Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Дихлорметан - антропогенный поллютант из класса галометанов 10
Глава 2. Микробная деградация дихлорметана
2.1. Особенности биологии аэробных метилотрофных бактерий 12
2.2. Аэробные метилобактерии - деструкторы дихлорметана 20
Глава 3. Минерализация дихлорметана аэробными метилобактериями
3.1. Этимологические и генетические аспекты дегалогенирования ДХМ 24
3.2. Адаптация аэробных метилобактерии к минерализации дихлорметана 28
Экспериментальная часть
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Объекты исследований 46
4.2. Культивирование бактерий 46
4.3. Исследование ультраструктуры клеток
4.3.1. Получение ультратонких срезов бактериальных клеток и электроннаяикроскопия
4.3.2. Рентгеновский микроанализ элементного состава компартменюв клеток 47
4.4. Определение фосфолипидного состава клеток 48
4.5. Определение состава жирных кислот 49
4.6. Определение аминокислотного состава 50
4.7. Определение активности глутатионредуктазы 50
4.8. Определение концентрации ионов хлора 51
4.9. Очистка дихлорметандегалогеназ
4.9.1. Получение бесклеточных экстрактов 51
4.9.2. Высокоскоростная жидкостная хроматография 52
4.10. Определение активности дихлорметандегалогеназ 52
4.11. Фракционирование изотопов Си С1 при биодеградации ДХМ
4.11.1. Условия эксперимента 53
4.11.2. Определение изотопного состава дихлорметана и СОг 54
4.11.3. Определение доли потребления дихлорметана 56
4.12. Влияние ингибиторов электронного транспорта на биодеградацию ДХМ 57
4.13. Адаптация клеток деструкторов к присутствию ионов хлора в среде
4.13.1. Оценка длительности лаг-периода в потреблении ДХМ при адаптации к ионам хлора в среде 58
4.13.2. Влияние стрессоров на длительность лаг-периода в потреблении ДХМ 58
4.13.3. Определение времени начала экспрессии дихлорметандегалогеназ 59
4.14. Денатурирующий гель-электрофорез белков в ПААГ 60
4.15. Оценка выживаемости клеток метилобактерий 60
Результаты и обсуждение
Глава 5. Структурно-функциональная модификация клеток деструкторов при деградации ДХМ
5.1. Изменения состава жирных кислот и фосфолипидов клеток 61
5.2. Морфология и ультраструктура метилобактерий в присутствии ионов С Г 66
5.3. Изменения состава аминокислот клеток и активности глутатнонредуктазы 74 Глава 6. Механизмы транспорта ДХМ у деструкторов
6.1. Сравнительный анализ динамики потребления и дегалогенирования ДХМ 77
6.2. Фракционирование изотопов 12ШС и 35/37С1 при биодеградации ДХМ 77
6.3. Оценка энергозависимости процесса биодеградации ДХМ 87
Глава 7. Адаптация деструкторов ДХМ к внутриклеточной продукции СГ
7.1. Экскреция ионов СГ деструкторами при дегалогенировании ДХМ 94
Заключение 101
Выводы 103
Список литературы 104
- Особенности биологии аэробных метилотрофных бактерий
- Аэробные метилобактерии - деструкторы дихлорметана
- Получение ультратонких срезов бактериальных клеток и электроннаяикроскопия
- Изменения состава жирных кислот и фосфолипидов клеток
Введение к работе
Исследования дегалогенирования ДХМ ведутся более 20 лет. Получена существенная информация о распространении и таксономии аэробных бактерий-деструкторов СНзСЬ, путях их метаболизма и соответствующих ферментах [Троценко, Доронина, 2003]. Тем не менее, наличие довольно ограниченного разнообразия последовательностей дихлорметандегалогеназ (ДХМДГ) у разных штаммов-деструкторов пока не привело к пониманию принципов работы данных ферментов, хотя такая вариабельность может проявляться в тонкой регуляции дегалогеназной активности in vivo. Недавние работы также показали, что важны не только сами дегалогеназы, но и другие дополнительные ферменты и гены, участвующие в бактериальном метаболизме ДХМ. Трансконъюганты, полученные посредством переноса гена сістА из Mb. dichloromethanicum ДМ4 в Mb. chloromethamcum СМ4 и Mb. extorquens AMI, активно экхпрессировали ДХМДГ, но только трансконъюгант Mb. chloromethaniciim СМ4 мог расти на СНгСЬ, что свидетельствует о специфической структурно-функциональной организации штаммов-деструкторов галометанов [Kayser et а!., 2002]. В связи с этим весьма актуален анализ физиолого-биохимических и молекулярных основ минерализации ДХМ у метилобактерий. Прежде всего, штаммы-деструкторы могут нуждаться в механизмах активного транспорта ДХМ в клетки. С другой стороны, в отличие от первичного метаболизма метанола, процесс деградации ДХМ у метилобактерий зависит от величины пула GSH, а также сопровождается образованием в цитоплазме высоких концентраций Н+ и СГ, S-хлорметилглутатиона и СНгО. Эти реакционноспособные интермедиаты оказывают летальное действие на клетки, не имеющие соответствующих механизмов защиты [Evans et al., 2000; Kayser et al., 2000]. Однако до настоящего времени перечисленные аспекты бактериальной деградации ДХМ остаются неизученными.
Цель и задачи исследования:
В связи с вышеизложенным, целью работы было выявление цитобиохимических особенностей у деструкторов ДХМ Melhylobacteriwn dichloromethanicum ДМ4, Methylopilct helvetica ДМ6 и Albibacter methylovorans ДМ10, реализующих разные пути первичной ассимиляции Сі-соединений. Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:
Исследовать цитобпохимические изменения у аэробных метилобактерий деградации ДХМ.
Определить механизмы транспорта дихлорметана у аэробных метилобактерий.
3. Изучить механизмы поддержания ионного гомеостаза метилобактериями при дегалогенировании ДХМ.
Научная новизна работы
Впервые показано, что в присутствии ДХМ, а также при повышении солености среды, клетки снижают текучесть мембран, уменьшая огносительное содержание ненасыщенных Cis.i и Сго і и увеличивая содержание насыщенных Сіе.о, Спо, Сіх о жирных кислот и фосфатидилхолина. Галотолерантности метилобактерий при росте на ДХМ способствует уменьшение доли гидрофобных и возрастание содержания кислых аминокислот, а также накопление осмопротеїсгора пролина и/или отрицательно заряженных фосфолипидов у Мр. helvetica ДМ6 и A. methyhvorans ДМ 10. На клеточной стенке этих деструкторов обнаружены содержащие хлор и фосфор образования, вероятно, служащие для уплотнения барьера проницаемости мембран для экзогенных анионов.
Результаты масс-спектрометрического анализа фракционирования изотопов п ПС и С1 молекул ДХМ интактными клетками, их экстрактами и очищенными ДХМДГ аэробных метилобактерий дают основание предполагать диффузионный механизм транспорта СНгСЬ- Однако величина рассчитанных кинетических изотопных эффектов свидетельствуют также о существовании дополнительных энергозависимых механизмов экскреции ДХМ для защиты бактерий от токсического действия этого растворителя.
Ингибиторный анализ выявил, что при минерализации ДХМ аэробными метилобактериями выброс образующихся ионов СГ осуществляется с потреблением энергии химического протонного градиента. Однако, в отличие от трансконгжзган га Mb. extorquens АМ1/рМЕ8220, штаммы-деструкторы обладают АТФ-зависимыми механизмами, связанными с деградацией СН2СЬ
У Мр. helvetica ДМб и A. methyhvorans ДМ 10, адаптированных к повышенной солености среды, выявлено ускорение индуцируемого ДХМ синтеза ДХМДГ, а также специфичное для солевого стресса сокращение лаг-периода в использовании СІЬСЬ, не связанное с экспрессией гена dcmA и свидетельствующее о цитобиохпмических изменениях, способствующих экскреции ионов СГ.
Практическая значимость работы
Данная работа является частью проекта, направленного на решение важной научно-практической проблемы биодеградации ДХМ, опасного загрязнителя окружающей среды в связи с персистентностыо и большими объемами промышленного производства. Изучение физиолого-биохимических и молекулярных основ адаптации аэробных метилобактерий к использованию этого опасного поллютанта значительно расширяет и углубляет знания о бактериальной деградации галометанов. Эти исследования
необходимы также для разработки современных биотехнологических процессов разложения дихлорметана на основе активных штаммов и соответствующих ферментов -дегалогеназ, а также для создания штаммов более удобных для применения в промышленных условиях, нежели природные деструкторы галометанов. Внедрение таких штаммов на очистные сооружения целого ряда производств, связанных с продукцией или использованием этого поллютанта, позволит создать более эффективные биореакторы для аэробного разложения ДХМ по сравнению с уже существующими [Galli, 1987; Stucki, 1990; Hartmans, Tramper, 1991; Zuber, 1995; De Best et al., 2000].
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Международных Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука ХХТ века» (Пущино, 2004, 2005, 2006), Всероссийском симпозиуме с международным участием памяти акад. РАН Е.Н. Кондратьевой «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005), конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), школе-конференции молодых ученых ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино, 2005), молодежной школе-конференции по масс-спектрометрип (Москва, 2005), международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН (Москва, 2005, 2007), конференции молодых ученых "Современная биотехнология - защите окружающей среды" (Пущино, 2006), международном симпозиуме 1SEB-ESEB-JSEB «Environmental biotechnology» (Лейпциг, 2006), российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2006), 2-м Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием IBSM-2007 "Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ" (Иркутск, 2007), Генеральной ассамблее Европейского Союза Геофизических Исследований "Geosciences is responsibility" (Вена, Австрия, 2008), Гордоновской научной конференции «Molecular basis of microbial one-carbon metabolism» (Льюистон, США, 2008), IV-й межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 13 тезисов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 130 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 364 ссылки, содержит 10 таблиц и 26 рисунков.
Благодарности
Автор искренне признателен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Сузиной Н.Е. за электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры клеток, Сорокину В.В. (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва) за проведенный рентгеновский микроанализ ультратонких срезов, Лысанской В.Я. за помощь в определении аминокислотного состава клеток, д.б.н. Осипову Г.А. (Академическая группа акад. Исакова Ю.Ф., РАМН, г. Москва) за анализ профилей жирных кислот, д.б.н., проф. Зякуну А. М. и д-ру Рнхнову Г,-Г. (Группа изотопной биогеохимии центра исследований окружающей среды (UFZ), г. Лейпциг, Германия) за помощь в масс-спектрометрических исследованиях, проф. Вейюмье С. (Университет Луи Пастера, г. Страсбург, Франция), а также всем сотрудникам лаборатории радиоакгивных изотопов (ИБФМ РАН, г. Пущино), UMR CNRS 7156 "Genetique Moleculaire, Genomique et Microbiologic" (Университет Луи Пастера, г. Страсбург, Франция) и Центра исследований окружающей среды (UFZ) (г. Лейпциг, Германия).
Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям - д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Дорониной Н.В. за постоянное внимание и поддержку.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Дихлорметан - антропогенный поллютант из класса галометпнов
Галометаны (метилгалиды) - класс галогенированных производных метана, содержащих один или несколько галогенных заместителей (CI, Br, I или F). Это химически стабильные неполярные соединения с низкой температурой кипения Известно около 30 различных галометанов, важнейшими из которых являются метилгалиды (хлор-и бромметаны), а также хлорфторметаны (фреоны). Галометаны синтезируются и активно используются в промышленности в качестве растворителей и хладагентов [Wackett el al., 1992J. Вместе с тем предполагается, что, реагируя со стратосферным озоном, эти соединения обусловливают разложение озонового слоя [Butler, 2000]. Для основных представителей ряда метилгалидов - хлорметана (СНзСІ) и бромметана (СІЬВг) установлено, что их биогенное образование существенно превышает химический синтез [Goodwin et al., 1997, 2001; Watling, Harper, 1998]. Найдены также биологические источники дибромметана (СН2ВГ2) - морской фитопланктон и высшие растения [Manley et al., 1992; Saini et al., 1995].
