Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Сульфатредуцирующие бактерии
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH).
Черное и Балтийское моря – общая характеристика водной толщи и сообществ срб .
Черное море .
Заключение.
Сульфатредуцирующие бактерии
За последние 30 лет была показана способность сульфатредуцирующих бактерий использовать, помимо упомянутых выше, еще более широкий спектр органических субстратов, включающий в себя сахара [Ollivier et al., 1988; Sass et al., 2002], аминокислоты [Stams et al., 1985; Baena et al., 1998] и одноуглеродные соединения, такие как метанол [Nanninga et al., 1987; Nazina et al., 1987], СО [Parshina, 2005; Henstra et al., 2007] и метилмеркаптан [Tanimoto a. Bak, 1994]. Также СРБ могут расти, осуществляя дисмутацию тиосульфата, сульфита и серы, приводящей к образованию сульфата и сульфида [Bak a. Pfennig, 1987; Bottcher et al., 2005]. Помимо бензоата и фенола СРБ также могут деградировать такие ароматические углеводороды, как толуол и этилбензол [Rabus et al., 1993; Harms, 1999; Morasch et al., 2004]. Более того, была описана способность сульфатредукторов использовать длинноцепочечные алканы [Aeckersberg et al., 1998; So a. Young, 1999; Cravo-Laureau et al., 2004; Davidova et al., 2006], алкены [Grossi et al., 2007], а также короткоцепочечные алканы [Kniemeyer et al., 2007]. Рис. 2. Общая схема деградации органического вещества микробными сообществами в примутствии сульфата [Muyzer a. Stams, 2008]. При этом сульфатредукторы лишены возможности использовать напрямую в своем метаболизме полимерные органические соединения (крахмал, целлюлозу, белки, нуклеиновые кислоты и липиды). Таким образом, в природных местообитаниях СРБ находятся в тесной взаимосвязи с микроорганизмами, осуществляющими деструкцию сложных органических соединений (рис. 2). По физиологическим характеристикам сульфатредукторы могут быть разделены на две большие группы – микроорганизмы, осуществляющие неполное разложение органических субстратов до ацетата и полное разложение до углекислого газа.
Как уже было сказано, основным акцептором электронов для СРБ является сульфат. Однако в его отсутствие многие сульфатредукторы могут использовать в качестве акцепторов и другие соединения серы (тиосульфат, сульфит и серу), восстанавливая их до сульфида, а также нитраты и нитриты, восстанавливая их до аммония [Keith a. Herbert, 1983; Dalsgaard a. Bak, 1994;Moura et al., 1997; Lpez-Corts et al., 2006]. Помимо этого для некоторых СРБ показана способность использовать в качестве акцепторов электронов соединения тяжелых металлов, например, Fe (III) [Lovley et al., 1993; Park et al., 2007], U (VI) [Lovley et al., 1992], Tc (VII) [Lloyd et al., 1999], Se (VI) [Tucker et al., 1998], Cr (VI) [Lovley et al., 1994] и As (VI) [Macy et al., 2000], однако данные процессы не всегда связаны с ростом культуры. Также акцепторами электронов для СРБ могут выступать и органические соединения, например, фумарат [Jonkers et al., 1996]. Некоторые морские сульфатредукторы используют в качестве акцептора электронов диметилсульфоксид [Lie et al., 1996].
В пресноводных местообитаниях при низком содержании сульфатов СРБ играют большую роль в сбраживании и анаэробном окислении органических субстратов. Многие представители родов Desulfovibrio и Desulfomicrobium способны сбраживать пируват с образованием ацетата, углекислого газа и водорода [Muyzer a. Stams, 2008]. Также они способны окислять лактат и этанол, но только в случае, если водород активно удаляется из системы синтрофными водород-использующими метаногенными археями [Bryant et al., 1977].
Традиционно считается, что сульфатредуцирующие бактерии относятся к строгим анаэробам и их рост ингибируется кислородом. Известно, что активные формы кислорода инактивируют многие ферменты сульфатредуцирующих бактерий, в частности, гидрогеназы [Брюханов и Нетрусов, 2007].
