Введение к работе
Актуальность проблемы. Азотфиксация (АФ) является важнейшим звеном в глобальном цикле азота и наряду с фиксацией углекислоты обеспечивает продуктивность биосферы в целом. Многие природные экосистемы лимитированы по доступным соединениям азота, что придает процессу азотфиксации особое значение в круговороте биогенных элементов. Традиционно основное внимание исследователей было направлено на изучение симбиотической азотфиксации в связи с ее значимостью для сельского хозяйства. Однако за последние годы было убедительно показано, что диазотрофия широко распространена среди прокариот, и микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, присутствуют практически во всех экосистемах, не связанных с агрокультурой (Zehr, 2003). Именно способность к азотфиксации дает возможность прокариотам существовать в эконишах с крайне низким содержанием азота, а также обогащать окружающую среду азотными соединениями.
Исследования процесса азотфиксации в засоленных почвах выполнены главным образом, в таких странах как Пакистан, Индия, Египет, где большие территории возделываемых земель подвержены засолению (Rai, 1991; Zahran et al., 1995; Abd-Alla, 1999). Однако они не распространяются на почвы содовых солончаков, характерной особенностью которых является высокая щелочность. В нашей стране почвы содового засоления можно отнести к экзотическим местообитаниям за исключением Юго-Западной Сибири и Забайкалья. В то же время они представляют уникальный природный объект для изучения галоалкалофильных микроорганизмов - экологической группы, которая обладает рядом физиологических особенностей, обусловленных средой обитания. Изучение процесса азотфиксации важно также для агрономии, которая пытается решить проблемы увеличения плодородия в этих почвах.
В отличие от содовых солончаков, микроорганизмы содовых озер активно исследуются микробиологами в течение последних 10-15 лет (Жилина и др., 2001, 2005; Jones et al., 1998; Baumgarte, 2003; Sorokin and Kuenen, 2005). Благодаря исследованиям, выполненным сотрудниками ИНМИ РАН, получена достаточно полная картина основных компонентов галоалкалофильного сообщества и их взаимодействий (Заварзин и др., 1999). В то же время, сведения о процессе АФ и составе диазотрофных сообществ в содовых местообитаниях остаются весьма ограниченными (Herbst, 1998; Steward et al., 2004).
В связи с изучение активности и биоразнообразия азотфиксирующих диазотрофов в почвах содовых солончаков, для которых характерно как высокое содержание солей, так и высокая щелочность, представляет научный и практический интерес. В контексте настоящей работы представлялось важным выяснить, существуют ли отличия в диазотрофной микрофлоре содовых солончаков от того, что известно для содовых озер.
Целью данной работы являлось изучение процесса АФ и характеристика диазотрофных микроорганизмов в почвах содового засоления. В задачи исследования входило:
Определение потенциальной АФ в содовых солончаках различной географической принадлежности.
Изучение влияния различных факторов на АФ микробных популяций содовых солончаков.
Выделение и исследование накопительных культур азотфиксирующих бактерий из образцов содовых солончаков.
Выделение, характеристика и таксономическое описание чистых культур диазотрофов из содовых солончаков.
Изучение структуры диазотрофных сообществ в накопительных культурах методом молекулярного анализа гена nifH.
Научная новизна. Впервые установлено наличие потенциальной способности к АФ в почвах содового засоления различных географических регионов. С помощью культуральных и молекулярных методов установлено преобладание в диазотрофных накопительных культурах, выделенных при рН 10, грамположительных бактерий с низким ГЦ, относящихся к бациллам и сульфидогенным клостридиям. Из содовых солончаков Центральной Азии и Египта выделены 11 чистых культур галоалкалофильных азотфиксирующих бацилл РНК групп 1 и 6, в которых АФ не была известна. На основании физиологических и филогенетических признаков восемь изолятов описывается как новый род и новый вид "Natronobacillus azotifixans", два изолята классифицированы как новый вид "Amphibacillus diazotrophicus" и один изолят как новый вид "Bacillus alkalidiazotrophicus". Все выделенные чистые культуры являются облигатными бродилыциками, рост и АФ активность которых возможны только в щелочных условиях с оптимумом рН 9-10. АФ активность клеток подавлялась уже умеренными концентрациями солей натрия (> 2 М Na ). Практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют о том, что, при наличии благоприятных условий (увлажнение и частичное рассоление) содовые солончаки могут осуществлять одну из важнейших функций плодородных почв -фиксацию атмосферного азота.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2005, Москва, Россия; III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2007, Москва, Россия; Second International
5 Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (MicroBioWorld), 2007, Севилья, Испания.
Публикации. Основные материалы, обсуждаемые в диссертации, содержатся в 2 статьях и 3 тезисах конференций. 2 статьи сданы в печать.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, описания методов и объектов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Текст включает 98 страниц, 13 таблиц, 22 рисунка; список литературы включает 138 наименований, из них 13 на русском и 125 на английском языке. Место проведения работы и сотрудничество. Микробиологическая часть работы выполнялась в Институте микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН под руководством к.б.н. И.К.Кравченко. Молекулярно-биологическая часть работы выполнена в Центре «Биоинженерия» РАН при содействии к.б.н. Е.С.Булыгиной. Образцы содовых солончаков были собраны как в ходе собственной экспедиции в Кулундинскую степь, так и предоставлены д.б.н. Д.Ю.Сорокиным.
Молекулярный анализ гена nifH был выполнен в сотрудничестве с к.б.н. Е.С.Булыгиной и асп. Е.В. Задориной, сиквенс-анализ генов 16S-rRNA- с к.б.н. Т.В. Колгановой. Филогенетический анализ был выполнен к.б.н. Т.П.Туровой, ДНК-ДНК гибридизация - к.б.н. A.M. Лысенко, анализ жирных кислот - д.б.н. Г.А. Осиповым. Автор выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы.