Введение к работе
Актуальность проблемы. Сибиреязвенный микроб является возбудителем острой зооантропонозной инфекции, эпидемические и эпизоотические проявления которой имеют большую социальную и экономическую значимость. При современном мировом уровне заболеваемости людей от 20 до 100 тыс. в год (Бургасо'в П.П., Рожков Г.И., 1984) сибирская язва продолжает представлять собой серьезную проблему ддя здравоохранения и сельского хозяйства многих стран, включая Россию.
Потенциал инфекции поддерживается существованием множества
почвенных очагов, которые проявляют себя ежегодными вспышками
сибирской язвы сельскохозяйственных животных и сопутствующими
им заболеваниями людей. На Северном Кавказе трудно найти
населенный пункт или хозяйство, где за последние 40 лет не
регистрировалась, хотя бы спорадически, сибирская язва. Чеченская
Республика, например, относится к регионам, где эта инфекция
отмечается ежегодно, только официально зарегистрировано 157
стационарно неблагополучных по этой инфекции крупных
населенных пунктов, в которых учтено 276 почвенных очагов (Еременко Е.И. с соавт.,1996). С большим постоянством случаются спорадические вспышки этой инфекции в Ставропольском крае, где на учете имеется 723 почвенных очага, Карачаево-Черкесской Республике, Кабардино-Балкарской Республике, Ресгтублике Северная Осетия, Дагестане (Богданов И.К. и Пугачева О.И., 1991, Н.П.Буравцева с соавт, 1992, 1594).
В 1990 - 1996 г заболеваемость людей сибирской язлой в РФ колебалась от 0,016 до 0,032 па 100000 населения, ' при этом
тенденции к снижению не наблюдалось. В 1992 и 1993 году отмечались две крупные вспышки инфекции в Карачаево-Черкесской и Кабардино-Балкарской республиках. В нынешних условиях перехода к рыночной экономике с нарушенными прежними и еще не сложившимися новыми экономическими механизмами, ослаблением государственного контроля за природопользованием, животноводством, производством н реализацией его продуктов, снижением качества лабораторной, противоэпидемической, ігротивозішіюотической и лечебной работы в России и странах СНГ следует ожидать подъема заболеваемости сибирской язвой.
Характерная особенность сибирской язвы - возможность внезапной актишізацші инфекции даже в экономически развитых странах, где животноводство исторически является одной из ведущих отраслей хозяйства. Примером может служить эпизоотия этой инфекции в Австралии в 1997 году, неожиданно возникшая на фоне многих десятилетий полного благополучия.
Типичные проявления сибирской яззы последних лет. в разшггых странах представлены отдельными случаями заболеваний людей в результате инфицирования при контакте с импоршрованным сырьем или продукцией животноводства. Число подобных случаев может увеличиться в связи с расширением импорта из неблагополучных стран.
В числе целого ряда неразрешенных вопросов, составляющих глобальную проблему сибігрекой язвы, по-прежнему актуальньшн для изучения остаются механизмы заражения животных в естественных условиях, переживания возбудителя сибирской язвы во внешней среде и оопутствующих этой фазе его жизненного цикла изменения основных свойств, поиск характерных особеностей разных штаммов., пригодных для использования в качестве
эпидемиологических маркеров, защита организма чувствительных животных от так называемых "вакцинорезистентных" штаммов В. anthracis.
Свидетельством интереса ученых многих стран к перечисленным вопросам является существоваїше и успешное выполнение программы по созданию новых вакцин против сибирской язвы.
Сибиреязвенный микроб служит объектом исследования уже
более 100 лет, однако и сейчас многие свойства этого
микроорганизма остаются неясными. В последнее десятилетие
появилось много работ, которые позволяют по - новому взглянуть на
известные свойства B.anthracis. Возобновление интереса к
возбудителю сибирской язвы и к самой инфекции свидетельствует о
неудовлетворенности ученых своими представлениями о них и
недостаточной эффективности существующей системы
протшюсибиреязвенных мероприятий.
В настоящее время патогенность сибиреязвенного мккроба ассоциируется с наличием у него двух основных факторов -экзотоксина и капсулы. Установлено, что продукция этих факторов детерминируется плазмидами pX01(Mikesell P. et al.,1983) и рХ02 (Green B.D. et аІ.» 1985, Uchida I. et al., 1985). Считается, что сибиреязвенный микроб становится авирулентным, утратив любую из этих плазмид или обе. Очевидно, однако, что патогенность является полидетерминантньш признаком и не исчерпывается этими двумя факторами.