Однако в последнее время появляются данные о том, что не все сульфатредукторы быстро погибают в присутствии кислорода, а многие из них обладают значительной аэротолерантностью. Более того, некоторые виды Desulfovibrio spp. способны сохранять жизнеспособность даже при длительной экспозиции на воздухе и возобновлять свой рост при наступлении благоприятных анаэробных условий [Cypionka, 2000]. Кроме того, СРБ вс чаще обнаруживают в местообитаниях, подверженных периодическому воздействию кислорода, таких как верхние слои донных или цианобактериальных матов [Canfield a. Des Marais, 1991; Krekeler et al., 1997; Jonkers et al., 2005], что косвенно также подтверждает наличие у них высокой степени аэротолерантности.
Среди способов защиты сульфатредуцирующих бактерий от окислительных стрессов можно выделить два типа – физиологический и биохимический.
К физиологическим способам относится, например, наличие у подвижных форм СРБ отрицательного аэротаксиса. Такая способность показана для Desulfovibrio oxyclinae, обитающего в цианобактериальных матах [Krekeler et al., 1998], а у Desulfovibrio vulgaris даже обнаружен редокс-чувствительный белок, позволяющий чутко реагировать на изменение содержания кислорода в среде [Fu et al., 1994]. Многие из СРБ формируют скопления клеток, способных к поглощению O2 в качестве эффективного механизма антиокислительной защиты. Также показано формирование микроколоний и консорциумов бактерий серного цикла, в которых серобактерии существуют в ассоциации с сульфатредукторами, что уменьшает доступ кислорода к клеткам последних [Брюханов и Нетрусов, 2007].
Биохимическая аэротолерантность обеспечивается благодаря специальным ферментам. Помимо классических ферментов антиокислительной защиты от (супероксиддисмутазы, пероксидаз, каталазы), которые присутствуют не у всех сульфатредукторов, в их клетках часто присутствуют уникальные негемовые железосодержащие белки ,такие как супероксидредуктазы (десульфоферродоксин, неелоредоксин ) и НАДН, негемовые пероксидазы (рубреритрин и нигеритрин) и рубредоксин, весьма эффективно удаляющие активные формы кислорода (АФК) [Брюханов и Нетрусов, 2007].
Некоторые сульфатредуцирующие бактерии способны использовать кислород в качестве акцептора электронов для его удаления из окружающей их среды. Другие СРБ могут и вовсе поглощать молекулярный кислород. Так, у представителей рода Desulfovibrio показано наличие дыхательной цепи, используемой ими в целях антиокислительной защиты, но не для получения энергии [Cypionka, 2000; Baumgarten et al., 2001; Lemos et al., 2001].
До начала 1980-х гг. систематика сульфатредукторов традиционно базировалась на фенотипических характеристиках, таких как потребляемые субстраты, морфология клеток, химические и/или биохимические маркеры. Такими маркерами, к примеру, являются десульфовиридин, жирные кислоты мембранных липидов или менахиноны [Rabus et al., 2006].
В настоящее время на основе анализа последовательностей гена 16S рРНК выделяют 7 филогенетических линий сульфатредуцирующих микроорганизмов – 5 внутри домена Bacteria и 2 внутри домена Archaea [Muyzer a. Stams, 2008]. Большинство СРБ принадлежит к 23 родам внутри групп Deltaproteobacteria (грамотрицательные мезофильные СРБ) и Clostridia
(грамположительные спорообразующие СРБ). Три линии – Nitrospirae (род Thermodesulfovibrio), Thermodesulfobacteria (род Thermodesulfobacterium) и Thermodesulfobiaceae (род Thermodesulfobium) содержат исключительно термофильных СРБ. Сульфатредукторы также встречаются среди архей – к ним относятся представители рода Archaeoglobus в филуме Euryarchaeota и родов Thermocladium и Caldirvirga в филуме Crenarchaeota [Muyzer a. Stams, 2008].
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH).
Балтийское море лежит между параллелями 6556 и 5446 с. ш. и меридианами 957 и 3000 в. д. Окруженное почти со всех сторон сушей, оно лишь в юго-западной части соединяется с Северным морем через датские проливы Зунд, Большой и Малый Бельты и далее через проливы Каттегат и Скагеррак. Рельеф дна Балтийского моря неоднороден и, при средней глубине моря 51 м, имеются как мелководные проливы (7-35 м), так и более глубокие впадины (с максимальной глубиной 470 м в Ландсортской котловине). Площадь поверхности Балтийского моря составляет около 415 тыс. км2, а объем водных масс 21,7 км3. В Балтийское море впадает около 250 крупных и малых рек, в среднем вливающих в море приблизительно 433 км3 воды. [Добровольский и Залогин, 1982, брошюра]
Из-за неодинакового прогрева в течение года и в различных районах Балтийского моря имеют место сезонные различия и пространственная неоднородность поверхностной температуры воды. В частности, зимой в прибрежных водах она ниже, чем в открытых частях моря, при этом у западного берега температура воды несколько выше, чем у восточного. Летом поверхностные воды нагреваются наиболее сильно, но неодинаково в разных районах моря. Колебания температур поверхностных вод составляют от 0,5С до 21С. Однако ярко выраженные сезонные изменения захватывают только верхние 50-60 м, глубже температура воды понижается и остается практически постоянной в течении всего года (около 5С). В Балтийском море также, как и в Черном, существует холодный промежуточный слой (ХПС), сохраняющийся в том числе и летом. [Добровольский и Залогин, 1982; Кудрявцева и др., 201.]
Соленость в Балтийском море также распределена неоднородно и изменяется от 1-2 на севере Ботнического залива до 30 у дна датских проливов. С глубиной соленость, а соответственно, и плотность балтийских вод увеличивается, во многих впадинах и котловинах на горизонтах 50-70 м создается постоянный пикноклин. Над ним в подповерхностных горизонтах (20-30 м) образуется сезонный слой больших вертикальных градиентов плотности, обусловленный резким изменением температуры воды на этих горизонтах.
Для Балтийского моря характерно явление гипоксии (уменьшения концентрации растворенного в воде кислорода) в придонных водах, одной из причин которой является эвтрофикация водоема. [Брошюра] Гипоксия в Балтийском море возникала периодически в течение всего Голоцена, однако в последнее время ее масштабы значительно увеличились в связи с активным антропогенным поступлением соединений азота и фосфора с речным стоком в воды моря. В частности, если до 1950 г. площадь вод с гипоксией составляла менее 10000 км2, то уже к 2000 г. эта цифра увеличилась до 60000 км2. [Carstensen et al., 2013; + брошюра]
Увеличение концентраций доступного фосфора и азота в воде вызывает интенсификацию первичной продукции, что, в свою очередь, приводит к уменьшению содержания кислорода в воде или даже полному его отсутствию и накоплению сероводорода за счет активизации его выбросов из донных осадков. Кроме того, благодаря периодическому проникновению вод из Северного моря придонная водная толща Балтики обогащается более солеными (а следовательно, и более плотными) водными массами, что уменьшает возможность вертикальной конвекции и, соответственно, обогащения придонных вод кислородом. На данный момент известно, что вблизи дна многих впадин Балтийского моря (в частности, Гданьской) существуют постоянные анаэробные условия [брошюра].
Гданьский бассейн располагается в юго-восточной части Балтийского моря, омывая с юга побережье Польши, с востока – России и Литвы. Площадь его акватории составляет 22000 км2. В центре бассейна находится впадина с максимальной глубиной 114 м, отделенная от соседней Готландской впадины Гданьско-Готландским порогом с максимальной глубиной 86 м. Гданьский бассейн, как и вс Балтийское море, находится под влиянием неблагоприятных факторов, таких как ограниченный водообмен с Северным морем, а также наличие барьеров температуры и солености между поверхностными и придонными водами. Существование гидрологические барьеров, затрудняющих циркуляцию водных масс, в сочетании со значительными величинами первичной продукцииспособствуют формированию в придонных горизонтах Гданьской впадины обширных зон аноксии (полного отсутствия кислорода) [Кудрявцева и др., 201.]. Наиболее полное исследование численности, биомассы и продукции бактериопланктона в российском секторе Балтийского моря было проведено в 2007-2009 гг. Кудрявцевой с соавторами [Кудрявцева и др., 201.]. В летнее время численность и биомасса микроорганизмов в водной толще Балтийского моря сильно варьировали и составляли 0,09-11,23 106 кл./мл и 2-123 мгС/м3, соответственно. Также были установлены некоторые закономерности сезонного и пространственного распределения микроорганизмов. Численность и биомасса микроорганизмов увеличивались в летнее время, по сравнению с зимним, и уменьшались по мере удаления исследованных точек от берега в открытое море. Летом в холодном промежуточном слое наблюдалось снижение численности и биомассы микроорганизмов по сравнению с вышележащими водными слоями. В придонных водах, наоборот, наблюдалось увеличение численности и биомассы. Наблюдаемые клетки были, в основном, кокками и палочками, в меньшем количестве выявляли вибрионы. Изредка попадались нитчатые формы, их количество увеличивалось в придонных слоях воды. [Кудрявцева и др., 201.]
До настоящего времени основные исследования сульфатредуцирующих бактерий в Балтийском море были сосредоточены на изучении их сообществ в донных осадках и участия СРБ в различных процессах, таких как деградация ацетата и пропионата, потребление соединений фосфора и т.д. Среди исследований бактериопланктона водной толщи Балтийского моря можно обнаружить лишь единичные работы, в которых было описано присутствие СРБ.
В 2003 г. Лабренц с соавторами исследовали вертикальное распределение прокариот в водной толще центральной части Балтийского моря (Fr Deep) методами анализа одноцепочечных конформационных полиморфизмов (SSCP) участков как гена, так и самой 16S рРНК, и ДГГЭ [Labrenz et al., 2007]. В ходе этой работы в пробах воды с глубин 85-180 м (что соответствовало зоне хемоклина и анаэробной водной толще) были определены последовательности 16S рибосомальной кДНК 5 представителей Deltaproteobacteria, только одна из которых имела сходство 96% с соответствующей последовательностью Desulfobacula toluolica. Также авторы отметили, что участки гена 16S рРНК Desulfobacula toluolica были обнаружены на глубинах 110-160 м, в то время как последовательности самой 16S рРНК, характеризующие присутствие метаболически активных клеток, только на глубинах 110-120 м. В аэробных водах фрагменты генов 16S рРНК или последовательности самой 16S рРНК представителей Deltaproteobacteria обнаружены не были [Labrenz 2007].
Черное море
Для повышения чувствительности обнаружения 16S рДНК минорных представителей сульфатредукторов применяли вложенную ПЦР. В этом случае сначала проводили амплификацию участка гена 16S рРНК Bacteria (праймеры pA – pH [Edwards et al., 1989]), а полученный продукт амплификации использовали в качестве матрицы для амплификации с праймерами, специфичными к участку гена 16S рРНК шести филогенетических подгрупп сульфатредукторов по описанным выше протоколам.
Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили при напряжении 100 В в течение 1 ч в 1%-ном агарозном геле в 1 трис ацетатном буферном раствором (ТАЕ) состава – 40 мМ Трис; 1,2 мМ ЭДТА; 1,79 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л раствора. После проведения электрофореза гель окрашивали в водном растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 15 мин и отмывали в воде в течение 5 мин. Анализировали и фотографировали гель под проходящим длинноволновым ультрафиолетовым светом ( 254 нм) на трансиллюминаторе ECX-15.C («Vilber lourmat», Франция). В качестве маркера для определения размера и концентрации амплифицированных фрагментов ДНК использовали Gene Ruller 1 kb DNA Ladder («Fermentas», Литва).
Определение численности СРБ методом количественной ПЦР Подсчет количества копий участка гена dsrB проводился с использованием красителя SYBR green [Wittwer etal., 1997]. Для постановки колическвенной ПЦР использовали коммерческую 5х реакционная смесь qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия), следуя инструкциям производителя.