В отличие от вышеуказанных галогенпроизводных метана, дихлорметан (метилен хлорид, СНгСЬ) является преимущественно антропогенным загрязнителем окружающей среды, поскольку примерно 80% эмиссии этого поллютанта в атмосферу обусловлено его использованием [Khalil et al., 1993; Andreae et al., 1996; Harper, 2000]. Кроме того, ДХМ является распространенным компонентом городских и индустриальных стоков [Line et al., 1997]. Промышленное применение СН2С12 связано с его физическими и химическими свойствами, такими как низкая температура кипения (40С), высокая растворимость в воде (около 20 г/л, т.е. 235 мМ), относительная инертность и низкая температура замерзания (-97С) [Howard, 1990; McKay et al., 1993]. ДХМ используется в качестве хладагента (фреон-30, хладон-30), растворителя для химического синтеза в фармацевтической промышленности (30%) и удаления широкого спектра лакокрасочных покрытий (19%). Благодаря способности снижать горючесть, вязкость и давление паров, ДХМ входит в состав аэрозолей (9%), а также применяется при производстве термопластиков, синтетических волокон, фотопленки и для экстракции чувствительных к нагреванию веществ (пищевые жиры, кофеин). При этом промышленное производство этого соединения путем термического, каталитического или фотолитпческого хлорирования метана или хлорметана достигает 3-Ю5 т/год [Keene et al., 1999; Winterton, 2000]. Ранее было предположено существование таких природных источников дихлорметана, как вулканическая деятельность и его синтез tie novo в природных процессах, в том числе неохарактеризованными до настоящего времени океаническими
К)
источниками [Isidorov, 1990; Urhahn, Ballschmiter, 1998; Дембицкий, Толстпков, 2003]. Однако пока нет экспериментальных данных, подтверждающих эту гипотезу [Keene et al., 1999].
Поскольку в водных системах период полураспада ДХМ составляет до 700 лет, а в атмосфере - 70 дней, он считается одним из основных загрязнителей воды и атмосферы [Edwards et al., 1982;Boldauf, Kuhn, 1985; World Meteorological Organization, 1991; Dhillon, Von Burg, 1995; Zuber, 1995; Line et al., 1997]. Относительно короткое время разрушения СН2С12 в атмосфере (~6 мес), по виртуальным оценкам, может быть обусловлено реакцией с гидроксильными радикалами в нижних слоях атмосферы (в тропосфере), и образованием СО, НС1 и Н20 [World Meteorological Organization, 1991]. При этом СО и НС1 имеют геохимическое происхождение, а вклад ДХМ в глобальные уровни этих газов может быть незначительным [Martin, 1995; Edwards et al., 2000]. Кроме того, нет доказательств вклада ДХМ в продукцию озона в нижних слоях атмосферы и формирование фотохимического смога [World Meteorological Organization, 1991]. Малое поглощение СНгСЬ инфракрасного излучения также свидетельствует о незначительной роли ДХМ в процессе глобального потепления [Houghton, Callander, 1992].
Высокая токсичность ДХМ для млекопитающих, напротив, становится весьма актуальной проблемой. Показано, что этот мутаген вызывает образование опухолей печени и легких у мышей и крыс, а также оказывает канцерогенный эффект на эритроциты, печень и почки человека [Green, 1997; Thier et al., 1998; Landt, 2000J. В результате проведенных гестов, ДХМ отнесен к человеческим канцерогенам [National Toxicology Program (US), 1985]. Обнаружено, что длительный контакт персонала с CH2CI2 приводил к различным профессиональным заболеваниям. Показано также, что при концентрации ДХМ 10 мг/л происходило нарушение биологического режима водоемов [Dhillon, Von Burg, 1995].
В целом, интенсивное промышленное производство и использование персистентных галометанов привело к их накоплению в окружающей среде. Отрицательным следствием этого является мутагенное и канцерогенное действие галометанов на живые организмы, а также истощение озонового слоя. Учитывая это, галометаны отнесены к категории веществ повышенной биоопасности, а их производство, согласно Монреальскому протоколу, рекомендовано сократить [Keith, Telliard, 1979]. Другой превентивной мерой может быть разработка новых способов и технологий биодеградации галометанов на основе активных штаммов и соответствующих ферментов-дегалогеназ [Galli, 1986; Stucki, 1990; Diks, Ottengraf, 1991; Pries etal., 1994; Zuber, 1995; Leisinger, 1996].
Особенности биологии аэробных метилотрофных бактерий
Аэробные метилобактерии составляют особую физиологическую группу микроорганизмов, обладающих уникальной способностью использовать окисленные или замещенные производные метана в качестве источников углерода и энергии. Факультативные метилотрофы используют наряду с одноуглеродными различные полиуглеродные соединения, облигатные метилотрофы используют ТОЛЬКО Cl-соединения, тогда как ограниченно-факультативные метилотрофы могут расти только на одном или нескольких полиуглеродных субстратах [Anthony, 1982].
