Введение к работе
Введение
Актуальность проблемы. Среди более чем 180 нозологических форм зоонозных инфекционных заболеваний бруцеллез по-прежнему не утратил своей значимости в связи с масштабами экономического ущерба животноводству и здоровью населения [Черкасский БЛ., Иванова АА., 1996; Авилов В.М. идр., 1997; Антоненко АД, 2000; Онищенго ГГ, 2002; WHO, 1997].
Если к настоящему времени во многих странах мира, где раньше регистрировалась высокая заболеваемость людей бруцеллезом (Австралия, Англия, США, Новая Зеландия), наблюдается тенденция к полному его искоренению, то в Российской Федерации ежегодно регистрируются до 500 случаев впервые выявленного бруцеллеза [Онищенко ГГ. и др., 1999]. Наиболее неблагополучными по бруцеллезной инфекции являются Северо-Кавказский, Поволжский, Сибирский регионы России [Калиновский А.И. и др., 1998], надолго административных территорий Южного Федерального округа приходится до 30 % случаев первично выявляемой заболеваемости данной инфекционной патологией [Таран И.Ф. идр., 1999].
Бруцеллёз, как правило, диагностируется уже при развитии хронического процесса, когда практически у каждого четвёртого заболевшего наблюдается стойкая утрата работоспособности. Учитывая, что инфекция возникает в основном у лиц трудоспособного возраста (20-50 лет), затраты на выплаты по инвалидности, на лечение и реабилитацию оказываются значительными. Несмотря на то, что бактериологическое подтверждение инфицирования бруцеллезом на практике регистрируется лишь в 3-Ю % наблюдений, выделение культуры возбудителя является абсолютно достоверным подтверждением диагноза заболевания, а установление видовой принадлежности и биовара штамма-изолята имеет решающее значение при эпидемиологическом расследовании, а также определении тактики и объема необходимых противоэпидемических мероприятий.
Лабораторная диагностика бруцеллеза у людей в России проводится согласно методическим указаниям (МУ 3.1.7.1189-03) «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей» [2003], регламентирующим бактериологический, иммуносерологический, молекулярно-генетический и аллергический методы исследования. Осуществляемая в ходе бактериологического анализа данной инфекции межвидовая дифференциация штаммов бруцеллезного микроба, предусматривает использование в комплексной оценке теста на чувствительность штаммов-изолятов к лизирующе-му действию бруцеллезного бактериофага Тб.
рос. национальная! библиотека !
В соответствии с рекомендациями объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу [1986] в числе комплексных тестов дифференциации выделенных штаммов бруцелл применяется определение их чувствительности к литическому действию бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб (Тбилиси), Fi (Firenze), Wb (Weybridge), Bk2 (Berkley), R-фага.
В настоящее время в Российской Федерации отсутствует коммерческое производство бруцеллезного диагностического бактериофага Тб, а технология производства бактериофагов Wb, Fi, Bk2 и R вообще не разработана. Данные обстоятельства определяют необходимость разработки нормативной документации и создания современной биотехнологической цепи производства бруцеллезных фагов, налаживания выпуска этих диагностических препаратов, отсутствие которых затрудняет выполнение всего комплекса тестов межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза.
В связи с тем, что ни один из описанных бруцеллезных фагов не обладает строгой видовой специфичностью литического действия [Corbel М., Thomas Е., 1980] представляется важным изучение возможности получения новых видоспецифических препаратов бруцеллезных бактериофагов с использованием для этих целей индуцированного мутагенеза.
Сложность, длительность и комплексность видового определения выделяемых штаммов возбудителя бруцеллеза определяют актуальность разработки и практического внедрения методических подходов, обеспечивающих идентификацию и межвидовую дифференциацию штаммов бруцелл эпидемически значимых видов (Я melitensis, В. abortus, В. suis), в том числе с использованием диагностических бактериофагов.
Цель исследования. Усовершенствовать схему лабораторной диагностики бруцеллеза путем использования на этапах идентификации и дифференциации штаммов бруцелл оптимального набора бруцеллезных диагностических бактериофагов, разработать эффективную и экономичную технологию производства препаратов бруцеллезных бактериофагов, определить пути ее совершенствования.
Основные задачи.
1. Изучить спектры литической активности различных бруцеллезных бактериофагов.
2 Определить оптимальный набор бруцеллезных диагностических бактериофагов для использования на различных этапах бактериологической диагностики бруцеллеза.
3. Изучить возможность использования индуцированного мутагенеза с применением химических соединений для получения новых видоспецифических бруцеллезных бактериофагов.
-
Разработать технологию экспериментально-производственного получения бру-целлезных диагностических бактериофагов Тб, Fi, Wb, Bk2 с использованием сред немясного происхождения, вакцинных штаммов размножения, оптимального консерванта.
-
Разработать нормативную документацию (фармакопейную статью предприятия, инструкцию по применению, экспериментально-производственный регламент) для выпуска препаратов бруцеллезных бактериофагов в производственных условиях.
