Биологические свойства и роль бактероидов в этологии острых парапроктитов и других хирургических инфекций Слизень, Вероника Вячеславовна

Введение к работе

Актуальность темы диссертации

Инфекции, вызываемые бактероидами, являются важной проблемой практической медицины, что связано с высоким удельным весом бактероидов в патологии человека, тяжелым течением вызываемых ими заболеваний, трудностями их диагностики и низкой эффективностью терапии [Титов Л. П., 1998; Finegolu S. М., 1995].

Парапроктит - одно из самых распространенных проктологиче-ских заболеваний, частота которого не имеет тенденции к снижению. Его удельный вес в структуре проктологической патологии составляет 10 - 30% [Альф И. М. и др., 1994; Коплатадзе А. М. и др., 1994; Brook I. е.а., 1997]. Традиционные представления о решающей роли аэробных и факультативно-анаэробных бактерий в этиологии острых парапрокти-тов сформировались в связи со сложностью бактериологической диагностики облигатных анаэробов. Неоднозначность оценки участия анаэробных бактерий при смешанной аэробно-анаэробной инфекции оставили открытым вопрос о значении анаэробов в генезе этого заболевания. Единичные исследования не дают четкого представления о частоте выделения и доминирующих видах грамотрицательных облигатно анаэробных бактерий в этиологии острых парапроктитов [Альф И. М. и др.. 1994; Коплатадзе А. М. и др., 1994; Brook I. et al., 1997].

Стремительность и тяжесть развития анаэробных хирургических инфекций и необходимость срочного определения тактики лечения диктуют необходимость внедрения и разработки методов ускоренной диагностики анаэробных инфекций [Истратов В. Г., 1991; Egerer К. е.а., 1983;KrausseR. е.а.. 1991].

Распространение резистентности Bacteroides spp., особенно В. fragilis, к пенициллину, ампициллину, цефокситину, эритромицину, тетрациклину, имипенему, клиндамицину и метронидазолу представляет серьезную проблему [Wexler Н. М. е.а., 1997; Falagas М. е.а., 2000; Shnydman D. R. е.а.. 1999]. Уровни, спектр и частота резистентности анаэробных микроорганизмов могут варьируют в различных клиниках и регионах, в связи с этим неоспоримо значение территориального мониторинга резистентности в Республике Беларусь [Wexler Н. М., 1997; Shnydman D. R. е.а, 1999, 2000; Falagas М., 2000].

Таким образом, проблема заболеваний, ассоциированных с гра-мотрицательными неспорообразующими анаэробными бактериями, требует пристального внимания медицинской науки и практического здравоохранения.

Связь работы с крупными научными программами

Диссертационная работа выполнялась в течение 1998 - 2003 гг. на базах лаборатории клинической и экспериментальной микробиологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии; кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии БГМУ; анаэробной референс-лаборато-рии отделения клинической микробиологии госпиталя Уэльского университета (г. Кардифф, Великобритания). Отдельные этапы работы являлись частью государственной научно-техшіческоіі программы «Инфекции и медицинские технологии»:

1. «Разработать газогенераторные системы для культивирования анаэробных микроорганизмов», (№ госрегистращш 19983418,1998 -2000 гг.);

2. «Разработать питательные среды для культивирования строгих анаэробов и капнофилов, среду для определения чувствительности к антибактериальным препаратам» (№ госрегистрацин 20012330. 2001 -2002 гг.).

Цель и задачи исследования

Цель исследования: изучить биологические свойства бактероидов и разработать научные основы эмпирической шггибиотикотерапии и лабораторной диагностики вызываемых ими острых парапрокпггов и других хирургических инфекций.

В связи с поставленной целью исследовании были сформулированы следующие задачи:

3. Установить частоту выделения и видовой состав грамотрица-тельных анаэробных микроорганизмов рода Bacteroides при прокто-логической и хирургической патологии.

4. Изучить биохимические свойства бактероидов и спектр продуцируемых ими летучих жирных кислот (ЛЖК), разработать тест-систему для биохимической идентификации анаэробов и метод экспресс-диагностики анаэробных инфекций, основанный на ПЖХ анализе ЛЖК.

3. Провести молекулярно-биологическую идентификацию выделенных от больных с проктологической и хирургической патологией культур грамотрицательных облпгатно анаэробных микроорганизмов на основании различий в структуре 16 S рРНК оперонов и оценить эффективность метода в идентификации бактероидов.

4. Определить частоту, спектр и уровни атибиотикорезпстентио-сти бактероидов, выделенных от больных с острым парапроктитом, и установить группы эффективных в эмпирической терапии парапрок-титов антибиотиков; провести анализ молекулярных детерминант ре-

зистентности к имипенему и метронидазолу у изолятов бактероидов.

Объект и предмет исследования

Объектами исследования являлись 178 пациентов проктологнче-ских и хирургических отделений лечебно-профилактических учреждений г. Минска, и выделенные у обследованных пациентов 266 культур грамотрицательных облигатно анаэробных микроорганизмов. Предметом исследования являлись биологические и молекулярные свойства, обусловливающие инициацию и поддержание патологического процесса, позволяющие проводить эффективную диагностику анаэробных неклостридиальных инфекций.

Гипотеза

Бактероиды играют значимую роль в этиологии острых парапрок-титов и других хирургических инфекций, обладая факторами патогенності! и резистентностью к антимикробным агентам, а также генетическими детерминантами их определяющими.

Методология и методы проведенного исследования

Методологическую основу работы составили эмпирические (наблюдение, измерение, практический эксперимент, моделирование и др.) и логические (доказательство, объяснение, выведение следствии и др.) методы научного познания.

В ходе выполнения работы использованы микроскопический, бактериологический, молекулярно-биологические. физико-химические методы исследования: метод светооптической микроскопии; методы создания и поддержания анаэробиоза; методы выделения чистых культур микроорганизмов с использованием механического разобщения и селективных сред; методы биохимической идентификации микроорганизмов и методы компьютерного бпоанализа; методы изучения чувствительности бактерий к антибиотикам (диско-днффузионный и микроразведений), метод ГЖХ анализа ЛЖК (усовершенствованный нами); молекулярно-генетические методы (ПЦР, ПДРФ, секвенирование генома); методы биоинформатики и вариационного статистического анализа.

Научная новизна и значимость полученных результатов

Получены новые данные о частоте выделения Bacteroides spp. и их отдельных видов при острых парапроктитах и хирургической патоло-

гни и доказана их этиологическая роль в развитии этих заболеваний.

Установлены различия в структуре 16 S рРНК оперонов у различных видов Bacteroides spp., которые использованы в видовой идентификация бактероидов.

Усовершенствован метод ГЖХ анализа ЛЖК, используемый в экспресс-диагностике анаэробных инфекций, определены хромато-графические критерии присутствия анаэробных микроорганизмов в биологическом материале; проведена оценка ЛЖК как факторов патогенносте анаэробных микроорганизмов.

Получены новые данные о спектре, частоте и уровнях резистентности бактероидов к современным антибиотикам и определены группы антимикробных препаратов эффективных для эмпирической терапии парапроктитов.

Изучена частота встречаемости cfi А и nim А, В, С, D, Е генов -генетических детерминант резистентности к наиболее эффективным в отношении бактероидов препаратам: имипенему и метронидазолу.

Практическая значимость полученных результатов

Доказана этиологическая роль бактероидов в развитии острых парапроктитов.

Установлены наиболее активные антибактериальные препараты в отношении грамотрнцательных анаэробных микроорганизмов рода Bacteroides. Результаты изучения лекарственной устойчивости являются основой для разработки научно-обоснованной политики применения антибиотиков.

Разработана инструкция по применению метода газо-жидкостной хроматографии летучих жирных кислот в экспресс-диагностике анаэробных инфекций.

Разработан лабораторный регламент тест-системы для биохимической идентификации анаэробных микроорганизмов.

Создана коллекция грамотрнцательных анаэробных микроорганизмов, играющих роль в проктологической и хирургической патологии человека.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

І. В развитии острых парапроктитов значимую роль играют бактероиды, доминирующими среди которых являются В. fragilis, В. thetaiotaomicron, В. distasonis.

2. Различия в структуре 16 S рРНК оперонов, выявляемые методами ПЦР-ПДРФ анализа и секвенировапием, позволяют проводить

точную видовую идентификацию Bacteroides spp..

3. Летучие жирные кислоты являются маркерами анаэробных
микроорганизмов и их присутствие в материале от больных является
критерием для постановки предварительного диагноза анаэробных
инфекций. ЛЖК являются фактором патогенности бактероидов: ЛЖК
присутствуют в материате от больных и продуцируются чистыми
культурами Bacteroides spp. в патогенетически значимом количестве.

4. Частота и уровень резистентности бактероидов зависят от вида
антимикробного препарата и подвержены динамическим изменениям,
что требует определения эффективных антибиотиков для эмпириче
ской терапии инфекций, обусловленных бактероидами. Приобретен
ная резистентность к метронидазолу и имипенему, используемых в
терапии неклостридиальных анаэробных инфекций, связана с піт А.
В, С, D, Е и ctl А генами.

Личный вклад соискателя

Диссертантом лично осуществлена разработка подходов к решению поставленных задач, получен, обобщен, проанализирован и опубликован экспериментальный материал работы. Соавторами научных работ диссертанта являются сотрудники анаэробной референс-лаборатории отделения клинической микробиологии госпиталя Уэльского университета (г. Кардифф, Великобритания), осуществлявшие методические консультации при проведении молекулярно-бпологических исследований, а также сотрудники проктологического отделения 3-ей городской клинической больницы г. Минска, п хирургических отделений 10-й городской клинической больницы и больницы скорой медицинской помощи г. Минска, осуществлявших клиническое наблюдение больных и забор материала для исследований.

Апробация результатов диссертации

Основные положения диссертационной работы доложены на: 1) Заседании Минского городского научного медицинского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, г. Минск, 4 ноября 1999 г.; 2) VIII международном симпозиуме «Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии», г. Минск, 2000; 3) Научно-практическом семинаре «Современные методы лабораторной диагностики вирусных и бактериальных инфекций», г. Минск, 2000; 4) Республиканской научно-практической конференции с международным участием по проктологии: "Функциональные и воспалительные забо-

левания толстой кишки: хирургические и терапевтические аспекты. Новое в колопроктологии", г. Минск, 2001; 5) Юбилейной научной конференции БГМУ «Актуальные проблемы современной медицины», г. Минск, 2001; 6) Конференции факультета повышения квалификации, БелМАПО «Биологические свойства бактероидов», г. Минск, 2001; 7) Международной конференции «Микробиология и биотехнология XXI столетия», г. Минск, 2002; 8) 6-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», г. Пушино, Россия, 2002; 9) X^th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology "The world of microbes", Paris, France, 2002; 10) Заседании кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии БГМУ, г. Минск, 2002; 11) Республиканском семинаре «Организация системы мониторинга антибиотикорезистентности микроорганизмов», г. Минск, 2002; 12) Ежегодной научно-практическая конференции БГМУ, г. Минск, 2003; 13) Обучающем семинаре «Современные методы диагностики вирусных и бактериальных инфекций и детекции возбудителей в объектах окружающей среды», г. Минск, 2003; 14) 6^th International Meeting on Microbial Epidemiological Markers, Lcs Diablerets, Switzerland, 2003.

Опублнковапность результатов

Основные положения диссертационной работы опубликованы в 25 научных работах, из которых 5 статей - в рецензируемых журналах, 2 статьи - в сборниках, 6 статей - в материалах конференций. 4 тезиса - в рецензируемых журналах, 8 тезисов - в докладах конференций. Общий объем публикаций составил 74 страницы.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в своей структуре содержит следующие части: введение, общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы собственных исследований, заключение, список использованных источников и приложение.

Работа изложена на 146 страницах, содержит 19 таблиц, 34 рисунка. Список использованных источников включает 350 наименований.