Биохимические основы антибактериального действия комплексов переходных металлов Бородулин, Владимир Борисович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Лекарственная устойчивость микроорганизмов является одной из центральных проблем микробиологии и молекулярной биохимии. Традиционный подход в решении этой задачи — путь синтеза новых антибактериальных соединений — встречает ряд существенных ограничений: во-первых, вследствие низкой, по отношению к микроорганизмам, селективности многих лекарственных препаратов, во-вторых, из-за развития устойчивости микроорганизмов к антибактериальным средствам, которая обусловливается, как правило, R-плазмидами — внехромосомпыми генетическими элементами, способными к автономной репликации. Несомненный интерес представляло бы обнаружение или создание лекарственных соединений, способных специфически связываться с R-плазмидами и обладающих выраженной нуклеазной активностью.

Проблема создания высокоспецифичных фармакологических соединений, способных связываться с заданными последовательностями пар оснований ДНК. и оказывать направленное действие на функционирование определенных генов еще далека от своего решения.

В то же время обнаружена ДНК-специфичность ряда соединений, используемых в медицине, в частности, детально изучены молекулярные основы связывания с ДНК антибиотиков петролейна, днетамицина и их производных (Zasedate-lev et al., 1976; Patel, 1979; Корка et al., 1985; Dervan, 1986). Исследуются механизмы формирования генотоксичности нит-рофурановых соединений и производных псоралена (Barbour et al., 1970; McCalla et al, 1978; Jenkins et al., 1976; Deb-nath et al., 1993; Anders et al., 1983; Sancar et al., 1985).

С другой стороны, за последние 15—20 лет обнаружены обширные классы химических препаратов, проявляющих нук-леазную активность под влиянием различных физических и химических факторов. Присутствие ионов тяжелых металлов

в структуре лекарственных соединений является одним из условий, способствующих усилению ДНК-разрушающего действия изученных комплексов.

Нуклеазная активность найдена для антибиотика диста-мивдша в комплексе с Fe — ЕДТА и аскорбатом натрия, ме-таллопорфиринов, комплекса меди с фенантролином, антибио-ка адриамицина, некоторых соединений кобальта в присутствии различных восстанавливающих соединений: аскорбата натрия, тиола, р-меркаптоэтанола (Dervan, 1986; Feinstain et al., 1983; Francois et al., 1988; Groves et al., 1989; Hui et al., 1990; Белков В. M. с соавт., 1995).

Нуклеазная активность ДНК-тропных соединений может появляться под действием рентгеновского излучения в присутствии ионов тяжелых металлов или различного рода восстановителей, а также под влиянием лазерного и УФ-излучений (Anders et al., 1983; Grokhovsky et al., 1990; Lee et al., 1988).

В современной литературе практически нет сведений о комплексном изучении воздействия физических излучений и химических веществ, включая ионы переходных металлов и молекулы ДНК-тропных лекарственных препаратов, применяемых в «линике, на нуклеиновые кислоты, несущие детерминанты анти'биотикорезистентности.

Принципиально новым подходом является рассмотрение лекарственной органической молекулы как матрицы, несущей активные группы, способные взаимодействовать сразу с несколькими различными по природе физическими излучениями и .химическими соединениями, что приводит к разрушению плазмидной (хромосомной) ДНК.

Лекарственные 'вещества, в комплексе с переходными металлами, могут являться наиболее удачной моделью, поскольку ион тяжелого металла формирует в структуре лекарственной молекулы новые активные центры, реагирующие на физические и химические воздействия, что изменяет в целом биологические свойства лекарственного соединения и приводит к появлению у препарата нуклеазоподобпой и цитотокси-ческой активности. Вышеизложенное определило цель и задачи работы.

Цель исследования. Целью настоящей работы является теоретическая и методологическая разработка новых биохимических путей преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов на основе изучения нуклеазоподобпой и цитотоксической активности лекарственных соединений нит-

рофуранового ряда и их производных в комплексе с переходными металлами под влиянием физических излучений и ряда химических веществ.

Задачи исследования.

1. Изучить цитотоксическое действие па клетки Е. coli НВ-101 комплексов переходных металлов в присутствии ас-корбата натрия и перекиси водорода, а также под влиянием лазерного и рентгеновского излучений.

2. Исследовать условия, при которых достигается максимальный антибактериальный эффект комплексов переходных металлов под действием физических и химических факторов.

3. Рассмотреть цитотоксичность комплексов переходных металлов на клетках Е. coli К-12, содержащих плазмиду нит-рофуранрезистентности, в присутствии химических соединений и под влиянием физических излучений.

4. Определить 'нуклеазоподоб'Ное действие лазерного и рентгеновского излучений, а также аскорбата натрия и перекиси водорода на плазмидные ДНК, несущие детерминанты антибиотикорезистентности, в присутствии комплексов пере-, ходных металлов; экспериментально выявить реакционные центры, входящие в структуру нитрофурановых комплексов и формирующие нуклеазную активность этих соединений.

5. Исследовать оптические и стереохнмические характеристики комплексообразования с природными и синтетическими ДНК соединений переходных металлов Pd²⁺, Pt²⁺, Cu²⁺, Со²⁺, имеющих в структуре азотсодержащие гетероциклические лиганды, включая нитрофурановые препараты и их производные.

Научная новизна. Настоящая работа имеет фундаментальный и прикладной характер. В результате изучения влияния физических и химических факторов в сочетании с комплексами переходных металлов на ДНК и бактериальные клетки был открыт принципиально новый подход к традиционным лекарственным средствам, а именно: разработаны конкретные физико-химические представления о лекарственном соединении как органической матрице, несущей активные группы и способной взаимодействовать с различными по природе физическими и химическими факторами, изменяя свою биологическую активность.

Открыты новые пути формирования нуклеазоподобной и цитотоксической активности препаратов нитрофуранового ряда.

Впервые экспериментально показано появление интенсивной нуклеазной активности у комплексов переходных металлов с нитрофуранами под влиянием лазерного и рентгеновского излучений, а также в присутствии аскорбата натрия и смеси аскорбат натрия/перекись водорода.

Обнаружено усиление антибактериального действия некоторых комплексов переходных металлов с нитрофуранами в присутствии аскорбата натрия и смеси аскорбат натрия/перекись водорода.

Исследованы условия, при которых достигается максимальный антибактериальный эффект исследованных комплексов.

Показана возможность преодоления лекарственной устойчивости микроорганизма к нитрофуранам (использовались клетки Е. соН К-12, несущие плазмиду, кодирующую нитро-фуран-резистентность данного штамма) с помощью реакционной системы, содержащей комплекс переходного металла и аскорбат натрия (аскорбат натрия/перекись (водорода).

Изучены оптические и стереохимические характеристики взаимодействия с синтетическими и природными по-лидезоксирибонуклеотидами комплексов переходных металлов Pd²⁺, Pt²⁺, Cu²⁺, Со²⁺ с азотсодержащими лигандами, в том числе нитрофурановыми лекарственными препаратами.

Впервые экспериментально показано, что образование комплекса переходного металла с нитрофуранами приводит к появлению новых свойств у лекарственной молекулы, в частности к способности взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Обнаружено, что нитрофураны в свободном состоянии не взаимодействуют с ДНК.

Экспериментально идентифицированы химические группы комплекса, реагирующие на физические (лазерное и рентгеновское излучения) и химические (аскорбат натрия, перекись водорода) воздействия. На основании экспериментальных фактов обосновываются оригинальные механизмы, объясняющие превращения лекарственных молекул под действием физических излучений и химических реагентов.

Продемонстрирована принципиальная возможность обнаружения сайт-специфичных мест локализации комплексов переходных металлов на ДНК с помощью рентгеновского и лазерного излучений без участия ферментов (рестриктаз или неспецифических нуклеаз).

В процессе изучения влияния физических и химических

воздействий па органические молекулы лекарственных соединений ннтрофурапового ряда было выявлено несколько активных групп в молекуле лекарственного препарата (ион переходного металла, триазолыюе кольцо, азометиновая группа, иитрофурановый хромофор), благодаря изменению свойств которых может изменяться и биологическая активность самой молекулы.

Полученные результаты представляют собой инструмент, с помощью которого можно отыскать похожие химические группы в других классах лекарственных соединений. Более того, результаты диссертации позволяют рассматривать любую лекарственную молекулу как матрицу, способную к превращениям под влиянием соответствующих физических или химических факторов, а задача исследователя сводится к нахождению реакционного центра и подбору условий для «запуска» той или иной химической (биохимической) реакции.

Практическая ценность. Данное исследование открывает новые практические возможности для решения одной из важнейших проблем микробиологии — лекарственной устойчивости микроорганизмов, преодоление которой лежит не на пути синтеза новых химиотерапевтических препаратов, а на комбинированном использовании лекарственного соединения в сочетании с физическими излучениями им химическими соединениями. Показано усиление антибактериального действия медь- и кобальтсодержащих нитрофураповых комплексов переходных металлов в присутствии аскорбата натрия и смеси: аскорбат натрия/перекись водорода.

Показано, что у некоторых нитрофураповых комплексов переходных металлов появляется интенсивная нуклеазопо-добная активность под действием лазерного и рентгеновского излучений, а также в присутствии аскорбата натрия и перекиси водорода.

Полученные результаты применяются в исследованиях для определения специфичных мест локализации на ДНК лекарственных препаратов, обладающих низкой константой связывания.

Данные, представленные в диссертации, используются .в качестве лекционного материала для студентов университета.

Разработан вариант методики (Birnboim et al., 1979) выделения плазмид из клинических штаммов. Этот метод внедрен в практику клинической лаборатории Саратовского НИИ травматологии и ортопедии МЗ и МП Российской Федерации

2 Заказ 251

в виде информационного письма «Дополнительный тест для характеристики грамотрицательной госпитальной инфекции в травматологическом стационаре», 1995 г. Рассматривается вопрос о создании на базе клиник г. Саратова единого методического центра для формирования банка данных по плаз-мидам патогенности и вирулентности. Для студентов медицинских университетов, для лечебно-профилактических учреждений и научно-исследовательских институтов разработаны и представлены к печати методические рекомендации «Выделение плазмидной ДНК из условно-патогенных грамот-рицательных микроорганизмов», 1996 г., с целью изучения методов выделения плазмидной ДНК из бактериальных клеток, участвующих в формировании госпитальной инфекции в стационаре. Оформлены два информационных листка № 67-90, 1989 и № 505-90, 1990 г. Имеется авторское свидетельство № 1092918 на изобретение «Пентазамещенные соли тиапирилия, обладающие антимикробной и антифаговой активностью», 1984 г. Получены удостоверения на рационализаторские предложения № 2171, 2172, 2173, 1996 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

6. Антибактериальное действие на штамм Е. coli НВ-101 некоторых комплексов переходных металлов с нитрофурана-ми усиливается в присутствии «естественных метаболитов»— аскорбата натрия и перекиси водорода.

7. Увеличивается цитотоксичность препаратов нитрофуранового ряда в комплексе с переходными металлами в присутствии аскорбата натрия и перекиси водорода при действии на клетки Е. coll К-12, содержащих плазмиду нитрофу-ранрезистентности.

3. Эффективность ингибирования клеточного роста модельных штаммов Е. coli НВ-101 и Е. coli К-12 зависит от условий культивирования клеток.

4. Обнаруживается интенсивная нуклеазоподобная активность лекарственных соединений нитрофуранового ряда в комплексе с переходными металлами под влиянием лазерного и рентгеновского излучений, а также в присутствии аскорбата натрия и перекиси водорода.

5. Выявляется разрушение плазмидной ДНК, несущей де
терминанты антибиотикорезистентности под влиянием физи
ческих и химических факторов в присутствии лекарственных
препаратов.

6. Введение иона переходного металла в структуру лекарственного соединения приводит к формированию новых активных центров, изменяющих биологические свойства лекарственного препарата.

7. ДНК-тропная активность лекарственных препаратов появляется вследствие взаимодействия переходных металлов с нитрогетероциклическими лигандами.

Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Саратовского медицинского Университета при консультации заведующего кафедрой, доктора медицинских наук профессора Ю. В. Куляша.

Автор также выражает глубокую признательность и благодарность Г. А. Корниенко, Т. А. Большинсковой, В. И. Ла-бунской, В. Н. Кравцовой, А. Д. Шебалдавой, И. А. Ефи-менко, академику И. В. Доморадскому.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: V Международном конгрессе по химии фурана (Рига, 1988); XVII Всесоюзном Чугаевском совещании по химии комплексных соединений (Минск, 1990); XVIII Выездной сессии секции бионеорганической химии Научного Совета по неорганической химии АН СССР (Бишкек, 1991); I Международной конференции по биокоординационной химии (Иваново, 1994); VIII Международной конференции по химическим реактивам (Уфа, 1995). За циклы работ, составивших отдельные этапы настоящего исследования, автор являлся с 1993 по 1995 г. персональным стипендиатом University of Oslo Center for Medical Studies (Осло, Норвегия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том числе в зарубежных и центральных изданиях.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы.

Работа иллюстрирована 17 таблицами и 72 рисунками, включая 41 фотографию. Библиография содержит 251 источник, из них 57 отечественных и 194 иностранных авторов.