Введение к работе
Актуальность проблемы. Для производства нитрагина необходимы штаммы клубеньковых бактерий высокой специфичности, вирулентности, эффективности, конкурентной способности. Поэтому вопрос о быстром и надежном методе отбора таких штаммов имеет значение в проблеме снмбнотнче-ской азотфиксацин. Уровень и интенсивность процесса сим-биотической азотфиксацин определяется во многом использованием активных штаммов, которые способствуют также и улучшению качества белков бобовых культур. Определение критериев эффективности, позволяющих отличить активные штаммы от неактивных и малоактивных как в чистой культуре, так и симбиозе имеет большое значение для отбора и селекции штаммов высокой эффективности. В связи с этим, а также учитывая, что достоверных критериев эффективности клубеньковых бактерий, несмотря на проведение большого количества исследований, до сих пор не выявлено, мы считали необходимым изучить метаболизм бобовых растений в симбиозе с клубеньковыми бактериями разной степени эффективности с тем, чтобы выявить закономерности или особенности обмена, которые могли бы быть использованы при отборе эффективных штаммов клубеньковых бактерий.
Цель и задачи исследований. Цель работы — выявление показателей влияния ризобин разной степени эффективности на метаболизм растения-хозяина. Задачи исследования — найти простые и надежные косвенные критерии в результате сравнительного изучения в растениях эффективного и неэффективного симбиоза ряда метаболитов, в частности тех, которые связаны с азотфиксирующей активностью ризобий, а именно: 1) установить характер накопления алкалоидов растениями люпинов; 2) способность последних синтезировать лизин и триптофан; важно было также получить дополнительную информацию о зависимости биосинтеза аминокислот н алкалоидов в бактеризованных растениях люпина; 3) изучить содержание общего фосфора у растений люпинов и гороха в динамике; 4) выявить акустическим методом воз-
Центр, научазя гёл::огаа f '
Кося. о?д. йо!;;;::а фздьш. ікад. га. К, L Tjcaeiua
можные различия по леггемоглобину в водных вытяжках разных по активности клубеньков растений люпина, кормовых бобов и гороха.
Научная новизна результатов. Впервые у растений люпинов эффективного симбиоза установлено повышение содержания алкалоидов в тканях растения-хозяина и предложено использование этого показателя для оценки эффективности рпзобнн. Выявлены зависимости между синтезом аминокислот и алкалоидов it бактеризованных растениях л(*пнна и уровнем синтеза алкалоидов от степени эффективности штаммов ризобнй. Подтверждена гипотеза об образовании лулнно-вых алкалоидов из лизина я триптофана. Показано снижение процентного содержания общего фосфора в бобовых растениях при инокуляции их эффективными клубеньковыми бактериями по сравнению с неэффективными. Впервые, используя высокочувствительный импульсный метод переменного расстояния, в водных вытяжках клубеньков обнаружена корреляция между азотфикспрующей активностью штаммов ризобнй п акустическими параметрами — скоростью и коэффициентом поглощения ультразвука.
Практическая ценность работы. При оценке активности клубеньковых бактерий люпина рекомендуется определять алкалоиды в надземной массе в фазу цветения люпина. Явление накопления разного количества алкалоидов в растениях люпина одного сорта при заражении различными по активности штаммами клубеньковых бактерий следует учитывать при селекции безалкалоидных сортов люпина. Повышенное (в 2 раза) содержание лизина и триптофана в надземной массе растений люпина, процентное содержание общего фосфора в надземной массе бактеризованных растений и определение скорости и коэффициента поглощения ультразвука (акустических характеристик) высокочувствительным импульсным методом переменного расстояния в клубеньках бобовых растений в фазы бутонизации и цветения предлагается для предварительной оценки эффективных клубеньковых бактерий при отборе производственных штаммов в качестве косвенных критериев эффективности.
Апробация работы. Результаты работы доложены на научной конференции молодых ученых ТСХЛ (7—10 июня 1977 г.), на 2 рабочем совещании по проблеме биологической азотфик-сации, организованном Научным советом по проблеме молекулярной биологии и Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР в г. Пушино на Оке (11 —13 октября 1979 г.), а также на заседаниях кафедры микробиологии ТСХА.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи.
Объем работы. Диссертация состоит из ПО страниц машинописного текста, 15 таблиц, 2 рисунков. Список литературы содержит 2IG наименований, и т. ч. 51 зарубежных авторов. Приложение включает 1о таблиц.
Объекты и методы исследовании
Растения люпина желтого сортов Быстрорастущий 4 н Академический 1, люпина узколистного сорта Немчиновскнй 846, гороха сорта Рамонский 77, кормовых бобов сорта Хсрц ФреІія выращивали в симбиозе с клубеньковыми бактериями разной степени эффективности. Для инокуляции использовали эффективные (эф.) и неэффективные (неэф.) штаммы клубеньковых бактерий коллекции культур ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин Ленинградской области): Rhizobium lupini — штаммы 359а (эф.),, 363а (эф.), 306а (эф.) н 400 (неэф.), Rh. leguminosarum— штаммы 245а (эф.), 2246 (неэф.), 96 (эф. для кормовых бобов), Rh. meliloti — штамм 87 (эф. для люцерны, слабоэффектнвный для кормовых бобов).
Проростки шюкулировали из расчета 20—30 тыс. клеток ризоблй на 1 семя; норму тюкуляшш определяли методом посева. Растения люпинов, гороха и кормовых бобов выращивали в 12 вегетационных опытах (Журбкцкий, 1968) в Лаборатории искусственного климата ТСХЛ и на Опытной станции полеводства ТСХЛ в сменных водных (8 опытов) и песчаных культурах (4 опыта) на среде Кнопа. Уровень азота снижен до 0,25 нормы. Предварительно семена растений стерилизовали (Nutman, 1949) и проращивали в термостате. Повтор-ность опытов 10—16-кратная. Об эффективности рнзобнй в симбиозе судили по содержанию общего азота (определяли методом Кьельдаля),- а также по продуктивности растений с проведением математической обработки (Доспехов, 1972).
Алкалоиды определяли нефелометрнческим методом в модификации В. Ф. Бойко (Методика Государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур, 1970) в 4-кратной попторностн; лизин — согласно методике микробиологического определения аминокислот в кормах, тканях животных и продуктах обмена (Томмэ, Скоркин, 1969); триптофан.—но методу Ермакова с соавт. (1972); общий фосфор—методом К. Е. Гинзбург, Г. М, Щегловой (1960); леггемоглобіні — спектральным методом {Мелнк-Саркнсян с соавт., 1975) в Институте биохимии им. А. Н. Баха АН СССР под руководством С. С. Мелнк-Саркнсян. Акустические исследования в водных вытяжках, подготовленных « соответствии с методом Е. А. Федорова (1955), и в леггемоглобиновых фракциях проводили с помощью ультразвуковой импульсной установки на кафедре физики ТСХА (Белинская с соавт., 1972).