Количественную ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе Mini Opticon («Bio-Rad», США). Для проведения реакции использовали пару праймеров DSRp2060F и DSR4R (табл. 3). Абсолютное количество целевых генов в образце ДНК подсчитывали на основании калибровочных реакций. В качестве калибровочной использовали ДНК, выделенную из чистой культуры Desulfovibrio vulgaris Hildenborough ATCC 29579 (DSMZ, Германия), размер генома и копийность целевого гена в геноме которого известна [Heidelberg et al., 2004]. Концентрацию ДНК определяли на флюориметре Qubit 2.0 («Invitrogen», США). Для построения калибровочные кривых использовали серию двукратных разведений ДНК до 220 разведения. Значения детерминации корреляции (R2) и эффективности реакции для калибровочных кривых высчитывали стандартным методом [Rebrikov & Trofimov, 2006].
Конечное значение копийности целевого гена нормализовали на 1 нг выделенной ДНК. Анализ участков гена dsrB с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) с последующим секвенированием.
Для амплификации ДНК из исследуемых проб с целью последующего разделения с помощью ДГГЭ использовали праймеры DSRp2060F с прикрепленным к 5 -концу ГЦ-богатым участком и DSR4R (см. табл. 3). ПЦР-амплификацию проводили по режиму, описанному выше. В зависимости от полученной концентрации ДНК в лунку полиакриламидного геля вносили 5-15 мкл пробы.
ДГГЭ для разделения смеси полученных ПЦР-продуктов проводили в 6,5%-ном полиакриламидном геле толщиной 1,5 мм с денатурирующим градиентом (от 40 до 70% мочевины и формамида) в 0,5 ТАЕ буферном растворе при температуре 60С и постоянном напряжении 200 В в течение 6 ч на приборе DCode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad, США).
После электрофореза гель оставляли на 30 мин в буферном растворе TAE, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, после чего промывали в TAE в течение 10 мин и фотографировали под длинноволновым УФ светом с использованием системы гель-документирования GelDoc (Bio-Rad, США). Индивидуальные полосы вырезали из геля под УФ светом ( = 320 нм) на трансиллюминаторе ECX-26MX (Vilber Lourmat, Франция). Элюцию ДНК осуществляли в стерильной деионизованной воде в течение 24 ч при температуре 4С, которую затем использовали в качестве матрицы для ПЦР-реамплификации участков гена dsrB по стандартному протоколу для праймеров DSRp2060F-DSR4R, описанному в главе 2.4. Очистку продуктов реамплификации проводили из 1%-ного агарозного геля с использованием набора Cleanup Mini (Евроген, Россия) согласно протоколу производителя.
Реамплифицированный ПЦР-продукт очищали из агарозного геля с использованием коммерческого набора DNA Gel Extraction Kit («Fermentas», Литва) в соответствии с нижеприведенным протоколом.
После окончания реакции смесь переносили в пластиковые микроцентрифужные пробирки емкостью 1,5 мл и проводили очистку. Для этого к каждой смеси добавляли 10 мкл XTerminator Solution («Applied Biosystems», США) и 45 мкл SAM Solution («Applied Biosystems», США) и перемешивали на вортексе в течение 30 мин. После этого центрифугировали пробы 2 мин при 5000 об/мин на микроцентрифуге MiniSpin («Eppendorf», Германия). Препарат XTerminator Solution («Applied Biosystems», США) связывает оставшиеся в растворе терминаторы, а также свободные соли, которые могут препятствовать прочтению нуклеотидных последовательностей, SAM Solution («Applied Biosystems», США) в свою очередь усиливает эффективность очистки и стабилизирует реакцию. После центрифугирования 20 мкл надосадочной жидкости переносили в специальную плашку, загружали ее в секвенатор и осуществляли секвенирование по протоколу для полимера 3130 РОР-6 («Applied Biosystems», США) и смеси BigDye Terminator v3.1 S v3.1 Cycle Sequencing PR-100 («Applied Biosystems», США), время инъекции пробы составляло 12 сек. Первичный анализ полученных последовательностей на предмет качества прочтения осуществляли в программе BioEdit.