-
Апробировать возможность применения стандартной синтетической питательной среды для репродукции бруцеллезных бактериофагов.
-
Изучить возможность совершенствования отдельных технологических этапов производства бруцеллёзных бактериофагов путём оптимизации условий размножения бактериофагов и режима лиофилизации.
-
Разработать новые методические приемы для определения фагочув-ствительности штаммов возбудителя бруцеллеза различных видов.
-
Усовершенствовать этапы идентификации и дифференциации Brucellae spp. при лабораторной диагностике бруцеллёза за счёт использования оптимального набора бруцеллезных бактериофагов.
Научная новизна и теоретическая значимость:
Впервые определен оптимальный набор фаговых препаратов для использования на различных этапах бактериологической диагностики бруцеллеза.
Разработан ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с использованием теста фагочувствительности и определения аде-ниндезаминазной активности штаммов бруцелл.
На основе сравнительного изучения биокинетических особенностей одиночных циклов размножения бруцеллезных бактериофагов на штаммах возбудителя бруцеллеза с различным уровнем вирулентности подобраны оптимальные условия, позволяющие осуществлять репродукцию фагов с высокой степенью эффективности и обеспечивающие максимальный уровень биологической безопасности технологического цикла.
На основании сравнительного изучения способности бруцеллезного бактериофага переживать состояние анабиоза в результате воздействия низких температур, удаления свободной и связанной влаги подобраны оптимальные криопротекторы и отработаны режимы лиофилизации, обеспечивающие получение конечного высушенного препарата с высоким показателем уровня выживаемости фаговых корпускул (72,48+1,52 %) и удовлетворяющих нормативным требования показателя потери в массе при высушивании (3 % ).
Разработана оригинальная высокопродуктивная методика размножения бруцеллезных бактериофагов в жидкой питательной среде, включающая установление оптимального соотношения (множественность инфекции) концентрации фага и штамма размножения, равного 0,01-0,001, в репродуктивной среде, в которую для обеспечения необратимости и эффективности адсорбции фаговых корпускул на поверхности бактериальной клетки дополнительно внесены сульфат кальция и магния в концентрации 0,001 М каждого. Методика защищена патентом Российской Федерации на изобретение № 2126833.
Экспериментально установлено, что результатом химического индуцированного мутагенеза является получение h-мутантных линий бактериофагов, характеризующихся измененным спектром активности в сторону внутриродового расширения литических свойств. С применением химических мутагенов нитрозогуанидина и этилметансульфоната впервые получены новые линии бруцеллезного бактериофага Тб, обладающие лити-ческой активностью в отношении штаммов бруцелл вида В. melitensis.
Разработан оригинальный способ идентификации бактерий рода Brucella с различным уровнем чувствительности к лизирующему действию бруцеллезных фагов, для обеспечения которого подобраны условия, повышающие степень адсорбции бактериофага на клеточной стенке бруцелл за счет предварительного смешивания взвеси исследуемых штаммов с фагом в соотношении 1:3-1:4, инкубации в течение 20-30 мин при температуре + 36-38 Си последующим нанесении смеси на агаровые пластинки. Метод защищен патентами Российской Федерации на изобретение № 2010853 и № 2059722.
Предложен новый способ оценки пороговой чувствительности штаммов бруцелл к действию бруцеллезных бактериофагов, заключающийся в приготовлении градиентных фаговых препаратов на бумажных носителях и позволяющий количественно и качественно оценивать чувствительность бруцеллезного микроба к лизирующему действию бактериофагов. Метод защищен патентом Российской Федерации на изобретение № 2147610.
Практическая значимость:
Разработана технология экспериментально-производственного получения бактериофагов диагностических бруцеллезных жидких Тб, Fi, Wb, Bk2, обеспечивающая соблюдение максимального уровня биологической безопасности технологического цикла, включающая репродукцию их на культурах вакцинных штаммов с применением сред немясного происхождения.
Составлена нормативная документация (экспериментально-производственный регламент (ЭПР), фармакопейная статья предприятия (ФСП),
инструкция по применению) на бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие, одобренная Ученым Советом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (СгавНИПЧИ) [протокол № 5 от 28.05.2001 г.].
Три экспериментально-производственные серии препарата «Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие» успешно прошли контрольные испытания на базе Государственного института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов (ГИСК) им. Л.А. Та-расевича, нормативная документация (ЭПР, ФСП, инструкция по применению) представлена на Ученом Совете ГИСК им. Л.А. Тарасевича, комитетом МИБП утверждена программа Госиспытаний бактериофагов диагностических бруцеллезных жидких и разрешено их проведение [протокол №4 от 24.06.04 г.];
Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие прошли лабораторные испытания на базе Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (РосНИПЧИ) [акт лабораторного испытания фагов, утвержденный директором РосНИПЧИ «Микроб» В.В. Кутыревым от 15.04.98 г.], депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» и рекомендованы в качестве маточных производственных [справка о депонировании бактериофагов].
Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие апробированы в НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации при идентификации и межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза [акт внедрения, утвержденный начальником НИИ микробиологии Министерства обороны РФ Е.Пименовым от 27.05.03 г.].
Материалы диссертации использованы при составлении раздела «Бруцеллез» (подраздел «Лабораторная диагностика») в целевых комплексных программах обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения на территории юга России и в Ставропольском крае:
«Профилактика особо опасных инфекций и санитарная охрана территории Ставропольского края от завоза и распространения конвенционных инфекционных заболеваний на 1993-1995 гг.». Утверждена постановлением главы администрации Ставропольского края 14.10.93 г.;
«Обеспечение эпидемиологического благополучия по особо опасным и природно-очаговым заболеваниям и улучшение медико-эпидемиологической обстановки на юге России на 1994-1995 гг.». Одобрена решением Совета Ассоциации социально-экономического сотрудничества республик, краев и областей Северного Кавказа 15.05.94 г.;
- «Обеспечение эпидемиологической безопасности по особо опасным и природно-очаговым заболеваниям в регионе Северного Кавказа на 1999-2002 гг.». Утверждена решением Ассоциации социально-экономического сотрудничества республик, краев и областей Северного Кавказа 10.12.99 г.
Материалы диссертации вошли в сборник методических документов «Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний» [Саратов, 1998]; в дополнение к информационному указателю штаммов, депонированных в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» РосНИПЧИ «Микроб» [Саратов, 1999]; в методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации [Саратов, 2000]; в методические рекомендации по индикации особо опасных инфекционных заболеваний (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, холера) в СПЭБ и СНЛК в условиях чрезвычайных ситуаций [Ставрополь, 2003] утвержденные директором Став-НИПЧИ 27.02.03 г. [протокол № 2]; в методические рекомендации «Бруцеллез. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика, клиника, лечение, диспансерное наблюдение за больнымт» [Ставрополь, 2003], утвержденные Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 12.02.04 г.
Материалы диссертационной работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ.
Диссертационная работа выполнена в рамках государственных тем НИР: «Проблемы зоонозов и пути их решения в современных условиях индустриализации сельскохозяйственного производства» (№ Гос. регистрации 018660004639), «Разработка и усовершенствование лабораторной диагностики бруцеллеза» (№ Гос. регистрации 01910047321), «Совершенствование методов и препаратов, используемых для лабораторной диагностики бруцеллеза» (№ Гос. регистрации 01960001790), «Разработка технологии получения бруцеллезных диагностических бактериофагов» (№ Гос. регистрации 01200109093).
Положения, выносимые па защиту:
Предлагаемые бактериофаги диагностические бруцеллезные Тб, Wb, Fi, Bk2 позволяют с высокой диагностической точностью определять фа-гочувствительность бактерий рода Brucella
Ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis)c
использованием теста чувствительности к бактериофагам Тб и Вк2 и определением адениндезаминазной активности штаммов бруцелл эффективен при выполнении данного этапа лабораторной диагностики бруцеллеза.
Технология экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Wb, Fi, Bk2 позволяет осуществлять их репродукцию на вакцинных штаммах с использованием сред немясного происхождения, обеспечивает биологическую безопасность технологического цикла и экономический эффект.
Предложенные криопротекторы и условия лиофильного высушивания обеспечивают высокий уровень выживаемости бактериофагов.
Применение разработанных препаратов бруцеллезных бактериофагов на бумажных носителях позволяет существенно упростить постановку теста на фагочувствительность при сохранении точности метода.
Апробация работы:.
Материалы диссертации доложены на научных конференциях СтавНИПЧИ [Ставрополь, 1990-2003 гг.].
Материалам диссертации были представлены на областной научной конференции молодых ученых [Ростов-на-Дону, 1989]; на рабочем совещании «Проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций» [Оболенск, 1989]; на межгосударственной научно-профилактической конференции «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы [Ставрополь, 1994]; на научно-практической конференции «Эпидемиологические аспекты краевой патологии Ставрополья» [Ставрополь, 1995]; на научно-практической конференции «60 лет противочумной службы Кавказа» [Ставрополь, 1995]; на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России [Саратов, 1997]; на V и VI итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов [Ставрополь, 1997,1998]; на второй международной конференции, посвященной 75-летию института им. Пастера [Санкт-Петербург, 1998]; на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ [Киров, 1998]; на второй Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» [Саратов, 1998]; на международной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» [Оболенск, 2000]; на 3-ей международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем» [Махачкала, 2001]; на международной научно-практической конференции «Современный эпидемический
потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Таддыкорганской противочумной станции [Таддыкорган, 2001]; на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института [Ставрополь, 2002].
Публикации. Основные результаты диссертации изложено в 40 опубликованных работах, из них в журналах рекомендуемых ВАК России для публикации основных научных результатов докторских диссертаций - 6, патентов - 4.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 212 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, восьми глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 162 источника на русском языке и 87 - на иностранных языках. Материалы исследований иллюстрированы 35 таблицами и 16 рисунками.