Аэробные метилобактерии - экологически и таксономически гетерогенная физиологическая группа класса Proteobacteria. Впервые бактерии, способные к аэробному росту на метаноле как единственном источнике углерода и энергии, были выделены Loew в 1892 г. и названы Bacillus meihylicus. С этого времени и до начала 1960-х годов были выделены только несколько штаммов метилотрофных микроорганизмов. Начало систематическому изучению их биологии и метаболизма было положено описанием розовоокрашенного метилотрофа Pseudomonas sp. AMI [Peel, Quayle, 1961]. К настоящему времени изучены сотни штаммов метилобактерии, проявляющих поразительное таксономическое, экофизиологическое и цитобиохимнческое разнообразие. Аэробные метилобактерии, способные использовать в качестве ростовых субстратов восстановленные Сі-соединения - метанол, метилсульфиды и метилсульфонаты, галометаны, метилированные амины - повсеместно распространены в природе и обнаружены в воде и на суше. Окисляя природные и антропогенные Сі-соединения, метилотрофы участвуют в биогеохимических процессах биосферы. На фоне глобального загрязнения окружающей среды увеличивается число местообитаний с высоким содержанием токсичных С і-соединений. В связи с этим большое значение имеет изучение биологии метилобактерии, являющихся естественным природным барьером поступления Сі-соединений в окружающую среду [Murrell, McDonald, 2000; Троценко, Доронина, 2003; Lidstrom, 2006].
Пути окисления Сі-соединений. Процессы окисления восстановленных С(-субстратов обеспечивают клетки энергией и восстановительными эквивалентами, а также переводят эти субстраты в доступные для ассимиляции формы, т.е формальдегид, формиат и СОг (Рис. 2.1.1). При этом вначале у метилобактерии Ci-субстраты подвергаются трансформации до формальдегида с помощью специализированных ферментов.
Этот фермент окисляет первичные спирты и формальдегид, активируется аммонием или метиламином, имеет оптимум рН 9 и использует in vitro в качестве акцептора электронов феназинметосульфат (ФМС) или другие искусственные акцепторы, но не пирндпннуклеотиды. Передача электронов /// vivo осуществляется на цитохром 6 .(19 кДа), имеющий типичный гемсвязывающпй сайт, и далее на цитохром сц, который является субстратом цитохромоксидазы [Duine et al, 1979]. Относительно локализации МДГ имеются разноречивые данные. МДГ из Methylomonas sp. А4 обнаружена в ВЦМ [Fasset et al., 1992]. МДГ и оба цитохрома локализованы в периплазме, что связано с токсичностью формальдегида- продукта реакции [Frank ct al., 1993]. Максимальное содержание МДГ в клетке может достигать 50% растворимого белка [Anthony, 1982].
Окисление метиламина осуществляют метилобактерии родов Hyphomicrobm/n, Methylobacterium, Methylopila, Methylorhabdus, Paracoccus, Methylophaga, Melhylobacillus и Methylophilus, способные использовать это соединение не только в качестве источника углерода и энергии, но и как источник азота. Факультативные метилобактерии Arthrobacier globiformis, Xanthobacter aminooxidans и Methylarcula marina растут только на метиламине и очень слабо или вообще не используют метанол. При этом окислительные превращения метиламина аэробные метилобактерии осуществляют посредством дегидрогеназы, аминоксидазы или системы ферментов N-метилглутаматного пути.
Метиламиндегидрогеназа (МАДГ) обнаружена у бактерий родов Methylobacterium, Methylopila, Methylorhabdus, Blastobacter, Xanthobacter, Paracoccus, Melhylobacillus и Methylophilus [Доронина, 1999]. МАДГ отсутствует у клеток, выращенных на среде с метанолом или сукцинатом, а при пересеве бактерий на среду с метиламином акшвносіь фермента появляется раньше, чем начинается рост.
У различных штаммов Arfhrobacter globiformis обнаружена аминокспдаза, катализующая окисление метиламина до формальдегида и аммиака с образованием перекиси водорода [Логинова, Троценко, 1976]: CH3NH2+ 02+Н20 -» СН20 + NH3 + Н202
Принципиально иные первичные механизмы использования метиламина обнаружены у метилобактерии родов Hyphomicrobitim, Methyhbacferiimi, Methylophaga и Methylarcula [Доронина, 1999]. Показано, что использование этими бактериями ЫС-метиламина связано с акцептированием молекул данного субстрата на глутамате и синтезомN-метилпроизводных: у- глутамилметиламида и N-метилглутамата. В экстрактах клеток исследуемых бактерий обнаружены активности N-метилглутаматсиптазы, у-глутамилметиламидсинтетазы и N-метилглутаматдегидрогеназы. С другой стороны, только у галофилов Methylophaga limanica, Melhylarcula marina и Methylarcula terricola, обнаружена у-глутамилметиламидлиаза, обеспечивающая образование формальдегида и регенерацию глутамата. В целом, N-метилпроизводные глутамата являются переносчиками СНз -групп в основные биосинтетические пути (сериновый или РМФ).
