Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Характеристика труднокультивируемых возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания 12
1.1.1. Mycoplasma pneumoniae 13
1.1.2. Бактерии рода Chlamydophila
1.1.2.1. Chlamydophila pneumoniae 17
1.1.2.2. Chlamydophilapsittaci
1.1.3. Legionella pneumophila 22
1.1.4. Moraxella (Branhamella) catarrhalis 25
1.1.5. Вирусы группы герпеса 27
1.1.5.1. Herpes simplex I/II (HSVI/II) 27
1.2. Лабораторная диагностика заболеваний органов дыхания 33
1.2.1. Традиционные методы лабораторной диагностики, применяемые для выявления труднокультивируемых возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания 33
1.2.2. Современные молекулярно-биологические методы в диагностике бронхолегочных инфекций 39
Экспериментальная часть 46
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Объекты и объем исследований 46
2.2 Исследуемый материал 48
2.3. Выделение ДНК из исследуемого материала 49
2.4. Выделение ДНК из смеси субстратов 50
2.5. Постановка ПНР
2.7. Выявление продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле 51
2.8. Учет результатов электрофореза 51
2.9. Иммунологические исследования
2.10. Статистический анализ результатов 53
2.11. Нормативно-методические документы з
Глава 3. Выбор наиболее информативного субстрата для исследования на контаминированность Труднокультивируемыми возбудителями воспалительных заболеваний органов дыхания 55
Глава 4. Оптимизация способа пнр-детекции редко встречающихся возбудителей инфекций респираторного тракта и эффективность его использования 59
Глава 5. Частота обнаружения труднокулбтивируембіх возбудителей бронхолегочных инфекций у взрослых 78
Глава 6. Алгоритм молекулярной детекции
Труднокультивируемых возбудителей заболеваний органов дыхания 90
Перспективные направления дальнейшей разработки темы 107
Благодарности 108
Список сокращений 109
Список литературы по
- Бактерии рода Chlamydophila
- Современные молекулярно-биологические методы в диагностике бронхолегочных инфекций
- Статистический анализ результатов
- Перспективные направления дальнейшей разработки темы
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Инфекционные воспалительные болезни органов дыхания (БОД), включая внебольничные пневмонии (ВП), остаются актуальной проблемой современного здравоохранения. Они являются причиной большинства госпитализаций, на них приходится большое количество смертельных исходов. Так, согласно официальной статистике в Российской Федерации общее число больных пневмонией ежегодно превышает 1,5 миллиона, каждый год от пневмонии погибает более 40 тысяч человек, при этом наиболее высокая смертность регистрируется у мужчин трудоспособного возраста (Чучалин А.Г., 2006, 2010; Синопальников А.И., 2010, 2012; Онищенко Г.Г., Ежлова КБ., Демина Ю.В. с соавт., 2013). Отдельную проблему представляют БОД в закрытых воинских коллективах, где уровни заболеваемости превышают показатели среди гражданского населения в несколько раз (Жоголев С.Д., Огарков П.И., 2003).
Наряду с традиционными этиологическими агентами БОД (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, вирусами гриппа и др.) всё большее значение приобретают «атипичные», труднокультивируемые патогены, такие как Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila и др., а также вирусы группы герпеса {Cytomegalovirus (CMV), Herpes simplex I/II), роль которых в развитии респираторных инфекций и необходимость их индикации и идентификации отражена в новых нормативных документах: МУ 3.1.2.3047-13 «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями»; МУК 4.2.3115 -13 «Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний», СП 3.1.2.3116-13 "Профилактика внебольничных пневмоний". На фоне снижения иммунного статуса населения возрастает этиологическая роль этих возбудителей в формировании патологии органов дыхания (Вишнякова Л.А., 2005; Карапетян Т.А., 2008). По данным литературы на их долю приходится до 30 % случаев заболеваний респираторного тракта, при этом частота их выявления при различных нозологических формах у разных авторов существенно варьирует (Чучалин А.Г., 2006; Онищенко Г.Г. с соавт., 2013, 2014; Демина Ю.В., 2014; CunhaB.A., 2010; KurzH., 2011; Lui G., 2009).
Следует отметить, что указанные выше «атипичные» возбудители традиционными методами (бактериологическими, иммунологическими, серологическими) детектируются недостаточно надежно из-за особых требований к условиям культивирования, высокой антигенной изменчивости и т.д., поэтому, несмотря на значительные затраты времени и средств, в 30-70% случаев этиологический фактор установить не удается (Чучалин А.Г., 2008; Сао В., 2010). В этом плане полимеразная цепная реакция (ПНР), основанная на амплификации специфических фрагментов генома микроорганизмов, является ценным диагностическим инструментом, позволяющим выявлять инфекционные агенты в любом биологическом субстрате и совершенствующим диагностику как острых, так и хронических БОД. Использование метода ПЦР в клинической практике одобрено и рекомендовано рядом нормативных документов (МУК 42.3115-13
«Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний», СП 3.1.2.3116-13 "Профилактика внебольничных пневмоний"). Важно, что данный метод характеризуется высокой чувствительностью (100-1000 клеток или вирионов), экспрессностью (получение результата в течение 6-8- часов), прецизионной специфичностью (до 100%) (Шипулин Г.А., 2014; Dumke R., 2007).
Степень разработанности темы исследования. Значительный вклад в изучение роли труднокультивируемых микроорганизмов (С pneumoniae, С. psittaci, М. pneumoniae, L. pneumophila, CMV и др.) в развитии БОД внесли как отечественные - Синопальников А.И., 2006; Тартаковский И.С., 2010; Чучалин А.Г., 2010; Шахгильдян В.И., 2010 и др. так и зарубежные - Cunha В.А., 2010; Kurz Н., 2011; Lui G., 2009 и др. исследователи. В последние годы в диагностике заболеваний респираторного тракта широко используются молекулярно-биологические методы, главным образом, различные варианты ПЦР (Яцишина СБ., 2008; Gullsby К., 2008; Khanna М., 2005; Loens К., 2008 и др.). Разработаны, сертифицированы и производятся ПЦР-диагностикумы для выявления возбудителей инфекционных БОД.
