Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время методы генетк-?ской инженерии применяются для решения широкого круга задач области молекулярной Оиологии и биотехнологии. Одной из та-их задач, наиболее часто реализуемой на практике, является эздание на основе технологии рекомбинантной ДНК штаммов, об-адающих способностью синтезировать в большом количественеоб-эдимый белок. Такой сверхсинтез может осуществляться как в еэультате повышения дозы гена, так и в результате увеличения го транскрипционной активности (Tso et al. , 1982. Gribskov; urgess, 1983). Немаловажную роль в этом процессе играет и летка-хозяин, в которую вводят рекомбинантную ДНК. Вопрос о заимодействии клетки-хозяина и рекомбинантной ДНК еще не полне изучен. Однако ясно, что существует взаимное влияние летки-хозяина и рекомбинантной ДНК, которое проявляется в ледующем: во-первых, рекомбинантная ДНК, попав в клетку, моет изменить такие свойства, как копийность. стабильность, пособность к транспозиции и рекомбинации; во-вторых, введение локированного гена в составе вектора в бактериальную клетку ожет оказывать как положительное, так и отрицательное влияние а ее физиологические и метаболические процессы. С одной сто-оны. векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, аюшие ей селективные преимущества. С другой стороны, верхсинтез продукта чужеродного гена, а также сам продукт, югут оказывать негативное влияние на рост и размножение кле-ок (Goldwin, Stater, 1979; Zund, Lebek, 1980). Все это в коечном счете может существенно влиять на биосинтез продукта екомбинантных штаммов.
Эндонуклеаэа Serratia marcescens в последние годы находит ирокое применение в биохимии, молекулярной биологии, медицине t сельском хозяйстве. Возрастающие потребности в препарате вы-інвают необходимость в исследованиях, направленных на получе-іие новых сверхпродуцентов этого фермента и изучение его би-юитеза (Biedermann et al. , 1989; Miller et al. , 1991; Ball et il.. 1992; Friedhoff et al. , 1994).
Де ль и задачи исследования. Целью настоящего исследования (вилось изучение биосинтеза эндонуклеазы Serratia marcescens >екомбинантными штаммами Escherichia coli и Serratia iarcescen3. В соответствии с этой целью нами были поставлены :ледующие задачи:
1. Нч основе штамма. Serratia marcescens 33. не Опособного
- 4 -синтезировать эндонуклеазу, получить штамм, чувствительный ампициллину и тетрациклину.
-
На основе безнуклеазного штамма Serratia marcescer чувствительного к антибиотикам, получить рекомбинантный шта Serratia marcescens. несущи плаэмиду pGR с геном эндонуклее Serratia marcescens.
-
Изучить влияние плазмиды pGR, несушей ген эндонуклеа Serratia marcescens. на рост и жизнедеятельность клеток-хоэ ев.
-
Изучить динамику биосинтеза эндонуклеазы Serrat marcescens рекомбинантными штаммами.
-
Изучить индукцию синтеза эндонуклеазы Serrat marcescens под действием температуры.
-
Исследовать поведение рекомбинантной плазмиды pGR клетках Е. coli и S. marcesccens.
Научная новизна. Впервые было изучено поведение рекомб нантной плазмиды pGR, содержащей ген зндонуїслеазьі Serrat marcescens, в клетках Е. coli и S. marcesccens. Показано, ч способность к синтезу эндонуклеазы Serratia marcescens опред ляется как клеткой - хозяином, так и рекомбинантной плаэмид pGR. Установлено, что в клетках рекомбинантных штаммов пр исходит изменение копийности плазмиды pGR. Показано, что на большей способностью синтезировать эндонуклеазу Serrat marcescens обладает рекомбинантный штамм Е. coli LK 111 (р nuc г).
Практическая значимость. Полученные результаты моа использовать для дальнейших исследований в области промышле ной микробиологии, для оптимизации синтеза эндонуклеа Serratia marcescens рекомбинантными штаммами, а также для из чения секреции фермента. Рекомбинантный штамм Е. coli LK 1 (pGR nuc г), обладающий наибольшей биосинтетической акти ностью, можно рекомендовать в производство для получения энд нуклеазы в промышленных условиях.
Апробация работы. Результаты диссертации доложены на ит говых научных конференциях КГУ (1991.1992, 1993, 1994) и Всероссийских конференциях (Москва, 1991, 1992,. 1993).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научн работ.
Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена И? страницах машинописного текста. Состоит из введения, о
- 5 -а литературы, описания материалов и методов исследований, дела результатов и их обсуждения, выводов и списка литералы. Работа содержит 7 таблиц, 15 рисунков, 2 фотографии, сок литературы содержит 35 отечественных и 2/6иностранных оров.