Формальдегид (ФА) является центральным Сі-метаболитом, поступающим в первичные биосинтетические пути ассимиляции (РМФ и сериновый) и подвергающимся дальнейшему окислению с целью получения энергии. Автотрофные метшютрофы окисляют ФА через формиат до С02, который затем ассимилируют через классический РБФ путь (цикл Кальвина). Поскольку СН20 обладает высокой токсичностью из-за неспецифической реактивности к белкам и нуклеиновым кислотам, у аэробных метилобактерий должны существовать механизмы его высокоэффективной метаболизации [Attwood, Quayle, 1984; Graves et al., 1994]. В зависимости от организма, образующийся при росте на Сі-соединениях ФА участвует в энергетическом и/или конструктивном метаболизме. Превращение СН20 в С02 происходит в цитоплазме клеток. В случае образования ФА периплазматическимн PQQ-зависимыми МДГ или МАДГ, СН20 должен проникнуть в цитоплазму клетки для последующих превращений. Однако специфический транспортер ФА еще не идентифицирован [Van Spanning et al., 2000].
Известно несколько путей окисления ФА до С02, участвующих в генерации восстановленных эквивалентов для аэробного дыхания. Большинство метилобактерий обладают несколькими путями окисления ФА, которые могут использоваться для разных целей, включая вклад в энергетику и детоксикацию СН20.
Прямое окисление формальдегида до формиата у метилотрофов катализируется тремя различными ферментами: 1) НАД -зависимой дегидрогеназой, требующей GSI1 и обнаруженной у Brevibaclerium fuscum, Meihylorhabdus multivorans и Paracoccus kondratjevae; 2) НАД -зависимой дегидрогеназой, не требующей GSH, которая обнаружена у большинства метилотрофов; 3) дегидрогеназой, проявляющеїі in vitro активность с 2,6-дихлорфенолиндофенолом (ДХФИФ) и ФМС, как акцепторами электронов, в соответствии с уравнением:
СН20 + ДХФИФ + Н20 —НСООН + ДХФИФН2, и присутствует практически у всех метилотрофных бактерий [Anthony, 1982]. Окисление ФА связанной с красителями ФАДГ не считают ответственными за диссимиляцию СН20 в НСООН [Attwood, 1990]. Обычно эти ФАДГ неспецифичны к СН20 и не индуцируются при росте на метаноле, а их активности слишком низки для наблюдаемых скоростей роста.
Аэробные метилобактерии - деструкторы дихлорметана
Показано, что при росте аэробных бактерий-деструкторов на ДХМ индуцируется дихлорметандегалогеназа (ДХМДГ) (К.Ф. 4.5.1.3.) - цитоплазматический белок с мм. мономеров 34 кДа, катализирующий GSH-зависимую трансформацию CH2CI2 до формальдегида (ФА) и двух молекул НС1 [Kohler-Staub, Leisinger, 1985].
Впервые стехиометрическое превращение СН2СЬ в зависимой от восстановленного глутатиона (GSH) реакции было в показано опытах с экстрактами Hyphamicrobium sp. ДМ2 [Stucki et al., 1981]. В этой реакции конъюгат глутатиона (предположительно S-хлорметилглутатион) образуется энзиматически, и далее спонтанно гидролизуется до S-гидроксиметил глутатиона, который разлагается до формальдегида и GSH. Предполагается, что реакция происходит по механизму нуклеофильного замещения S\2. причем, в отличие от других алифатических дегалогеназ, хлорид замещается посредством прямой атаки тиоловой группы GSH, а не гидроксилов воды или карбоксильной группы в активном сайте фермента [Wackett et al., 1992; Vuilleumier, Leisinger, 1996; Fetzner, 1998]. Н-,0 HOSG Биосинтез, генерация энергии
Детали механизма дегалогенирования СНгСЬ у метилобактерий не вполне понятны. Образование короткоживущего S-хлорметилглутатиона, как вероятного интермедиата реакции, пока не доказано, а его химически синтезированная модель, 8-(хлормегил)-Ы-ацетил-цистеин, имеет период полураспада 4 сек при 0С в нейтральном буфере [Hashmi et al., 1994]. S-фторметилглутатион, другой, менее реакционноспособный гомолог S-хлор метил глутатиона, гидролизуется с полураспадом 5.8 мин в Д О Промежуточное образование этого соединения, имеющего F-ЯМР сигнал, сравнимый с S-фторметилглутатионом, наблюдали в опытах с дихлорметандегалогеназой М. leisingeri ДМ11 в реакционной смеси, содержащей GSH и CH2CIF [Blocki et al., 1994]. Показано, что химически синтезированный S-хлорметилглутатион алкилирует / // vitro основания ДНК, вызывая ее разрывы, т.е. нарушает репликацию in vivo и оказывает мутагенное действие [Keith, Telliard, 1979; Dechert, 1995]. В целом, данные о метаболической активации ДХМ до более токсичного продукта, способного взаимодействовать с ДНК и вызывать генотоксические эффекты, также свидетельствуют в пользу образования этого интермедиата [Graves et al., 1994; Guengerich, 1994; Guengerich etal., 1994; Green, 1997].
Функционально и по данным секвенирования генов ДХМДГ Mb. dichloromethamcum ДМ4 и М. leisingeri ДМ 11 были отнесены к тета-классу суперсемейства глутатион-S-трансфераз (GST) (К.Ф. 2.5.1.18) - ферментов, обнаруженных ранее у млекопитающих, рыб, птиц, растений, насекомых и дрожжей [Blocki et al., 1994; Ketterer, Christodoulides, 1994; Leisinger et al., 1994; Armstrong, 1997; Vuilleumier, 1997; Gisi et al., 2001]. Главной функцией GST у эукариот являются связывание, трансформация и детоксикация электрофильных соединений природного и искусственного происхождения путем конъюгации с GSH [Hayes, Pulford, 1995; Marrs, 1996; Vuilleumier, 1997]. У млекопитающих выявлены, по крайней мере, 9 классов GST (а-, ц-, я-, 6-, со-, о-, -, к- и микросомный), дифференцируемых на основе сравнения аминокислотных последовательностей и способности связывать различные субстраты [Mannefvik, Danielson, 1988; Hayes, Pulford, 1995; Board et al., 2000]. Дополнительные классы GST найдены у растений (ер- и г-классы), насекомых (5-класс) и бактерий ((3-класс) [Rossjohn et al., 1998; Edwards et al., 2000]. Показано, что, наряду с низкой гомологией с другими семействами белков, GST существенно различаются между собой. Так, доля идентичных последовательностей ДХМДГ из штаммов ДМ4 и ДМИ с известными ферментами этого семейства составляет лишь 22-30% [Meyer et al., 1991; Vuilleumier, Leisinger, 1996; Vuilleumier, 1997]. Тем не менее, большинство наиболее близких к бактериальным ДХМДГ глутатион-8-трансфераз 6-класса млекопитающих (GST Т1-1) также проявляет активность с дихлорметаном [Meyer et al., 1991; Jemth, Mannervik, 1997; Whittington et al., 1999]. Однако активная с ДХМ GST 9-класса из печени крыс (GST Т1-1), экспресспруемая с плазмиды, не поддерживала рост на ДХМ мутанта Mb. dichloromethanicum ДМ4, дефектного по ДХМДГ, что указывает на различия в каталитических свойствах GST бактерий и млекопитающих [Gisi et al., 1999]. Особенностью бактериальных GST являеіся ограниченное количество субстратов, тогда как типичные GST способны превращать также ароматические хлорированные соединения, пероксиды и эпоксиды. Так, бактериальные GST неактивны с 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ), являющимся тестовым субстратом для обнаружения