Однако обследования обширных контингентов больных в зависимости от возраста и форм патологий органов дыхания на широкий спектр труднокультивируемых возбудителей с использованием метода ПЦР в Российской Федерации не проводились. До сих пор не определен наиболее информативный субстрат для исследования. Обычно исследуют различные биологические субстраты: образцы мокроты, мазков из зева, носоглотки, бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), плевральной жидкости, биопсийного материала (Cho М., 2012; Murdoch D.R., 2003), что затрудняет интерпретацию результатов и постановку точного диагноза.
Рост заболеваемости БОД, широкий спектр традиционных и «атипичных» возбудителей, генетическая изменчивость патогенов требуют широкого внедрения в лабораторную практику унифицированных молекулярно-генетических методов исследования для решения диагностических, клинических и эпидемиологических задач.
Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в оптимизации способа детекции труднокультивируемых возбудителей БОД {Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis), а также вирусов группы герпеса и оценке частоты их обнаружения в зависимости от возраста больных и нозологической формы заболевания.
В соответствии с поставленной целью работы решались следующие задачи:
-
Определить наиболее информативный биологический субстрат для ПЦР-диагностики труднокультивируемых возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания.
-
Создать эффективный и экономически оправданный способ ПЦР-детекции редко встречающихся труднокультивируемых возбудителей БОД.
-
Оценить частоту выявления М. pneumoniae, С. pneumoniae, С. psittaci, L. pneumophila, M.catarrhalis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II у детей разных
возрастных групп и взрослых (организованных и неорганизованных) с различными воспалительными заболеваниями респираторного тракта. 4. Разработать оптимальный алгоритм молекулярной детекции М. pneumoniae, С. pneumoniae, С. psittaci, L. pneumophila, М. catarrhalis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II у больных разных возрастных групп с воспалительными бронхолегочными заболеваниями.
Научная новизна. Впервые разработан способ ПЦР-детекции редко встречающихся труднокультивируемых микроорганизмов в различных биологических субстратах от детей и взрослых с бронхолегочной патологией (патент на изобретение №2406088 от 10.12.2010г. «Способ выявления редких и труднокультивируемых форм возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания {Cytomegalovirus, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis) с использованием метода ПЦР»).
Впервые проведено крупномасштабное обследование больных разных возрастных групп с различными бронхолегочными инфекциями на широкий спектр труднокультивируемых возбудителей бактериальной и вирусной природы с применением метода ПЦР.
Получены новые знания о частоте обнаружения отдельных видов труднокультивируемых микроорганизмов у детей разных возрастных групп и взрослых с различными нозологическими формами инфекционных заболеваний органов дыхания.
Впервые разработана новая медицинская технология «Комплексное ПЦР-обследование пациентов с инфекционно-аллергическими заболеваниями органов дыхания» (разрешение на применение ФС № 2009/084 от 21.04.09 г. Минсоцздрава РФ), позволяющая сокращать себестоимость исследования и повышать эффективность выявления инфекционных агентов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые знания о частоте обнаружения труднокультивируемых микроорганизмов при бронхолегочных заболеваниях, которые могут явиться дополнительным вкладом в изучение этиопатогенеза и развития инфекционного процесса БОД.
Показано, что частота выявления труднокультивируемых микроорганизмов - возбудителей БОД - зависит от вида возбудителя, контингента и возраста обследуемых лиц, нозологической формы заболевания.
Разработанный способ ПЦР-детекции труднокультивируемых возбудителей БОД позволяет повысить эффективность и достоверность диагностических исследований, уменьшить их продолжительность и снизить стоимость в 3,8 - 7,6 раза.
Установлено, что идентификация «атипичных» микроорганизмов в режиме сопровождения лечебного процесса способствует оперативной коррекции антибактериальной и иммуномодулирующей терапии, позволяет сократить сроки пребывания больного в стационаре.
Разработанный способ выявления труднокультивируемых возбудителей заболеваний органов дыхания, защищенный патентом №2406088, внедрен в
диагностическую работу ряда лечебных учреждений г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области.
Результаты выполненного исследования использованы при разработке медицинской технологии «Комплексное ПНР-обследование пациентов с инфекционно-аллергическими заболеваниями органов дыхания» (Разрешение на применение медицинской технологии ФС № 2009/084 от 21.04.09 Минсоцздрава РФ), методических рекомендаций «Выявление редких труднокультивируемых форм возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания с использованием метода ПНР» (MP 4.2.0060-12, 2012 г.), методических рекомендаций «Алгоритм выявления широкого спектра возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания» (рекомендованы для использования на региональном уровне письмом Роспотребнадзора №01/8010-12-26 от 18.07.2012).
Положения, выносимые на защиту:
-
Способ ПЦР-детекции редко встречающихся труднокультивируемых микроорганизмов, основанный на применении метода «двойных минипулов», позволяет осуществлять диагностически и экономически оправданный скрининг больных с разными типами патологии респираторного тракта, сокращает стоимость и продолжительность диагностических исследований.
-
Нозологическая форма болезней органов дыхания, контингент и возраст обследуемых лиц, видовые особенности возбудителя определяют частоту выявления труднокультивируемых инфекционных агентов - возбудителей заболеваний респираторного тракта.
-
Доминирующими возбудителями в этиологической структуре болезней органов дыхания из числа труднокультивируемых микроорганизмов являются у детей - M.pneumoniae, у взрослых - М.рпеитопіае и С.рпеитопіае.
Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается достаточным объемом выборки анализируемых групп, большим количеством проведенных исследований (исследованы пробы различных клинических субстратов от 1841 пациента с бронхолегочной патологией и 449 лиц групп сравнения, проведено 31843 ПЦР-исследования), использованием сертифицированных молекулярно-генетических, иммунологических методов, которые характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью.
Апробация работы. Диссертация апробирована на совместном заседании Ученого совета и Межлабораторного научного семинара ФБУН «ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора (Протокол № 8 от 30.10.14 г.). Результаты работы доложены и обсуждены на VII Российском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней», Г.Н.Новгород, 2006г.; Втором Всероссийском форуме «Здоровье нации - основа процветания России», г. Москва, 2006г.; научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной, Г.Н.Новгород, 2006г.; IV Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика», г. Москва, 2007г.; Юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского
НИИЭМ им. академика И.Н.Блохиной, г. Н.Новгород, 2009г.; научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения», г. Н.Новгород, 2011 г; V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, г. Москва, 2013 г.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования осуществлялись в рамках отраслевых программ: «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в РФ на 2006-2010 гг.» (раздел НИР «Изучение распространения и особенностей циркуляции атипичных и труднокультивируемых возбудителей воспалительных и инфекционно-аллергических заболеваний дыхательной системы» (№ гос. регистрации 01200612239)) и «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» на 2011-2015гг. (техническое задание от 11.01.2011г. «Изучение персистенции вирусов группы герпеса (I, II, III, IV, V, VI, VII типов) и бактерий рода Mycoplasma у детей с использованием молекулярно-генетических методов. Разработка алгоритма мониторинга активной репликации герпесвирусов у детей различных возрастных групп» (№ гос. регистрации 01201175712)). Один из разделов работы выполнялся в рамках задания Министерства обороны РФ «Исследование особенностей эпидемиологии и течения внебольничных пневмоний у военнослужащих на современном этапе» (2003-2007гг.).
Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в выполнении молекулярно-генетических исследований, теоретическом обобщении результатов, статистической обработке данных. Соискатель в соавторстве разработал медицинскую технологию (разрешение на применение медицинской технологии ФС № 2009/084), методические рекомендации MP 4.2.0060-12, методические рекомендации «Алгоритм выявления широкого спектра возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания» (письмо Роспотребнадзора №01/8010-12-26 от 18.07.2012). Полученные соискателем результаты послужили основой для разработки и получения патента на изобретение №2406088.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, среди них 5 - в рецензируемых изданиях; 8 - в материалах конференций, съездов, форумов; 1 - патент на изобретение; 1 - медицинская технология; 1 -методические рекомендации.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, перспективных направлений дальнейшей разработки темы, списка сокращений и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 8 таблицами. Список литературы содержит 200 источников, из них 20 отечественных и 180 зарубежных.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю - д.м.н., профессору Е.И. Ефимову за внимательное отношение к
работе, плодотворное обсуждение полученных результатов и всестороннюю помощь, а также д.б.н., доценту В.Н. Мазепе, под научным руководством которого были начаты и проводились исследования, послужившие основой данной работы. Особо автор благодарит заведующую лабораторией метагеномики и молекулярной индикации патогенов к.м.н., доцента Н.Ф. Бруснигину за неоценимую помощь в написании диссертации и поддержку, а также всех сотрудников лаборатории за помощь в проведении экспериментов. Автор признателен заместителю директора по научной работе ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной д.б.н., профессору Г.И. Григорьевой за ценные идеи; к.м.н., доценту кафедры госпитальной терапии им. В.Г. Вогралика ГБОУ ВПО НижГМА И.С. Добротиной за научные консультации; д.м.н., профессору В.Ю. Талаеву за проведение совместных исследований, а также сотрудникам лабораторий клеточной иммунологии и иммунохимии ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной. Благодарность выражается всем сотрудникам ЛПУ, принимавшим участие в проведении данных исследований и внедрении их результатов.
Бактерии рода Chlamydophila
В настоящее время существенное место в этиологии инфекционных заболеваний органов дыхания принадлежит группе труднокультивируемых микроорганизмов (облигатных и факультативных внутриклеточных паразитов), устойчивых к Р-лактамным антибиотикам: С. pneumoniae, С. psittaci, С. trachomatis, М. pneumoniae, L. pneumophila и др. В частности, на их долю суммарно приходится от 8 до 30% случаев внебольничных пневмоний (ВП). Этиологическая роль данных возбудителей в развитии респираторных инфекций и необходимость их индикации и идентификации отражена в новых нормативных документах: МУ 3.1.2.3047-13 «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями»; МУК 4.2.3115 -13 «Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний», СП 3.1.2.3116-13 "Профилактика внебольничных пневмоний".
Этиологическая расшифровка болезней органов дыхания (БОД), включая пневмонии - одна из существенных проблем диагностики в связи с использованием различных субстратов и методов исследований, сложностью интерпретации результатов, недостаточной чувствительностью классических бактериологических методов. Уровень диагностических ошибок при ВП достигает 40%. Возрастающие темпы роста заболеваемости БОД, широкий спектр как традиционных, так и «атипичных» возбудителей, генетическая изменчивость патогенов, увеличение численности иммуннокомпроментированных лиц (люди пожилого и старческого возраста, больные диабетом, онкологическими заболеваниями, получающие кортикостероиды и иммунодепрессанты), сложность этиологической структуры и многофакторность развития эпидемического процесса при БОД требуют широкого внедрения в лабораторную практику молекулярно-генетических методов исследования для решения диагностических, клинических и эпидемиологических задач.
