Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени в зарубежной и отечественной литературе большое внимание уделяется биологически активным веществам, которые при действии на микроорганизмы вызывают разные эффекты. Так, на стимулирующее действие в микродозах химических соединений, обладающих мутагенным и ДНК-повреждающим эффектами в высоких концентрациях, впервые обратил внимание Рапоппорт (1960). В последующем стимулирующее действие химических мутагенов было продемонстрировано на различных растительных, животных (Рапопорт, 1980; 1986) и микробных клетках. Не только химические соединения, но и природные вещества, например антибиотики, в высоких концентрациях оказывают бактерицидное действие, тогда как в малых дозах стимулируют рост бактериальных культур (Шигаева, 1979). Аналогичные данные получены и для таких веществ природного происхождения, как ферменты.
Определенный интерес в этом плане представляет внеклеточная рибонуклеаза Bacillus intermedius, разрабатываемая для использования в медицине в качестве противовирусного и противоопухолевого средства, каталитические и физико-химические свойства которой детально изучены (Булгакова, 1974; Голубенко и др., 1979, 1982; Яковлев и др.,1987; Макаров, 1993).
Показано, что РНКаза B.intermedius (биназа) обладает широким спектром биологических эффектов при воздействии на клетки. Известно, что при действии на живую клетку в микродозах РНКаза стимулирует рост и деление микроорганизмов и растительных клеток, повышает уровень митохондриального дыхания микромицетов, вызывает у ряда бактерий и дрожжей активирование биосинтетических процессов и изменение проницаемости клеток для ионов. Установлено, что эффект РНКазы не связан с увеличением в среде культивирования концентрации предшественников нуклеиновых кислот, в том числе продуктов гидролиза РНК (Куприянова-Ашина и др., 1990; Колпаков, 1993; Ильинская, 1995; Колпаков и др., 1996;). Вместе с тем в серии бактериальных тест-систем показано, что этот же фермент в высоких концентрациях обладает выраженным мутагенным действием (Иванченко и др., 1992).
Несмотря на многочисленные данные, касающиеся проявления мутагенного, ростстимулирующего и других эффектов экзогенной РНКазы, механизмы различных биологических эффектов фермента остаются до конца не выясненными. Большая часть исследований проводилась с использованием каталитически активной природной РНКазы, поэтому трудно определить, какой
4 вклад вносит ферментативная активность в проявление разнообразных видов биологического действия экзогенных рибонуклеаз. Однако, имеются единичные сообщения о том, что ростстимулирующий эффект фотоинактивированной РНКазы в 1,5 раза меньше, чем активной (Колпаков, 1993), а мутагенное, токсическое и антивирусное действие вызывает только нативный фермент (Куриненко и др., 1989; Ilinskaya et al.,1995) Вместе с тем литическое и статическое действие по отношению к клеткам карциномы Эрлиха вызывается в одинаковой степени инактивированным и активным ферментом (Куриненко и др., 1988).
Таким образом, анализ данных литературы на сегодняшний день позволяет признать, что вклад каталитической активности в проявление тех или иных функций экзогенных РНКаз неодинаков. По-видимому, эффект РНКазы связан как с ее ферментативной активностью, так и мембанотропными свойствами белка. При этом преобладающая роль одной из этих двух составляющих в каждом случае достаточно индивидуальна. Безусловно необходимо дальнейшее изучение механизмов, ответственных за переключение биологических процессов, обуславливающих разнообразные эффекты РНКазы.
Все изложенное свидетельствует об актуальности проблемы регуляции клеточного ответа на внешнее воздействие с участием РНКазы B.intermedius. Для расширения представлений о проявлении биологических эффектов РНКазы нами впервые предложено исследовать эффекты мутантных РНКаз, полученных методом сайт-специфического мутагенеза, с пониженной активностью.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение механизмов, участвующих в переключении ответа клеток бактерий при воздействии природной РНКазой B.intermedius и ее мутантними производными в ростстимулирующих и ростингибирующих дозах.
В задачи экспериментальных исследований входило:
1. Получение гомогенных препаратов РНКазы B.intermedius и ее
производных с различной ферментативной активностью, полученных методом
сайтнаправленного мутагенеза.
-
Изучение действия на рост культур грамотрицательных и грамположительных бактерий РНКаз с различной величиной каталитической активности.
-
Выявление SOS-индуцирующей функции экзогенной РНКазы B.intermedius с целью выяснения роли каталитической аткивности в процессе индукции SOS-ответа бактериальной клетки и генотоксического действия фермента.
4. Изучение влияния РНКазы B.intermedius на функции мембраны (возрастание проницаемости) бактерий в зависимости от концентрации фермента и его каталитической активности.
Научная новизна работы. Впервые были получены и очищены до химически гомогенного состояния мутантные производные РНКазы B.intermedius, которые имели единичные замены аминокислотных остатков в каталитическом участке активного центра фермента и отличались по величине каталитической активности от природной РНКазы. Полученные мутантные формы с заменами Lys 26 на Ala и His 101 на Glu имели активность при расщеплении различных субстратов 30% и 2,5%, соответственно, от активности исходной бациллярной РНКазы.
Установлено, что РНКазы с различной каталитической активностью в определенной низкой концентрации способны стимулировать рост культур бактерий E.coli и B.subtilis. Ростстимулирующий эффект проявляется в одинаковой степени независимо от различий в строении клеточных поверхностей грамотрицательных и грамположительных бактерий. Максимальное стимулирующее действие наблюдается при одинаковой концентрации ферментов (0,001-0,01 мкг/мл), имеющих разную активность. Основной вклад в процесс стимуляции роста и деления бактериальных клеток вносит каталитическая активность РНКазы; эффект природной бациллярной РНКазы выражен в 3 раза сильнее, чем ее мутантной формы с 2,5% остаточной ферментативной активности.
Показано, что бациллярная природная РНКаза в высоких концентрациях (1000 мкг/мл), превышающих ростстимулирующую на 5-6 порядков, обладает мутагенным действием. SOS-ответ клетки на тест-штамме E.coli индуцируется только при наличии ферментативной активности у РНКазы, неактивная HislOlGlu-РНКаза в той же концентрации не индуцировала SOS - ответ клетки.
Отмечено, что под действием каталитически активной биназы в ростстимулирующей дозе, в отличие от малоактивной HislOlGlu-РНКазы, происходит изменение ионной проницаемости бактерий E.coli и B.subtilis. Бациллярная РНКаза в высоких концентрациях, близких к мутагенным (100-1000 мкг/мл), индуцирует выход свободных нуклеотидов из клеток E.coli и B.subtilis.
Таким образом, впервые получены данные, позволяющие считать, что тригтерным механизмом, ответственным за проявление того или иного ответа клетки на воздействие РНКазы, являются функциональные изменения в мембранах, которые возникают в процессе перехода от низких доз к высоким.
Практическая ценность работы. РНКазы с различной активностью, полученные в результате сайт-направленного мутагенеза, могут быть использованы в качестве инструмента при разработке способов их применения в
медицине, различных отраслях микробиологической промышленности, когда і каждом конкретном случае для проявления эффекта требуется каталитически активность или он может быть вызван инактивированным ферментом.
Индукция мутаций РНКазой в высоких концентрациях, связанная с каталитической активностью фермента на уровне популяции может быть рассмотрена как благоприятный фактор, увеличивающий возможность ее выживания в природных условиях.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на Международной конференции «Геном. Структура и функциональный анализ» (Москва, 1994); IV Международной конференции по биотехнологии (Мельбурн, Австралия, 1995); Международной конференции, посвященной 100 летию Бейеринка (Гаага, Нидерланды, 1995); VII Европейском конгрессе по биотехнологии (Ница, Франция, 1995); IV Международном симпозиуме «Рибонуклеазы» (Гронинген, Нидерланды, 1996); III Международной конференции по молекулярной биологии (Москва, 1997); XI Всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов'98» (Казань, 1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста; состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 13 таблиц, 13 рисунков. Список литературы содержит 106 отечественных и 67 иностранных авторов.