Среди штаммов сибиреязвенного микроба имеется значительная доля атипичных по патогенности и ряду свойств, вероятно, с нею связанных. Часть атипичных штаммов с такими свойствами была выделена из почвы, являющейся альтернативной средой обитания
для сибиреязвенного микроба. Эпидемическая и эпизоотическая значимость этих штаммов не выяснена, как и возможность реверсии к нормальному фенотипу. Поэтому при выделении таких штаммов всегда возникает вопрос, следует ли проводить все те же мероприятия, что и при выделении типичных вирулентных штаммов. Малая изученность подобных штаммов, на наш взгляд, связана не в последнюю очередь с тем, что не разработаны методы их выделения и идентификации.
Значительный прогресс в изучении биологических основ патогенности B.anthrach был достигнут благодаря разработке чолекулярно-биолошческих методов исследования применительно к этому объекту. Однако следует иметь в виду, чго основные данные были получены при изучении разработанных изогенных систем штаммов с разным набором плазмид, сконструированных на основе типичных вирулентных или аттенуированных вакцинных штаммов. Представляет большой интерес проведение подобных исследований на атипичных штаммах, для чего первоочередным делом является конструирование изогенной системы на основе атипичного по патогенности штамма сибиреязвенного микроба. Немаловажным представляется также, адаптация разработанных молекулярно-биологических методов применительно к атипичным штаммам.
Установлено, что популяционный состав культур сибиреязвенного микроба по многим признакам варьирует, однако данных о связи количества клонов с разным фенотипом и генотипом в сосгаве популяции с патогенностью и об ее изменениях л зависимости от состава практически нет.
Наконец, до сих пор нет единой признанной схемы внутривидовой дифференциации сибиреязвенного микроба, в которой было бы место для атипичных штаммов, из-за чего различия
в вирулентности определяются количественно и не отражают разнообразия вариантов возбудителя сибирской язвы.
Таким образом, актуальность работы связана с недостаточной
изученностью особенностей атипичных штаммов сибиреязвенного
микроба, имеющих значение для их патогенності, изучение которых
может способствовать усовершенствованию методов лабораторной
диагностики, профилактики и тактики проведения
противоэпидемических мероприятий.
Цель работы. Получение экспериментальных данных о биологических и популящгонных свойствах штаммов B.anthracis с атипичной патогенностью и применеігае полученных данных в лабораторной диагностике, профилактике и эпидемиологии сибирской язвы .
Для достижения этой цели были поставлены задачи:
І.Конструирование и усовершенствовшше специальных питательных сред для выделения и изучения атипичных по патогенности штаммов сибиреязвенного микроба.
2.Разработка метода выделешга атипичных штаммов Bacillus anthrvcis,
3.Создание метода исследования популяционного состава штаммов сибиреязвенного микроба по основным признакам, связанным с патогенностью.
4.Модкфикация методов выделения нуклеиновых кислот возбудителя сибирской язвы .
5.Изучение основных фенотипов капсуло- и
токсинообразования in vitro сибиреязвенного микроба .
б.Определепие частоты встречаемости штаммов Bacillus anthracis с атипичной патогенностью .
7.Исследование пбпуляционного состава штаммов возбудителя сибирской язвы, атипичных по патогенності!, чувствительности к антибиотикам, по признакам капсуло-, токсинообразования, гемолитической и протеолитической активности, потребности в ароматических аминокислотах.
8.Сравнительное изучение вирулентности атипичных штаммов для разных лабораторных животных.
9. Разработка метода дифференциации штаммов Bacillus anlhracis по патогенності! in vitro.
10.Разработка метода отбора иммуногенных вакцинных штаммов in vitro.
11.Создание прототипов перспективных полирезистентньгх вакцинных штаммов.
12-Определение критериев оценки эпидемической значимости атипичных штаммов и схемы внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы.
Научная новизна работы.
Впервые предложены методы выделения штаммов сибиреязвенного микроба с атипичным капсулообразованием и вирулентностью.
Впервые показано, что фенотишгческое выражение капсулообразования и токсинообразования, протеолитической и гемолитической активности в отношении определенных субстратов in vitro, зависимость от аминокислот у сибиреязвенного микроба носят характер, свойственный группам штаммов с разной патогенностью и могут сочетанно изменяться соответственно степени патогенносте.
Впервые установлено, что популяции штаммов S.antkracls неоднородны по вышеперечисленным, признакам, морфологии
колоний на плотных питательных средах, плазмидному составу п представлены субпонуляциями, которые могут быть выделены в віще стабильных или диссоциирующих культур. Идентифицированы основные группы штаммов по признакам фенотипа, плазмидотипа и однородности популяции по этим признакам. Показано, что возрастание вирулентности в процессе пассирования пггаммов с атипичной патогенностыо через организм белых мышей сопровождается направленной перестройкой популяции штамма и прослежена ее динамика.
Впервые с учетом изменения популяционных свойств предложены критерии эпидемической значимости и тест для атипичных штаммов на реверсию к патогенности.
Разработаны прототипы перспективных полирезистентных вакцинных штаммов на основе штамма СТИ-ПР с устойчивостью к пенициллину, рифамшщину и тетрациклину, а также пенициллину, рифамгпщину я канамицину.
Подобрана коллекция из 6 различающихся по фенотипу капсуло-, токсинообразования и плазмидному составу изогенных вариантов, полученных на основе атипичного штамма сибиреязвенного микроба .
Предложены рецептуры новых сухих питательных сред для выделения - и " культивирования сибнреязвеннного микроба на непищевых основах.
Впервые предложена среда для сочетанного определения продукции капсулы и экзотоксина сибиреязвенного микроба.
Впервые разработаны новые методы оценки культур сибиреязвенного микроба по патогенности и иммуногенности in vitro.
Впервые предложен метод восстановлепия вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба.
Разработан метод получения нуклеиновых кислот сибиреязвенного микроба.
На среду для сочетапного определения продукции экзотоксина и капсулы сибиреязвенного микроба, способ дифференциации культур сибиреязвенного микроба по вирулентности in vitro, способ отбора нммуногенпых субкультур сибиреязвенных вакцинных штаммов in vitro, способ повышения вирулентности сибиреязвенного микроба и способ получения нуклеиновых кислот у Bacillus unthraris получены положительные решения о выдаче патентов па изобретения.
Теорегическая значимость и практическая цепиоегь.
Полученные данные о нопуляционных особенностях атипичных .штаммов и перестройке поігуляїпіи, коррелирующей с изменениями патогенності! култ>тур, могут иметь значение для развитая представлений о механизмах реализации натогенности и приспособления сибиреязвенного микроба к условиям обитания во внешней среде.
Новые специальные питательные среды и методы исследования сибиреязвенного микроба вошли в практику ь виде выпускаемой среды сухой для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба, а также следующих технологических, ішструктивньїх и методичесгагх документов:
- Изменения к временной фармакопейной статье на питательную среду для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба на основе аминопептида ВФС42-41ВС-86, утвержденные начальником Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники в 1987 г.
Регламент производства на сухую среду для выделения п
культивирования сибиреязвенного микроба па основе
амшюпептида № 72-87, утвержденные начальником
Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники в 1987 г.
Инструкция по применению среды для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба сухой, утвержденные начальником Управления по контролю качестпа лекарственных средств и медицинской техники в 1987 г.
Методические указания "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и люден, обнаружение возбудителя п сырье животного происхождения и объектах внешней среды", Москва, 1989 (Утверждены начальником ГУКИ МЗ СССР и начальником ГУВГ агропромышленного комитета СССР 1.09.1986.)
Фармакопейная статья ФС 42-437Р.С-94 на питательную среду для выделения и купьтипіпровапия сибиреязвенного микроба, сухую, утвержденная начальником Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники 22.07.1994 г.
Регламент производства на питательную среду для выделения к культивирования сибиреязвенного микроба, сухую, утвержденный начальником Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники 22.07.1994 г.
- Инструкция по приготовлению и контролю питательной
среды для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба
и инструкция по применению питательной среды для выделения и
культивирования сибиреязвенного микроба, утвержденные
началышком Управления по контролю качества лекарственных
средств и медицинской техники 22.07.1994 г.
Методические рекомендации по выделению штаммов сибиреязвенного микроба с атипичным капсулообразованием и вирулентностью, утвержденные заместителем начальника ГУКИ Ш СССР 28.12.1987 г.
Методические рекомендации по оценке патогенных и нммуногенных свойств сибиреязвенных культур in vitro, утвержденные первым замесгителсм министра здравоохранения РФ 31 января 1997 г.
Методические рекомендации по дифференциации штаммов енбиреязвеиого микроба по патогенности in vitro, утвержденные директором СНИПЧИ в 1993 г.
Методические рекомендации по отбору иммуногешшх субкультур сибиреязвенных вакцинных штаммов in. vitro, утвержденные директором СНИПЧИ в 1993 г.
Методические рекомендации по определению потребностей штаммов сибиреязвенного микроба в факторах роста, утвержденные директором НИПЧИКиЗ в 1990 г.
Кроме того, вопросы лабораторной диагностики и профилактики сибирской язвы нашли отражешіе в двух целевых комплексных программах:
"Профилактика особо опасных инфекции и санитарная охрана rsppirropiiii Ставропольского края от завоза и ' распространения '.онвенционных инфекционных заболеваний" на 1993 - 1995 гг., утвержденной постановлением главы администрации края 14.10.1993 г.;
"Обеспечение эпидемического благополучия по особо опасным
и прнродно-очагог.ым заболеваниям и улучшение медико-
>колошческой обстановки на Юге России" на 1994 - 1996 гг.,
одобренной решением Совета ассоциацгаї республик, краев и областей Северного Кавказа 15.05.1994 г.
Научные и практически значимые результаты работы используются в лекционном курсе по эпидемиологии, микробиологии и профилактике сибирской язвы для слушателей функциошфугоших при СНИПЧИ курсоп специализации врачей общей медицинской сети и курсов первичной специализации работников противочумной службы страны.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Метод выделения штаммов сибиреязвенного микроба с использованием селективной среды для Bacillus anthracis позволяет выделять как типичные, так и шгаммы с атипичным капсулообразованием и вирулентностью
2.. Предлагаемая питательная среда для сочетанного оігределеїтя продукции экзотоксина и капсулы сибиреязвенного микроба дает возможность определять одновременно продукцию как экзотоксина, так и капсулы у всех изученных штаммов, при использований любого посевного материала и изучать популяционный состав штаммов по этим признакам
3. Фенотштическое выражение капсулообразовапия и
токсшюобразования, протеолитической и гемолитической
активности в отношении определенных субстратов in vitro
зависимость от аминокислот у сибиреязвенного микроба і-
плазмидпыи состав носят характер, свойственный группам штаммов
с разной иатогснностью и могут сочетание изменяться при
изменении патогенных свойств.
4. Результаты оценки популяционкого состава атипнчпчч
штаммов ііо вышеперечисленным признакам, отбора варнапк-п
фенонлазмидотипа и пассирования через организм белых мышей могут служить тестом на эпидемическую значимость таких штаммов. 5. Схема внутривидовой таксономии сибиреязвенного микроба при достаточно четком разделении всех штаммов на группы с определенным фено- и плазмидотипом дает возможность проследить закономерные взаимопереходы между ними, сопровождающиеся .вменениями однородности популяции и вирулентности обратимого > арактера и расширять ее за счет вновь обнаруживаемых групп. Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на
тшутрщшститутских научных конференциях, XII и XIII пленарных
заседаниях Межведомственной научно-методической комиссии по
рьбе с сибирской язвой (Воронеж, 1986, Ташкент, 1990),
Тїсєсоіозной конференции "Бактериальные
лазмидьГ'(Нальчик, 1990), Российской научной конференции
'Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных
шіфекций"(Волгоград, 1992), Российской научной конференции
"Иммунология и специфическая профилактика особо опасных
инфекций" ( Саратов, 1993), на Межгосударственной конференции
"\актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных
заболеваний" (Ставрополь, 1994), на научной конференции по
облемам зоонозных и других инфекционных болезней
;аврололь,1994), на научной конференции" Актуальные вопросы
р-^офилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний"
Ставрополь, 1995), на Международном научном семинаре "Особо
.асные инфекционные заболевания: эпидемиология, экспресс-
чшоепша, профилактика" (Кіфоз, 1997), на Межрегиональном
-бочеіл совещании ВОЗ/ФАО по сибирской язве
\гматы,Каззхетан, 1997).
Публикация. Основные результаты диссертации изложены u 4!t опубжткованных работах и 6 заключительных отчетах. Структура в объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных ' исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы из 132 отечественных и 149 зарубежных источников. Работа изложена на 275 страницах, иллюстрирована 15 рисунками и 29 таблицами.