По данным литературы ведущим возбудителем БОД из числа труднокультивируемых является Mycoplasma pneumoniae [54, 58, 62, 82, 172]. M. pneumoniae - уникальная безусловно-патогенная бактерия представитель класса Mollicutes, порядка Mycoplasmatales, семейства Mycoplasmataceae, наиболее известная как возбудитель респираторного микоплазмоза. Микроорганизм был открыт М. Eaton в 1944 году и долго фигурировал под названием «агента Итона». Считали, что это вирус, так как он проходил через бактериальные фильтры и не культивировался на обычных питательных средах. Лишь в 1962 г. «агент Итона» получил статус одного из видов микоплазм [13].
М. pneumoniae, как и все микоплазмы, отличается мельчайшими размерами. Объем ее клетки составляет менее 5% от среднего объема клетки типичных бактерий. Небольшие размеры не позволяют обнаруживать М. pneumoniae с помощью световой микроскопии, по этой же причине возбудитель не вызывает помутнения жидких питательных сред. Типичные колонии М. pneumoniae редко превышают 100 мкм в диаметре и требуют изучения их морфологии под стереомикроскопом. М. pneumoniae, располагая минимальным для клеток количеством генетического материала (её ДНК примерно в пять раз меньше, чем у Escherichia coli), обладают ограниченными биосинтетическими возможностями, поэтому их приходится культивировать на сложных питательных средах, обогащенных предшественниками нуклеиновых кислот, белков и липидов [13,186].
Микоплазмы не имеют возможности синтезировать пептидогликан клеточной стенки, так как в их геноме нет генов, ответственных за этот процесс. Отсутствие регидной клеточной стенки обусловливает плеоморфизм клеток, что делает невозможным отнести их ни к коккам, ни к палочкам. Это же свойство обеспечивает резистентность микоплазм к антибактериальным препаратам, подавляющим синтез клеточной стенки, прежде всего к пенициллину и другим Р" лактамам [14].
Другой характерной особенностью М. pneumoniae, как и всех представителей рода Mycoplasma, является потребность в стеролах (холестерине и его производных). В инфицированных тканях микоплазмы добывают стеролы непосредственно из клеточных мембран, внедряясь в их структуру или даже сливаясь с ними. Это свойство относит микоплазм к «мембранным паразитам» и наделяет их способностью к длительной персистенции в организме хозяина, позволяя таким образом «ускользать» от фагоцитоза [13, 14].
М. pneumoniae передается преимущественно воздушно-капельным путем, источником инфекции является человек. Инфицированию способствует скученное размещение людей, находящихся в закрытых и полузакрытых организованных коллективах (семья, школа, воинский контингент) [54, 62]. С помощью культуральных и молекулярно-биологических методов установлено длительное бессимптомное носительство М. pneumoniae, что также способствует распространению возбудителя [65].
Исследования, проводимые в Северной Америке и Европе, показали, что заболеваемость респираторным микоплазмозом носит цикличный характер. Ее повышение регистрируется каждые 3—5 лет [65, 113].
Хотя заболеваемость респираторным микоплазмозом не имеет ярко выраженного сезонного характера, в умеренных климатических условиях доля больных с микоплазменной внебольничной пневмонией больше летом за счет низкой распространенности других респираторных патогенов в это время [147]. Вспышки респираторных заболеваний, вызванных М. pneumoniae, обычно бывают летом или в начале осени [60].
М. pneumoniae является этиологическим агентом до 40% и более случаев внебольничной пневмонии у детей, из них как минимум 18% случаев требуют госпитализации [58, 62, 82, 90, 185]. Несмотря на то, что М. pneumoniae не считается неонатальным патогеном, D. Ursi с соавторами обнаружили с помощью ПЦР М. pneumoniae в назофаренгиальном аспирате младенцев с врожденной пневмонией и предположили, что в данном случае не исключалась трансплацентарная передача возбудителя [181].
Несмотря на то, что большинство случаев инфицирования М. pneumoniae взрослых носит легкий или бессимптомный характер, М. pneumoniae является важной причиной бактериальной пневмонии у взрослых. Исследования, проводимые в Израиле и Китае среди госпитализированных взрослых с внебольничной пневмонией, показали схожие результаты. По их данным М. pneumoniae ответственна за 29% случаев заболеваний, являясь первым (Китай) или вторым после S. pneumoniae (Израиль) по частоте патогеном [38, 147] . По данным Templeton К.Е. с соавторами (Нидерланды) М. pneumoniae обнаруживалась с помощью МАНК у 12% взрослых с инфекциями нижних дыхательных путей [172]. Французские исследователи детектировали М. pneumoniae методом ПНР у 7,3% взрослых с внебольничной пневмонией и у 2,3% - с острым бронхитом [66].
При респираторном микоплазмозе инфекционный процесс, как правило, ограничивается острым катаром верхних дыхательных путей (фарингит, ларингофарингит, трахеит). S. Esposito с соавторами установили острую М. pneumoniae - инфекцию у 44 из 184 детей с нестрептококковым фарингитом [59]. При микоплазменной инфекции реже поражаются глубокие отделы респираторного тракта (бронхит, пневмония), но и в таких случаях интоксикация обычно бывает умеренной, симптомы нарастают медленно, часто сохраняясь на протяжении нескольких недель и даже месяцев. Больных беспокоят боль в горле, охриплость, лихорадка, кашель - вначале непродуктивный, а позднее с малым количеством мокроты, головная боль, миалгии [13, 62]. Нередко больные переносят заболевание на ногах (отсюда термин «ходячая пневмония»). Как упоминалось ранее, М. pneumoniae может быть причиной тяжелой, требующей госпитализации пневмонии, особенно у детей младше 5 лет и пожилых лиц [50, 147, 185].
