Поволжья, Дагестана и Туркменистана, на основании которых впервые проведен ретроспективный анализ эпидсобытий, имевших место в этих регионах. В результате получены приоритетные данные о том, что высокий уровень вибрионосительства в Туркменистане был обусловлен тем, что около 40 % носителей были инфицированы нетоксигенными штаммами, имеющими гены tcpA (ctxA" tcpA+ toxR+), обеспечивающими продукцию основного фактора колонизации. Выявлено как сходство, так и различие в структуре генома штаммов V. cholerae, выделенных на трех административных территориях Нижнего Поволжья (Астраханская, Саратовская и Волгоградская область), отличающихся друг от друга эпидемическим потенциалом. Установлено, что существует определенная связь между эпидемическим потенциалом территории и набором генов вирулентности в штаммах, циркулирующих среди людей и во внешней среде. На модели вирулентных штаммов V. cholerae классического биовара впервые показано, что развитие эпидемического процесса при холере определяют не только ключевые гены патогенности, но и другие гены (гены ауксотрофности и hapA), мутации в которых приводят, видимо, к развитию нетипичной клинической картины и эпидемического процесса. Разработана мультиплексная ПЦР-система, позволяющая одновременно идентифицировать штаммы V. cholerae eltor и оценивать их эпидзначимость на основе определения видоспецифического гена hapA и трех генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR. Разработка указанной мультиплексной системы в значительной мере расширяет наши возможности при анализе структуры генома различных штаммов.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ По результатам работы составлено методическое пособие «Идентификация штаммов Vibrio cholerae и определение их эпидемической значимости с помощью ПЦР-анализа четырех генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR и hapA», которое одобрено Ученым Советом (протокол № 10 от 28 декабря 2001 г.) и утверждено зам. директора Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».
7 Депонированы в Российском коллекции патогенных бактерий "Микроб" 6 штаммов V. cholerae классического и эльтор бновара с различным набором основных генов патогенності! ctxA, tcpA, toxR и неодинаковой продукцией холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии - ключевых факторов патогенности. Указанные штаммы предназначены для использования в прикладных и фундаментальных исследованиях.
Получено разрешение о выдаче патента на изобретение по заявке № I 200 112 1037/13 с приоритетом от 26 07.2001 «Штамм бактерий V. cholerae КМ200 - продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии».