Биохимические и культуральные особенности условно-патогенных энтеробактерий и псевдомонад как основа совершенствования их идентификации Сиволодский, Евгений Петрович

Введение к работе

' «туальность исследования. Условно-патогенные эитеробпкт;-рии и псевпомоиапы способны внзнвать широко распространенные заболевания люпей, животных я растений / Беляков В,Д. и пр., Ї990; Литвин В,Ю., І932/. В мепицинском аспекте они имеют наибольшую значимость как вепушие воэбупители госпитальных ннфек-чуй / Пфвев Р.Х., Зуела. Л.П,, 1989; Brenner D .J, , І992/. По обобщенным ванним госпитальные инфекции возникают у 4,5-16% госпитализированных больных и при различных нозалогических формах л сот летальность от 3,5 по &3% J Еорсбьёв А.А. и пр., І999/. Более половины клинических иэоллтоп энтеробактерий и нсевпсиокап при госпитальных инфекциях составляет "проблемные" вип«: ЕясЬч-ricliia coli, КІвЬзічІІа pnouroouine pubsp.pneumoniae, i'roteua nlrabllio, Pseudomorma anruginnaa / Уагтчг J.J. et al., 19^5! Br«nuer D.J., 1992 , Почти вся остальная честь нзолятоп преп-стаглена небольшой группой (22 випа) энтеробактерий и пссрлсмо-

!ШЯ; ПРОЧНЄ МНОГОЧИСлеННЫе ПИПЫ СОСТОЕЛЯЮТ ОКОЛО 1% / BrrgT ^и-0 al„, 1901 , їатгачт J.J. et аі., 1985/.

Микробиологическая пиагностика госпитальных иифзкимй if npv-гих заболеваний, вызываемых энтеробактернями и псевво.чснапЕ'.ми, основана на культуральном метопе, важнейшим этапом которого является биохимическая ипентификадая выделенных культур. В нашей, стране еще попольно широко применяется пробирочнпй метоп биохимической ипентифяквции, регламентированный¹ официальными инструкциями. Метоп плнтелен, трупоёмок ч порог. На смену ему пришла микрообъемная технология, которая уже многие гопы используется за рубежом посрепством разнообразных коммерческих тест-систем биохимической ипентификации бактерии и автоматизированных микробиологических систем. Отечественное коммерческие тест-сне теки биохимической ипентифмкацип энтеробактериИ появились лишь'непарно (ПБДЭ, НМТ ЕІ и Е2, ШС-ЮЕ). Оцнако, нет отечественной системы ускоренной биохимической идентификации энтеробактери}; и автоматизированных микробиологических систем. Недостатком коммерческих тест-систем является высокая стоимость, крат іовремтінії срок годности (I гея) и низкая точность некоторых Из чих. Дня ускоренной идентификации "проблемных" випов бактерий ( з.соИ,

Hlabaiella app. , P.aeruginoaa ) разрЕбоїіЬа уЬанообразниа свлактивно-пифференциалыше питательные среды оппоэтапного выделения и первичной идентификации /*Brovn V.I.et' аЗ. ,1965; H>,d-Ьбтц h. , І0Ш; Киселёва М.Н. и пр., І976; Мороз А.Зі. и пр., 1976; Гяэимуратова Л.Д. и пр., І97В; Bagiey s.T. et al. ,l9?d; КШьд n. et аа,,1У?Э; Калина Г.Л., EWOja'reyeta H.W.et а#984; Campbell U.B.at и.1. , І9Ьв7. Наиболее важним обшим недостат-кок і:х является неполная специфичность. Для существенного ускорения, упрощения и повышения точности биохиыической идентификации антеробактерий и пеевпомонад необходим научный поиск принципиально новых специфических свойств этих бактерий.

Потребность в атом поиске актуальна также пля систематики псэидомонап и антеробактерий. Систематика бактерий рола i'seudo-ші.йаа и сеиейства ЕціегсЛасЬеі'іасеае находится па перехопном этапе и подвергается интенсивному пересмотру. Переход к построению естественной классификации, основанной на іфитериях гено-систаиатики, выявил несоответствие фенотипической систематики многих -вицов панним геїкісистематіші и отсутствие опорных специфических признаков, коррелируюшихся с генетическими критериям!. Только за несколько последних лет из состава рола PaeudomonaB исключены випы третьей и пятой групп рРНК-гомологии /jfallero-ni. H.J. > 1Ъ9'&/. Тенденция к сокращению состава рода ^ssudo-иопав продолжается. Противопсложная тенденция наблюпается в систематике эитеробактерий. За послеаиие 0 лет состав семейства увеличился на 9 родов и десятки видов /Wanner D.J. , IW2J, Систематическое положение некоторых випов, например tiobsiaila шоьіііе і остаётся дискуссионным Уогако-у І., 1984; Grisiout I', efc al. E)92/. Ввиду отсутствия специфических признаков, для дифференциации видов антеробактерий и пеевпомонад используется около 50 'саксономических признаков, что усложняет их идентификации /вгагшвг D.J. , 1984; Palioi-oni w.j. , І984У. Поиск специфических или уникальных свойств антеробактерий и псевпоі.а-нав, коррелируюшихся с критериями ген ос и с тематики, иь.еет ва*иой научное значение для совершенствования систематики этой группи Сак герц {!.

Таким образом, тема исследования имеет два аспекта, таксо-номичэпкий и клиника-микробиологический, относящихся к решению

_ 3 -

актуальных проблем совершенствования систематики бактерий ропа Toeudomonas и семеПства Entorobaoteriucew» » ^а также совершенствования микробиологической диагностики госпитальных инфекций и других заболеваний, вызываемых условно-патогенными эн-теробектерпями и псевдомонапэмн.

Исслепование выполнялось s рашах отраслевой программы С-23 "Разработать и внедрить в практику здравоохранения эффчк-тивные мери бор'-бы и профилактики внутрибольничных ИНфвКЦИЙ и сепсиса".

Цель и задачи исследования. Цепь исслецования состояла п виявлений таксономически значимых биохимических и культуральичх особенностей условно-патогенных знтеробакторпй и псенпомоняд,' разработке на их основе новых таксономических маркеров и тестов, а также среигів и способов исследований, существенно сосершен-сті^тпших идентификации этих бвктмрий, в том числе Розбуднтедей госпитальных ИНфекЦИІ..

Для достижения указанной цели были поставлены следующий задачи:

I. Провести поиск специфических свойств условно-латогоннчх энтеробактерий и псевдомі ""я путём скрининга химических соединении на специфичность хромогенних ревкций и избирательность бактер;юстатпческого действия.

Z. Научно обосновать таксономическую значимость выявленных специфических свойств онтеробактерий и псевиомонап.

1. Изучить биохимические механизмы выявленных таксономи-чески значимых свойств энтеробактерий и пеевяомоиаа.

2. Разработать новые таксономические тенты для систематики онтерсбектерпй (І ПСЄЕДОМОНЙП.

3. Разработать на основе выявленных специфических свойств энтеробактерий и псевдомонап солективно-лнфференциильние пи-

Т0ТЄЛМШЄ СрелЫ ДЛЯ ОПНОЗГАПНОГО выявления І! Идентификации

"проблемних" поз^удигадуЛ госпітальних инфекций и ші_Р 'poittm, их в практике клішико-бакіериодогических лабораторий.

Є. Выявить и изучить особенности биохимических И культу-

ралЬПІ'Х СВОЙСТВ уСЛОЕИОЧШ-ТОГеНПНХ ЭИтеробОКТерНЙ И Ш'ПВПОИо-

нац в условиях мшсрообъемнсго нетопа.

7. Разработать на основе ыикрообъемной технологии тести ускоренной биохимической идентификации псевпомонап и систему ускоренной биохимической идентификации энтерооактерий.

Нсучпая новизна и значимость работы. В результате исследований открыты специфические и уникальные свойства псевпомонап и знтеробмстепий, коррелируюшиесн с ванними і'еносиетемати-кч, и научно обоснована их таксономическая значимость.

Впервые обнаружено уникальное свойство псевдомонад первой группы рРНК-гомологии - избирательная чувствительность к бик-териостатическоиу действию ионов бария. Установлено, что этот признак является единств энным таксономическим маркером всех видов исевпомснад первой группы рШК-гомологии (Аутентичной роду Psaudomonut! ) и полностью согласуется с изменениями в классификации псевдоионав. Признак имеет высокую научную значимость пли построения естественной классификации псевпомонап.

Впервые обнаружено уникальное свойство бактерий рода ,..1аъ-«iella - хромогенная реакция с 5-аминосалицнловоЙ кислотой в питательной среде. Это свойство имеют все виды и подвиды, кроме К. i.'lanfioola и К. tecvi^oau . Наличие его у К. тоьіііа , таксономическое положение которого является спорным, подтверждает принадлежность отого вида к роду Klebsiella . Признак является единственным таксономическим маркером клебсиелл, что определяет его научную значимость для систематики.

Впервые выявлено специфическое свойство бактерий Uafuia alvei - хромогенная реакция с комплексом 5-нптро-в-оксихинолин+ + ионы ї' е' , установлена его таксономическая значимость как маркера бактерий 11. aivei . Признак представляет научный интерес для систематики как единственный биохимический таксономический маркер H.alvei.

Открыт биохимический механизм хромогенной реакции клебсиелл с 5-ЛСК, выявлен и предварительно идентифицирован неизвестный ранее фермент, осуществляющий реакцию: 5-аминосалицилат-некарбоксилаза из класса ли аз (5-аминосалицилат-карбокси-лиа-аа).

Впервые установлена избирательная резистентность бактерий P.aeruginosa и P.putida к антимикробному действию лекарственного препарата "окпафенамид" (пара-оксифенилсалицилашд) ,что

определило возможность разработки селективной среды для выделения и идентификации этих бактерий.

Выявлены особенности биохимических и культуральных СВОЙСТВ псевпомонад и энтеробактерий в условиях наїкрообьемного метопа, позволившие впервые разработать пероксицвояорогный метоп ускоренного определения окислительного метаболизма углевопов у этих бактерий.

Указанные результаты исследований имеют существенную научную значимость для совершенствования систематики псевпомонад и эмтеробактернй и являются основой для разработки новых средств и способов идентификации этих бактерий.

Практическая ценность работы. На основе выявленных особенностей биохимических и культуральных свойств энтеробактерин и псевдомопап разработаны новое средств» и способы их идентификации:

1. Такс ономичэс кие тесты идентификации; псевдомонал первой группы рРНК-гомологии (по квркеру барийчувствнтелыюстк,, бактерий Klebsiolia app. (по маркеру хромогенной реакции с 5-АСК); бактерий H.alvei,.. (по маркеру хромогенной реакции с комплексом 54ЮК + ионы г e^J+).

2. Селективно-дифференциальные питательные среды для оино-дтопного выделения и сопряженной идентификации "проблемных" видов энтеробактеоий и псеваомонад, отличающиеся высокой специфичностью: среда "Клебсиелла 5-ЛСК" (для :;іег>яіе11а о.р.р. )« ^СР-ва "Псевпомонас ЛШ" (для Р.авгиеДпоиа и P.putidа )> средя "Протей ПіІМ" СіЛД группы I'roteua, l'rori loncia, Norganolla ;, среда "Протей llil" (для rpiTinu I'roteun, froviienoia ).

3. ПероксипвсяоропныЙ ми кр о объемный метоп OF-теста с глюкозой, обеспечивающий экспрессное (I ч) определение окисления и ферментации глюкозы громотрицательныш бактериями.

4. .Микрообьемнме тесты определения окисления углевозов (перокскппопороаннм метопом) и нитратредуктаэы, пригодные для ускоренной (4-5 ч) идентификации псевдомонал и других пе^ормзн-

тируншчх бРНтермП.

Г. Первая отечественная система ускоренной (5 ч) биохимической идентификации знтеробактерий на основе тщюобъеьыого метода с жвдкиш средами в ш; шшотах, отливающиеся доступностью и

- б -

невысокой стоимостью исследований.

Указании» средства и способи позволяют .^корить, упростить и поьисить точное^ исследований, что существенно совершенствует идентификацию условно-патогенных знгеробактерий и псевиомонаи. Эти средства и способы могут использоваться нля идентификации бактерии при таксономических исследованиях в области систематики, а также при микробиологической диагностике госпитальных инфекций и других заболеваний, вызываемых условно-патогенными энтеробоктерппми и псевдомонадамп.

Реализация результатов исслепования. По представленным результатам исследований получены 6 авторских свидетельств СССР на изобретения; "Способ идентификации бактерий ИиХдіа alvoi " (1* II50577), 'Средство для селективного подавления роста бактерий рода PaeudowonoB " (№ 1296577), 'Способ идентификации бактерий рода Klebsiella " ( № I3I3874), 'Способ выделения бактерий семейства Enteiobacteriaceas " ( №1386660), "Питательная

Среда ДЛЯ ВиделеНИЯ И Идентификации бактерий ^jjaulomonao ыеуи-

ьяиоаа " ( № I4I467I), 'Способ определения окисления и ферментации глюкозы грамотрицательными иикроорганизмиии" ( № I510374).

Разработанные нами тести идентификации используются в научно-исследовательской работе для таксономических исследований псевдомонад, клебсиелл, гафний в ШСК им Д.А.Тарасовича (Москва), Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Петербург), Волгоградской научно-исследовательском противочумном институте, Институте микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного АН Украины (Киев), Научно-исследовательском институте детских инфекций Ю РФ (Санкт-Яетербург). Селективно-лифферонциальные питательные среди для выделения и идентификации "проблемных" бактерий "Псввдо-ионас АПС", "Клебсиелла 5-АСЦ", "Протей ШШ" и система ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий применяются в Государственном научном центре пульмонологии ЫЗ РФ, центральной клинико-диагностической лаборатории ВМецА , межрайонной клинико-диагностической лаборатории № 2 (Санкт-Петербург), бактериологических лабораториях С< Санкт-Петербурга. Система ускоренной биохимической идентификации ог.т'зробьктерий включена в методические указания ЦВМУ МО СССР,"Диагностика, лечение и профиле.:-

їика пизентерйи и пругих острых кишечных лиарейных инфекций в Советской Армии и Военно-Морском Флоте" (М., І99І) и применяется во всех бактериологических лабораториях медицинских частей и учреждений Вооруженных Сил РФ. Эта система применяется также в бактериологических лабораториях гражданского здравоохранения^ соответствии с методическими рекоменпациями МЗ FC5CP "Диагностика, прогнозирование течения и лечение острых кишечных инфекций условно-патогенной и смешанной этиологии" ( Л.," І990).

Теоретические положения, новые срепства и способы идентификации бактерий, представленные в диссертации, используются в Учебном процессе на кафедрах микробиологии Военно-мепицинской академии, Санкт-Детэрбургского санитарно-гигиенического медицинского института и Санкт-Летербургского педиатрического медицинского института.

Апробация работу. Материалы диссертации доложены на симпозиуме 'Современная госпитальная инфекция" ( Ленинград, 1980 ), 1-й Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы нозокомиальных инфекций и лекєрственной устойчивости микроорганизмов" ( Минск, І966), заседаниях Ленинградского отделения Всероссийского научного обшества эпидемиологов и микробиологов (1987, 1968), Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста, микроорганизмов" (Пущино, 1909), юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летип Института имени Пастера (Сенктг Петербург, 1993).

Основные результаты диссертации отражены в 27 опубликованных работах, в том числе 15 статьях в центральных журналах и б ((зобретевиях.

Основные положения, выносимые на р?штуі

I. Избирательная чувствительность к бактериостатическому действию ионов бария - уникальное свойство и таксономический Маркер псевяомоиад первой группы рРНК-гомологии (аутентичной ро-

Ьу* Peaudotaonao ).

" 2. Хромогенная реакция с 5-аминосалиц>і.'"ЗОЙ кислотой в іій-тагелі юП среде - уникальное свойство и таксономический моркер

*№.ктерий Klebsiella spy.

3. Хромогенная роакци;. с комплексом 5чііітро-^3-оксихинолин+

+ иоин j?_e - специфическое свойство и таксономический маркер бактерий Hafnia alvei.

4. Хромогенная реакция клебсиелл с 5-АСК происходит в две стадии. На первой стадии, протекавшей в аэробных и анаэробных условиях і клебсиелли пекарбоксилнруют 5-АСК с образованием Og и пара-аминофенола, который является бесцветным промежуточным продуктом. На второй стации, протекавшей только в аэробных условиях без участия бактерий, пара-аминофенол окисляется кислородом воздуха в полимеры темно-коричневого цвета. Выявлен и предварительно идентифицирован неизвестный ранее фермент, осуществляющий реакцию: 5~еуиносалицилатдекарбоксилаза из класса лиаэ, имевший клеточную локализацию.

5. Селективно-дифференциальные питательные среды для одно-этапного выделения и идентификации "проблемных" бактерий ( Klebsiella epp. , P. aeruginosa И P. ^utida » Группы Proteus » Pro-, videncia » Morganeiia )» отличающиеся высокой специфичностью.

6. Микрообъемные пероксипвоаоросный метод of -теста с глюкозой и система ускоренной биохииичаской идентификации энтвро-бактврий, позволяющие существенно ускорить ипентификацию бактерий.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 353 страницах машинописного текста, включая 53 таблицы и 25 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов. Список литературы включает ІІ8 отечественных и 223 иностранных источников.