Современные молекулярно-биологические методы в диагностике бронхолегочных инфекций
В 1983 г. в США от больного фарингитом был выделен инфекционный агент, который оказался идентичным выделенному от ребенка с трахомой в 1965 г. на Тайване атипичному хламидийному штамму. Все последующие изоляты были получены от больных с заболеваниями респираторного тракта (пневмонией, бронхитом, синуситом, фарингитом и др.), среди которых было выявлено немало лиц с антителами против вновь обнаруженных хламидий. Последние получили рабочее название TWAR (The Taiwan Acut Respiratory agent), а в 1989 J.Т. Grayston предложил видовое название - Chlamydia pneumoniae, подчеркивающее важность данного вида хламидий в патологии легких человека [73]. По современной классификации семейство Chlamydiaceae включает два рода, собственно Chlamydia и новый род Chlamydophila, в который перешли виды Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci и Chlamydia pecorum. С. pneumoniae - облигатный внутриклеточный грамотрицательный микроорганизм. Таксономическую самостоятельность С. pneumoniae подчеркивает наличие видоспецифического антигена и слабое генетическое родство (всего 10% гомологии ДНК) с другими хламидиями. С. pneumoniae, подобно вирусам, не культивируются на искусственных питательных средах. Зависимость хламидий от клеток хозяина объясняется их неспособностью синтезировать аденозинтрифосфат, в связи с чем их называют «энергетическими паразитами». Для хламидий характерен плеоморфизм, который возникает в ходе репликативого цикла и отражает взаимопревращения двух основных морфофункциональных элементов хламидий - элементарных и ретикулярных тел. Элементарные тела имеют размеры 0,2-0,3 мкм в диаметре (отсюда вирусоподобная фильтруемость хламидий) и обеспечивают выживание во внеклеточной среде и заражение новых клеток, ретикулярные тела крупнее (0,8-1,5 мкм) и посредством деления обеспечивают репродукцию хламидий. Элементарные тела С. pneumoniae имеют не шаровидную, как у других видов хламидий, а копьевидную форму, что имеет значение для развития инфекции, т.к. заостренным концом элементарные тельца прикрепляются к эпителиальным клеткам [7, 13, 73].
Источником инфекции С. pneumoniae является человек, больной или носитель. Возбудитель передается воздушно-капельным путем. [13].
С. pneumoniae и обусловленные ими заболевания широко распространены во всем мире. В разных странах 40-80% взрослого населения имеет специфические антитела [1, 13]. Они достаточно редко обнаруживаются у детей дошкольного возраста. К 20 годам половина населения в США имеет детектируемый уровень антител к С. pneumoniae, а у пожилых лиц антитела присутствуют у 75% [174]. Пневмония и бронхит являются наиболее частыми нозологическими формами заболеваний, связанных с С. pneumoniae, хотя бессимптомных и клинически невыраженных случаев инфекции гораздо больше. По данным Бартлетт с соавторами, С. pneumoniae является причиной 25% случаев респираторных заболеваний, включая до 10% случаев внебольничных пневмоний, 5% случаев острых и хронических бронхитов и синуситов, 2% фарингитов [1].
Результаты ряда исследований, проведенных за последние 10 лет, о частоте выявления С. pneumoniae при заболеваниях нижних отделов респираторного тракта в различных возрастных группах представлены в таблице 1.
Инкубационный период при С. pneumoniae - инфекции более продолжительный, чем при заболеваниях, ассоциированных с другими респираторными патогенами и составляет 2-3 и более недель [25, 33]. Пневмония, обусловленная С. pneumoniae, принадлежит к «атипичным» пневмониям и клинически неотличима от других инфекций подобного типа, .характеризуется вялым началом заболевания, отсутствием лейкоцитоза, умеренным повышением температуры, непродуктивным кашлем. При внешне бедной симптоматике хрипы в легких прослушиваются. Рентгенография грудной клетки обычно демонстрирует менее обширные инфильтраты, чем при типичной пневмонии, хотя бывает и обратное. Так же, как микоплазменную пневмонию, многие больные переносят на ногах. Однако выздоровление нередко идет медленно, кашель и слабость иногда сохраняются несколько недель и даже месяцев, и даже, несмотря на этиотропную антибиотикотерапию (тетрациклины, макролиды), возможно длительное бактерионосительство [78, 174, 193].
Как и при других хламидиозах, возможно длительное персистирование С. pneumoniae в организме с развитием хронической инфекции в виде бронхиальной астмы, хронического обструктивного бронхита, эмфиземы легкого [2, 3, 77]. Предполагается, что продукция специфических IgE к С. pneumoniae играет роль в развитии бронхиальной астмы [77]. Исследования с помощью ПЦР и выявление IgA (как маркера хронической инфекции) показали присутствие возбудителя в большинстве случаев хронической легочной инфекции [94].
P. Saikku с соавторами сообщают, что С. рпеитопіае-инфєкция существенно повышает риск развития хронической коронарной болезни и острого инфаркта миокарда [156]. Сероэпидемиологические исследования, проведенные в США, подтвердили корреляцию между содержанием антител к С. pneumoniae и атеросклеротическим поражением коронарных артерий [72]. Известны случаи миокардитов, вызванных С. pneumoniae [44, 68]. Имеются сообщения о тропизме С. pneumoniae к нервной ткани in vitro [35]. Прицельные поиски позволили обнаружить С. pneumoniae в атероматозных бляшках коронарных артерий и аорты, но не в нормальных сосудах [84, 85]. 1.1.2.2. Chlamydophila psittaci
Заболевания, вызываемые С. psittaci, называются орнитозом. Впервые орнитоз описан в 1876 г. Юргенсеном (Т. Jurgensen), наблюдавшем 2-х больных с атипичной пневмонией, имевших контакт с больными попугаями.
Возбудитель орнитоза — С. psittaci по основным биологическим свойствам, циклу развития не отличается от других хламидий. Возбудитель устойчив во внешней среде: сохраняет жизнеспособность при температуре 37С в течение 2 суток, при 4-6С - в течение недели, при -20-30С — до 10 месяцев. Кипячение убивает его в течение 5 минут, 5% раствор хлорамина, 3% раствор лизола уничтожают его в течение 3-х часов.
Орнитоз — зоонозное природноочаговое заболевание с воздушно-капельным и воздушно-пылевым механизмом передачи. Резервуаром и источником заражения для человека являются домашние и дикие птицы. Возбудитель выделяется птицами с фекалиями и отделяемым из клюва. Возможен также и фекально-оральный механизм с пищевым путем передачи. В настоящее время возбудитель орнитоза выделен более чем у 150 видов птиц. Наибольшее эпидемиологическое значение имеют домашние птицы (особенно утки и индюшки), комнатные птицы (попугаи, волнистые попугайчики, канарейки и другие мелкие певчие птицы) и, особенно, городские голуби, зараженность которых колеблется в пределах 30-80% [13, 184].
Орнитоз регистрируется во всех странах, преимущественно у лиц, профессия которых связана с птицами, или же у тех, кто содержит комнатных птиц. Частота заболеваний орнитозом на разных территориях неодинакова и зависит от распространения возбудителя у птиц в данной местности. Заболевания могут приобретать характер эпидемических вспышек, но чаще регистрируется спорадическая заболеваемость. Показано, что 8% детей имеют антитела к С. psittaci, а среди членов семей, содержащих дома попугаев антитела выявляются в 37,5% [18, 179]. Клинические симптомы возникают не у всех инфицированных. Об этом говорит значительная прослойка серопозитивных лиц среди групп риска по контакту с С. psittaci. Больные орнитозом опасности для окружающих не представляют [13].
Часто орнитоз не распознается и проходит под диагнозом пневмония. Частота выявления пневмоний, вызванных С. psittaci, невелика - 1-3%, но достаточно стабильна [18]. Инкубационный период при орнитозе колеблется от 5 до 30 дней. Инфекция может протекать в острой или хронической форме. Острая форма начинается с быстрого повышения температуры до высоких цифр. В дальнейшем, при развитии пневмонии одышка не выражена, однако рентгенологически обнаруживаются очаги инфильтратов. Бактериемия в первые дни заболевания создает вероятность осложнений со стороны сердечнососудистой системы (миокардит, эндокардит), ЦНС (менингоэнцефалит) и др. Наиболее эффективными этиотропными препаратами являются антибиотики тетрациклинового ряда [1, 13, 18].
Иногда болезнь принимает хроническое течение с ранними (через 2-4 недели) и поздними (через 3-6 месяцев) рецидивами. Это связано с возможностью С. psittaci длительно персистировать в респираторном тракте после клинического выздоровления [13].
Впервые заболевание, обусловленное легионеллами, наблюдалось во время вспышки среди участников конгресса организации «Американский легион» в Филадельфии в 1976г. Тогда заболели 182 человека, из которых 29 умерли. В 1977 г. I. McDade выделил возбудителя болезни, который получил название Legionella pneumophila. В настоящее время описано более 50 видов легионелл, однако более чем в 90% культурально подтвержденных случаев легионеллеза причиной заболевания являлась L. pneumophila, при этом 80-90% из этих случаев обусловлены L. pneumophila серогруппы 1, а 5-10% связаны с серогруппами 4 и 6 [135, 200]. Другие виды (L. micdadei, L. feeleii, L. longbeachae, L. dumofii и L. bozemanii) вызывают заболевания редко и обычно у пациентов с нарушениями клеточного иммунитета или сопутствующими заболеваниями [18, 63].
Легионеллы - аэробные грамотрицательные подвижные палочки с полярными или боковыми жгутиками. В природе распространены повсеместно в пресноводных водоемах, а также в искусственных водных системах (кондиционеры, компрессоры, водопроводные системы, увлажнители воздуха, оборудование для проведения респираторной терапии) [18, 22, 63, 174]. L. pneumophila размножаются при температуре от 25С до 42С, оптимальной температурой для роста бактерий является 35С. Большинство случаев легионеллеза связаны с антропогенными водными системами. Легионеллы не являются свободноживущими бактериями, а представляют из себя внутриклеточных паразитов или комменсалов пресноводных и почвенных амёб. Обеспечивая легионеллам экологическую нишу и условия для репликации, амёбы также защищают их от вредных воздействий окружающей среды. Такие отношения повышают устойчивость легионелл к дезинфектантам, антибиотикам, кислотам, осмотическим и тепловым стрессам [22, 63].
Статистический анализ результатов
Частота выявления М. catarrhalis у организованных и неорганизованных больных статистически не отличалась и составила 1,7±0,6% и 2,1±1,2%, соответственно.
Бактериальные труднокультивируемые возбудители заболеваний органов дыхания в группах сравнения преимущественно не были обнаружены, за исключением М. catarrhalis, которая выявлялась в единичных случаях в обеих контрольных группах.
В обеих группах больных наблюдалась высокая частота выявления HSVI/II по сравнению с группами контроля (р 0,01). У военнослужащих этот показатель составил 15,4±1,6%, у неорганизованных взрослых больных - 10,3±2,5%, при этом оба показателя статистически не отличались.
Напротив, частота выявления CMV как у организованных, так и неорганизованных больных была невысокой и составила 5,1±1,0% и 3,5±1,5%, соответственно, при этом статистически не отличаясь от групп сравнения.
Совместно с лабораториями иммунохимии и клеточной иммунологии ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной, возглавляемыми к.б.н. Немовым В.В. и д.м.н., проф. Талаевым В.Ю. проводили исследования состояния гуморального и клеточного иммунитета у военнослужащих с внебольничной пневмонией.
Всего было обследовано 119 военнослужащих с диагнозом внебольничная пневмония с различной этиологией, распространенностью и локализацией воспалительного процесса в легких, тяжестью течения, осложнениями основного заболевания, сопутствующими заболеваниями и сроками госпитализации. Следует отметить, что данные лица были отобраны из общего числа обследованных военнослужащих с ВП по признаку инфицирования труднокультивируемыми возбудителями бронхолегочных заболеваний. Контрольными группами служили взрослые практически здоровые доноры (50 человек) и здоровые лица мужского пола призывного возраста (50 человек). Выявлены статистически достоверные различия показателей секреторного иммунитета у больных внебольничной пневмонией с контрольной группой. Средний уровень IgA слюны в группе больных превышал среднее значение в контрольной группе в 2 раза: IgA у больных 0,5±0,15 мг/мл, здоровых 0,25±0,025 мг/мл (р 0,05). IgG слюны в группе здоровых имел следовые уровни, среднее значение в группе больных составило 0,17±0,05 мг/мл (р 0,01). Иммуноглобулин М имел следовые значения как в группе госпитализированных, так и в контрольной группе.
Средний уровень секреторного IgA в группе больных превышал в 2,2 раза среднее значение контрольной группы. SIgA слюны больных составил 442±92 мг/л, здоровых — 199±28 мг/л (р 0,001).
Среднее содержание лактоферрина при пневмонии превышало значение контрольной группы в 3,5 раза: лактоферрин слюны больных составил 8177±1940 нг/мл, здоровых — 2332±535 нг/мл (р 0,001).
Средние значения иммуноглобулинов М, G, А в сыворотке крови больных пневмонией не превышают нормальных значений, однако у 22,7% отмечаются повышенные уровни IgG и в 4% случаев превышают норму в 1,5-3 раза.
Средний уровень SIgA в крови больных пневмонией составил 6,3±1,2 мг/л, частота встречаемости повышенных уровней — 47,3%.
Уровень лактоферрина крови в среднем составил 935± 160,3 нг/мл, частота повышенных уровней 67,8%.
Уровень высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) у больных в среднем составил 68±13,5 у.е., низкомолекулярных ЦИК 149±13уе. Частота встречаемости повышенных показателей высокомолекулярных ЦИК у больных составила 62,5%, у 36% пациентов значения превышают норму в 1,5-7,2 раз. Соотношение низкомолекулярных ЦИК к высокомолекулярным ЦИК (ЦИКок/относительный коэффициент/) колеблются в диапазоне 0,3-23,4; что может свидетельствовать о диагностической чувствительности данного показателя при воспалительно-деструктивных процессах в легких. Наблюдается тенденция к уменьшению количества ЦИК и увеличению ЦИКок с увеличением тяжести заболевания. Так, в группах с легким течением пневмонии наблюдаются наиболее повышенные показатели высокомолекулярных ЦИК как по средним, так и по крайним значениям, достигающим при легкой степени пневмонии 360 у.е., наименьшее значение ЦИКок в этой группе 0,34. В группе со средней степенью тяжести заметно ниже и средний,и наибольший показатели — 120 уе., наименьший ЦИКок равен 1,1. Тяжелое течение пневмонии сопровождалось парадоксальным снижением уровня ЦИК, что может являться показателем снижения иммунокомпетенции гуморального звена иммунитета (в этой группе наблюдается самый низкий средний уровень ЦИК, а наибольшее значение ЦИК равно 74 уе.; минимальный ЦИКок - 2,03.
Исследования, проведенные совместно с сотрудниками лаборатории клеточной иммунологии ФБУН ННИИЭМ имени академика И.Н. Блохиной под руководством д.м.н., проф. Талаева В.Ю., выявили наличие «иммунологической недостаточности» у военнослужащих по призыву с внебольничными пневмониями. Так, оценка содержания цитокинов в сыворотке крови заболевших указывает на относительную слабость клеточных иммунных реакций при пневмонии.
У больных на момент госпитализации, те на пике развития воспалительного процесса не обнаружено значительного увеличения содержания цитокинов, продуцируемых Т-хелперами первого типа — провоспалительных регуляторов интерферона-у и фактора некроза опухолей-а (таблица 7). Концентрация этих цитокинов превышала их среднее содержание у здоровых лиц лишь в 1,3 и 1,6 раз соответственно, причем максимальные значения содержания этих цитокинов у 98% обследованных не превышали 40 и 4 пг/мл соответственно.
Перспективные направления дальнейшей разработки темы
Результаты исследований показали высокую частоту репликации ДНК вирусов группы герпеса у детей при всех нозологических формах. Так CMV обнаруживался при пневмонии в 34,9% случаев, при остром бронхите - в 51,9% случаев, при ОРЗ/ОРВИ - в 49% случаев и при бронхиальной астме - в 40% случаев. У здоровых детей CMV детектировался в 2,5-3,5 раза реже (р 0,001).
Достаточно высокие показатели частоты выявления CMV были продемонстрированы у детей до года и составили 26,2% при внебольничной пневмонии, 44% при остром бронхите, 56,2% при ОРЗ/ОРВИ.
Чаще всего CMV выявлялся в группах детей от 1 года до 7 лет при всех формах патологии. При внебольничной пневмонии вирус определялся в 56,7% случаев, при остром бронхите - в 64,4% случаев, при ОРЗ/ОРВИ - в 51,8% случаев, при бронхиальной астме - в 50,6% случаев. В группах детей от 7 до 16 лет показатели частоты выявления CMV были ниже и составляли 24,3% при пневмонии, 28,9% при бронхите, 29,7% при ОРЗ/ОРВИ и 22,6% при бронхиальной астме (р 0,001).
Показатели частоты выявления HSV I/II у детей при заболеваниях респираторного тракта были выше, чем в группе сравнения (р 0,05) и составили 6,7% при внебольничной пневмонии, 4,7% при остром бронхите и 5,2% при ОРЗ/ОРВИ . Достоверных отличий по частоте выявления HSV I/II у здоровых детей и у детей с бронхиальной астмой не наблюдалось.
Вирус простого герпеса выявлялся чаще у детей в возрасте от 7 до 16 лет при всех нозологических формах - при пневмонии в 10,8% случаев, при остром бронхите - в 9,6% случаев, при ОРЗ/ОРВИ - в 7,8% случаев, при бронхиальной астме - в 3,8% случаев.
У детей в возрасте до 1 года и от 1 года до 7 лет HSVI/II обнаруживался в 1,5-7 раз реже в зависимости от нозологической формы, чем у детей старше 7 лет.
При обследовании взрослых организованных пациентов с воспалительными заболеваниями нижних дыхательных путей установлено, что наиболее распространенными из атипичных труднокультивируемых бактериальных возбудителей являлись С. pneumoniae и М. pneumoniae, которые обнаруживались в 10,4% случаев и в 9,8% случаев соответственно, что достоверно превышало частоту выявления данных возбудителей в группе неорганизованных взрослых больных (р 0,001). Остальные виды труднокультивируемых бактериальных инфекционных агентов выявлялись достаточно редко. С. psittaci была обнаружена лишь у одного военнослужащего с внебольничной пневмонией, что составило 0,2%. L. pneumophila была обнаружена у трех обследуемых военнослужащих (0,6%). M.catarrhalis удалось детектировать у 1,7% организованных взрослых и у 2,1% неорганизованных.
Атипичные возбудители воспалительных заболеваний органов дыхания выявлялись только у больных. Исключение составили M.catarrhalis, которые с одинаковой частотой обнаружены у больных пневмонией и в группе сравнения -1,7% и 1,9% соответственно.
Вирусы группы герпеса регистрировались и у взрослых больных с воспалительными заболеваниями органов дыхания. Следует отметить высокую активность репликации вируса герпеса простого у взрослых пациентов с ВП. В обеих группах больных наблюдалась высокая частота выявления HSV I/II по сравнению с группами контроля (р 0,01). У военнослужащих этот показатель составил 15,4%, у неорганизованных взрослых больных - 10,3%, при этом оба показателя статистически не отличались.
Цитомегаловирус у взрослых больных с воспалительными заболеваниями нижних отделов респираторного тракта выявлялся в 4-10 раз реже, чем у детей (р 0,001). Частота выявления ДНК цитомегаловируса у взрослых пациентов составила 5,1% - у организованных и 3,5% - у неорганизованных, и достоверно не превышала этот показатель в группах сравнения.
Данные иммунологических исследований выявили наличие «иммунологической недостаточности» у военнослужащих по призыву с ВП. Так, оценка содержания цитокинов в сыворотке крови заболевших указывает на относительную слабость клеточных иммунных реакций при пневмонии. У больных на момент госпитализации, те на пике развития воспалительного процесса не обнаружено значительного увеличения содержания цитокинов, продуцируемых Т-хелперами первого типа — провоспалительных регуляторов интерферона-у и фактора некроза опухолей-а. Концентрация этих цитокинов превышала их среднее содержание у здоровых лиц лишь в 1,3 и 1,6 раз соответственно, причем максимальные значения содержания этих цитокинов у 98% обследованных не превышали 40 и 4 пг/мл соответственно. Концентрация интерферона-а у больных ВП также несущественно превышала средние значения, свойственные здоровым людям. Средняя его концентрация составляла 7,4 пг/мл, причем у 65,5% в сыворотке крови он не был обнаружен. Среднее содержание интерлейкина-8 у больных ВП военнослужащих достоверно превышало концентрацию этого цитокина у здоровых доноров. Однако, у большинства обследованных больных пневмонией (58,9%) его содержание не превышало 30 пг/мл — верхней границы содержания интерлейкина-8 у взрослых здоровых людей. Наиболее информативными оказались параметры, описывающие функциональное состояние клеток иммунной системы, в частности Т-лимфоцитов. В работе исследовали способность Т-лимфоцитов к продукции данного цитокина, оценивая не количество Т-клеток, продуцирующих интерферон в ходе данного заболевания, а потенциальную способность иммунной системы к выполнению этой функции. Показано, что количество Т-лимфоцитов, способных продуцировать интерферон-у среди военнослужащих, поступивших в госпиталь с диагнозом ВП, существенно ниже, чем в контрольной группе практически здоровых доноров. Средние значения количества Т-клеток, отвечающих продукцией интерферона на активацию, в группе больных пневмонией в момент начала заболевания составили 16,24%, тогда как в группе здоровых доноров соответствующий показатель составлял 29,25% (р 0,001). Выявление данного функционального дефекта ставит вопрос о целесообразности проведения иммунокоррегирующих мероприятий, направленных на компенсацию дефицита продукции интерферонов при пневмонии. В связи с этим, использование индукторов продукции интерферона представляется нецелесообразным и предпочтение следует отдать заместительной иммунокоррекции с использованием препаратов интерферона.
Таким образом, проведенные исследования показали необходимость и целесообразность ПЦР скрининга труднокультивируемых возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания. Разработанный алгоритм декции труднокультивируемых патогенов позволил повысить эффективность их выявления (на 18-35%), снизить себестоимость (в 3,6-7,8 раз) и продолжительность исследования (в 1,5-2 раза). Для увеличения вероятности обнаружения микроорганизмов исследуется смесь субстратов (мокроты, БАЛ, мазков со слизистой задней стенки глотки). Уменьшение расхода диагностикумов и снижение трудозатрат достигается за счет выявления редко встречающихся возбудителей в микропулах от 3-5 человек.