Введение к работе
Актуальность темы Морские микроорганизмы обладают широким спектром физиологических адаптации, что позволяет им осваивать разнообразные экониши Мирового океана, а мультиферментные системы помогают утилизировать любые субстраты в качестве источников углерода и энергии, необходимые для метаболизма. Изучение ферментов, гидролизующих природные соединения в океане, актуально, поскольку дает представление о механизмах и скорости трансформации органического вещества в морских экосистемах. Морская биота существенно отличается от наземной, поэтому высока вероятность обнаружения в морской среде отличных от наземных микроорганизмов - продуцентов ферментов с уникальной специфичностью и активностью, удовлетворяющих практическим потребностям современной биотехнологии.
Микроорганизмы являются наиболее технологичными источниками ферментов, гак как они обладают высокой скоростью размножения и могут осуществлять синтез биологически активных веществ в конролируемых человеком условиях. Привлекают внимание исследователей микробные a-N-ацетилгалактозаминидазы (a-ranNAu), способные удалять а-1,3-связанные остатки N-ацетилгалактозамина из гликопротеинов групповых веществ группы крови А с превращением последних в вещества группы О. В настоящее время выделено и охарактеризовано несколько подобных ферментов, которые, тем не менее, не соответствуют требованиям, предъявляемым биотехнологическим производством. Например, фермент, выделенный из Aspergillus niger (McDonald, Bahl, 1972), не действует на природные субстраты, гликозидазы анаэробной патогенной бактерии Clostridium perfringens трудно получить в значительном количестве (Zevy, ArainofF, 1980). Гликозидаза из почвенного гриба-микромицета Acremonium sp. (Kadowaki el al., 1989) проявляет активность в не физиологических условиях (рН 4.5), что значительно усложняет процедуру обработки эритроцитов, для которых приемлемыми являются только физиологические условия (рН 7.0). Фермент с искомой специфичностью обнаружен в культуральной жидкости штамма анаэробной бактерии Ruminococcus torques IX-70 (Hoskins el al, 1997), выделенного из фекалий теплокровных. Однако, данная группа анаэробов нуждается в особых условиях культивирования и специфических факторах роста.
Большой практический интерес представляют се-галактозидазы (а-Гал), способные удалять а-1,3-связанные остатки галактозы из гликопротеинов групповых веществ и эритроцитов группы крови В с превращением последних в вещества и эритроциты группы О. а-Гал с такой специфичностью были выделены из актиномицетов (Oishi, Aida, 1971), простейших (Yates el al., 1975; Cavazzoni el al., 1987), зерен кофе (Zarmitz, ICabat, 1960; Dey, Pridham, 1972) и батата (Chien, Lin-Chu, 1991). Известны примеры успешного переливания людям (добровольцам) энзиматически (а-Гал из зерен кофе) трансформированных эритроцитов (Goldstein et al., 1982; Goldstein, 1984; Lenny et al., 1991; 1994; 1995). Однако, технологичного препарата фермента так и не было получено.
Практическое решение вопроса затруднено отсутствием источников относительно дешевых ферментов, способных проявлять высокую активность непосредственно на эритроцитах в физиологических (рН, температура, ионная сила) условиях. Таким образом, поиск новых, более доступных и эффективных источников специфичных и стабильных ферментов для крупномасштабной модификации эритроцитов является актуальным. Другой важнейшей областью применения а-Гал является их использование в сельскохозяйственной биотехнологии и пищевой промышленности для гидролиза а-галактозидных связей, присутствующих в раффинозе, мелибиозе и стахиозе, обычно встречающихся в сое, что снимет ограничения в потреблении данных продуктов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение таксономической структуры и особенностей распространения морских бактерий -потенциальных продуцентов а-Гал и а-ГалКАц, выделенных из разных источников и обитающих в различных акваториях Мирового океана, а также поиск продуцентов гликозидаз, инактивирующих антигенную специфичность А и В эритроцитов, удовлетворяющих требованиям биотехнологии.
Для выполнения поставленной цели решали следующие задачи:
-
Определение таксономического состава морских микроорганизмов - потенциальных продуцентов ферментов.
-
Изучение особенностей распространения бактерий-продуцентов сс-Гал и сс-ГалЫАц, принадлежащих к различным таксономическим группам, в различных районах Мирового Океана.
-
Проведение отбора перспективных для биотехнологии штаммов бактерий, синтезирующих гликозидазы.
-
Фенотипическая и филогенетическая характеристика штамма бактерий КММ 426 -продуцента уникальной a-N-ацетилгалактозаминидазы.
Научная новизна. Впервые на основании изучения штаммов микроорганизмов, выделенных из морской воды, донных осадков, а также анализа микробных ассоциаций морских растений и животных собранных в заливе Петра Великого на морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, во время экспедиционных рейсов НИС "Академик Опарин" в Охотском море и в тропических районах Тихого океана, установлено таксономическое положение бактерий, синтезирующих a-Гал и a-ГалЫАц и выявлены особенности их распространения в различных районах Мирового Океана. Так, бактерии, синтезирующие a-Гал, чаще встречались в северо-западных водах Тихого океана, в южных районах Тихого и Индийского океанов преобладали продуценты а-ГалИАц. Показано, что штаммы-продуценты более многочислены среди симбиотрофов животных, чем среди свободноживущих микроорганизмов. Впервые получены штаммы морских микроорганизмов, продуцирующие ферменты, обладающие специфичностью к групповым веществам крови человека и удовлетворяющие требованиям биотехнологии.
Из штамма Pseudoalteromonas sp. КММ 701, выделенного из морской воды, получена a-Гал, модифицирующая эритроциты В группы крови человека в эритроциты О группы. Охарактеризован изолированный из пробы донных осадков штамм бактерий КММ 426 - продуцент уникальной а-ГалЫАц, которая инактивирует иммунодетерминанты эритроцитов А группы крови, превращая их в эритроциты О группы.
Дано описание нового рода бактерий семейства Flavobacteriaceae - Arenariobacter, представляющую собой отдельную филогенетическую ветвь в группе Flavobacterium-Cytophaga-Bacteroides. Описан новый вид Arenariobacter latericius.
Практическая значимость. Изучение таксономической структуры морских микроорганизмов, как свободноживущих, так и ассоциированных с макрогидробионтами, их способности синтезировать физиологически активные вещества может дать новые знания о роли ассоциативной микрофлоры в жизнедеятельности населяющих Океан организмов и, в конечном счете, функционировании морских экосистем. Выявление особенностей распространения бактериальных продуцентов гликозидаз может способствовать более успешному поиску данных ферментов. Фундаментальное значение имеет описание нового для ситематики морских микроорганизмов рода бактерий Arenariobacter, отнесенного нами к семейству Flavobacteriaceae, и нового вида A. latericius. Полученные, охарактеризованные и запатентованные гликозидазы используются в структурных и биохимических исследованиях и могут быть основой для биотехнологического производства ферментов
с заданной субстратной специфичностью. Изучение энзиматического воздействия на клеточные антигены открывает возможность направленного изменения антигенной структуры биологических материалов при условии применения ферментов с точно установленной субстратной специфичностью. а-Гал также могут быть использованы для гидролиза а-галактозидных связей, присутствующих в раффинозе, мелибиозе и стахиозе. Эти сахара, обычно встречающиеся в сое, не метаболизируются человеческим организмом в связи с отсутствием а-Гал в желудочно-кишечном тракте, что вызывает дискомфорт пищеварения и является главным ограничением потребления продуктов из семян бобовых растений.
Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены на International Science Conf. "Bridges of Sience between North America and the Russian Far East" (Ancorage, Alaska, U.S.A., Aug. 25-27, Vladivostok, Russia, Aug.29 - Sept.2, 1994), International Conf. of the North Pacific Marine Science Organization (PICES) "Workshop on the Okhotsk Sea and Adjacent Areas" (Vladivostok, Russia, June 19-24, 1995), II Дальневосточной региональной конференции с всероссийским участием "Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке (27-29 апреля, Владивосток, 1998), научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 1998), Eighth International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8) (Halifax, Canada, Aug. 9-14, 1998).
Материалы диссертации изложены в 11 печатных работах, получено положительное решение на патент РФ «Штамм морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 - продуцент а-галактозидазы».
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на стр. машинописного текста, список литературы из названий, из них - зарубежные.