Введение к работе
Актуальность. Проблема острых кишечных инфекций бактериальной природы сохраняет актуальность до настоящего времени как в нашей стране, так и за рубежом (Хазенсон Л.Б., 1987; Касьяненко A.M., 1988; Шаханина И.А.,1996; Donnenberg M.S., 1989). По данным ВОЗ ежегодно регистрируется от 68,4 млн. до 275 млн. диарейных заболеваний взрослых и детей, в нашей стране этот показатель доходит до 2 млн. случаев ОКИ в год (Покровский В.И.,1993).
В спектре возбудителей острых кишечных инфекций существенный удельный вес имеют Escheichia coli (Шаханина И.А.,1996).В общей сумме кишечных инфекций у детей раннего возраста этот показатель по данным разных авторов составляет от 29,4% до 81,4% (Садыков М.Ш.,1991; Молочаєва И.С.,1991; Szirok Е.,1983; Law D.,1992; Vergara М., 1992), причем в 18% случаев эшерихиозы выявляются среди ОКИ неустановленной этиологии (Покровский В.И.,1993).
Диагностика кишечных эшерихиозов основывается на выделении возбудителей из испражнений; принадлежность к патогенным E.coli определяют на основании идентификации О-серогруппы или ОН-серовара (Голубева И.В.,Киселева Б.С.,1985). Хотя и выявляется определенная связь пато-генности с принадлежностью эшерихий к той или иной серогруппе, прямой зависимости не существует. Вьщеление, например, от больных энтеритом эшерихий определенных серогрупп еще не является доказательством их этиологической роли в развитии кишечного заболевания (Szirok Е.,1983). Отсутствие четкой связи между серогруппой (сероваром) и определенным механизмом взаимодействия эшерихий с кишечным эпителием, макроорганизмом в целом, ставит перед исследователями задачу выявления диагностически значимых биологических свойств возбудителя (тесно связанных с их патогенным потенциалом) с целью дифференциации возбудителей от нормальной или сопутствующей микрофлоры (Голутва Н.К.,1988; Покровский В.И.,1993; Шаханина И.А.,1996; Lira G.S.,1992). Выполнение этой задачи включает тщательную фенотипическую и генотипическую идентификацию представителей вида Escherichia coli и выявление их маркеров
вирулентности. С этих позиций актуальным является изучение метаболических особенностей, профилей антибиотикоустойчивости и их связи с адгезивными и персистентными характеристиками возбудителей кишечных эшерихиозов.
Цель настоящей работы заключалась в комплексном изучении диагностически значимых биологических свойств эшерихий патогенных серогрупп, относимых к возбудителям кишечных эшерихиозов.
В ходе исследования решались следующие задачи:
-
Изучить с использованием различных моделей адгезивную активность возбудителей кишечных эшерихиозов у представителей отдельных серогрупп и биоваров.
-
Определить уровни устойчивости эшерихий патогенных серогрупп к антибиотикам и механизмы ее генетического детерминирования.
-
Изучить уровни антилизоцимной и антикомплементарной активности, а также взаимосвязь антибиотикоустойчивости с персистентными характеристиками эшерихий патогенных серогрупп.
4. Разработать экономичный способ определения анти
комплементарной активности у возбудителей кишечных
эшерихиозов.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное сравнительное исследование биологических свойств возбудителей кишечных эшерихиозов и банальных эшерихий, выделенных из кишечника больных эшерихиозом и здоровых людей. С использованием клеточных моделей культуры ткани Нер-2 и эритроцитов человека изучена адгезивная активность эшерихий различного происхождения, что позволило установить существенные различия в индексах адгезии штаммов, выделенных от больных ОКИ и из кишечника
здоровых лиц. Впервые показано, что значение индексов адгезии эшерихии на эритроцитах зависит от принадлежности штаммов к серогруппе. При изучении чувствительности к 7 широко используемым антибиотикам у клинических штаммов эшерихии установлено преобладание множественноустойчивых штаммов, фенотип которых характеризовался наибольшим разнообразием количества и сочетания маркеров антибиотикоустойчивости. При изучении механизмов формирования высоких уровней антибиотикоустойчивости впервые проведено, сравнение средних геометрических уровней плазмидной и хромосомной устойчивости к ампициллину, аминогликозидам и тетрациклину у клинических штаммов эшерихии с аналогичными показателями эшерихии другого происхождения, что позволило установить существенные различия. Установлено широкое распространение признака выживания в нормальной человеческой сыворотке у эшерихии различного происхождения; у возбудителей кишечных эшерихиозов проявление этого признака контролируется хромосомными и плазмидными генами. При изучении роли плазмидного генома в устойчивости эшерихии к бактерицидному действию сыворотки крови впервые установлено, что у клинических штаммов показатель выживания зависит от содержания R-плазмид. Разработан и предложен новый экономичный способ определения антикомплементарной активности эшерихии, основанный на их способности к диффузному росту в полужидком питательном агаре. Изучена структура бактериальных популяций штаммов эшерихии различного происхождения по признаку антилизоцимной активности, что позволило выявить неоднородность популяций в зависимости от их уровней антибиотикоустойчивости. Впервые в структуре бактериальных популяций антибиотикоустойчивых возбудителей кишечных эшерихиозов показано преобладание клонов с более высокими уровнями антилизоцимной активности. При исследовании влияния различных концентраций пипольфена на стабильность наследования R-плазмид штаммами E.coli впервые отмечено элиминирующее действие пипольфена на собственные плазмиды клинических штаммов эшерихии патогенных серогрупп, гены
которых контролируют устойчивость к антибиотикам и действию нормальной сыворотки крови человека. Сравнительное исследование стабильности наследования R-плазмид в присутствии пипольфена и бромистого этидия позволило выявить различия в их действии на плазмиды некоторых штаммов.
Практическая значимость. На основе проведенных исследований разработаны методические рекомендации для врачей бактериологов "Определение антикомплементарной активности эшерихии культуральным методом", в которых предложено определять данный признак по разности диаметров зон диффузного роста эшерихии в полужидком питательном агаре с нативной и гретой сыворотками. Рекомендации внедрены в работу Муниципального учреждения здравоохранения г.Рязани "Диагностический центр" (акт внедрения от 15.01.97). Оформлено информационное письмо "Антибиотикоустойчивость энтеропатогенных и банальных эшерихии в зависимости от происхождения", внедренное в работу бактериологических лабораторий г.Рязани (акт внедрения от 20.04.95). Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, гигиены и экологии ФПДО РГМУ им. акад. И.П.Павлова. Данные об элиминирующем действии пипольфена на R-плазмиды эшерихии могут быть использованы для рациональной этиотропной химиотерапии кишечных эшерихиозов. Апробация работы и публикации. Материалы диссертации опубликованы в 5 работах. Результаты исследований доложены на 1-й международной компьютерной конференции "Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики заболеваний человека" (г.Тернополь, 1994), на 4-м научном заседании Европейского общества по химиотерапии инфекционных болезней человека (Афины, Греция, 1995), на заседаниях Ассоциации микробиологов Рязанской области (г.Рязань, 1996, 1997).
Положения, выносимые на защиту:
1. Сравнительная характеристика возбудителей кишечных
эшерихиозов и банальных эшерихий по адгезивной активности,
ферментативному профилю, чувствительности к
антимикробным препаратам и некоторым персистентным
свойствам позволяет выявить ряд диагностически значимых
признаков, характерных для патогенных эшерихий; наряду с
антигенными свойствами их можно рассматривать как маркеры
вирулентности возбудителей кишечных эшерихиозов.
2. Некоторые персистентные характеристики энтеропа-
тогенных эшерихий (показатель выживания в сыворотке крови,
антилизоцимная активность) более выражены у
антибиотикоустойчивых штаммов, что может быть связано с
наличием у них R-плазмид.
3. Разработанный культуральный метод позволяет проводить
определение антикомплементарной активности патогенных
эшерихий с меньшими затратами, по сравнению с известными
титрационными методами.
Структура н объем диссертации.
Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы ( 146 отечественных и 167 зарубежных источников), 2-х приложений. В тексте имеется 29 таблиц и 14 рисунков.