активности GST [Vuilleumier, 1997]. Установлено, что бактериальные ферменты семейства GST обладают высокой специфичностью, а катализируемая ими реакция в 108 раз превышает скорость абиотического разложения ДХМ [Blocki et al., 1994]. Еще одно отличие заключается в нестабильности GSH-конъюгатов, образуемых при ферментативной реакции с бактериальными ДХМДГ и спонтанно гидролизующихся до GSH, СЬЬО и НС1 [Vuilleumier, 1997]. ДХМДГ Mb. dichloromethanicum ДМ4 и Hyphomicrobium sp. ДМ2 имеют идентичные N-концевые аминокислотные последовательности и гексамерную структуру мономеров массой 33 кДа [Kohler-Staub, Leisinger, 1985]. Оба фермента отнесены к дегалогеназам группы А, которые индуцируются только ДХМ, но проявляют с ним низкую каталитическую активность. При росте этих бактерий на ДХМ до 20% белка клеток приходится на /ДХМДГ, а при лимитировании роста в условиях хемостата - до 50% [Gisi et al., 1998; Harder, Dijkhuizen, 1983]. Напротив, ДХМДГ M. leisingeri ДМИ с м. м. мономеров 31 кДа, отнесенная к группе В, в 5,6 раз более активна с СН2СЬ, чем ферменты группы A (kcat = 3.3 s"1, Km = 59 цМ для ДХМДГ группы В и kcat = 0.6 s"1, Km = 9 цМ для ферментов группы A) [Vuilleumier, 1997]. Различия в кинетических свойствах ферментов штаммов ДМ11 и ДМ4, по-видимому, отражают условия в естественных местах обитания этих деструкторов [Vuilleumier et al., 2001]. Так, штамм ДМ 11 был выделен из мест, десятилетиями загрязняемых высокими концентрациями ДХМ, и эволюционировал в условиях большого избытка этого поллютанта. Напротив, штамм ДМ4 был изолирован из осадочных отложений стоков с низкой концентрацией ДХМ [Stucki, 1990]. Помимо различий кинетических констант ДХМДГ А и В групп, интересной особенностью фермента М. leisingeri ДМ 11 является также наличие положительной кооператпвности при связывании GSH [Kohler-Staub, Leisinger, 1985; Scholtz et al., 1988]. Для каталитической эффективности ДХМДГ М. leisingeri ДМ 11 методом сайт-направленного мутагенеза показана необходимость типичного для 9-класса глутатион-8-трансфераз Seri2, но не Тугб, важного для а-, д- и я-классов GST [Vuilleumier, Leisinger, 1996].
Получение ультратонких срезов бактериальных клеток и электроннаяикроскопия
Для получения ультратонких срезов бактерии фиксировали в 2%-ном растворе глутарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) 2 ч при 4С, трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1% OsC 12 ч при 4С. После обезвоживания в серии спиртов возрастающей концентрации (70 - 100%) и абсолютированном ацетоне препараты заключали в эпоксидную смолу Ероп-812.
Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-800A (Швеция), монтировали на опорные сеточки, покрытые формваровой подложкой. Контрастирование проводили 2%-ным раствором уранилацетата в 70%-ном этиловом спирте в течение 30 - 45 мин при 37С и дополнительно окрашивали цитратом свинца при 20С [Reynolds, 1963]. Изображения бактериальных клеток и структурных особенностей получены при помощи элек-i ронного микроскопа JEM 100В ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 60 кВ
Приготовление и фотографии ультратонких срезов клеток были выполнены к.б.н Сузпной Н.Е. (ИБФМ РАН, г. Пущине). Рентгеновский микроанализ элементного состава комнартментов клеток
Рентгеновский микроанализ проводили с помощью электронного микроскопа JEM-100CX1I ("JEOL", Япония), снабженного сканирующей приставкой EM-ASID4D и рентгеновским микроанализатором LINK-860 с детектором Е5423 (Link-System, Англия) при увеличении 20000х и напряжении до 60 кВ. Препараты для просмотра представляли собой ультратонкие срезы клеток без дополнительного контрастирования. Суспензию наносили на медные сетки с карбонизированной формоваровой пленкой и напыляли углеродом под углом 90. Спектры обрабатывали с помощью компьютерной программы LAF/PB. Исследования проводили совместно с В. В. Сорокиным (ИНМИРАН, г. Москва).
Выделение фосфолипидов. Бактерии в конце логарифмической фазы роста осаждали центрифугированием (6000 g, 10 мин). Фосфолипиды экстрагировали из 2 г сырой биомассы, тщательно перемешивая с 3 мл смеси хлороформ метанол (12 об/об) холоду в течение 1 ч. Суспензию центрифугировали (6000 g, 10 мин) Процедуру экстракции повторяли дважды, сокращая время второй экстракции до 15 мин. Супернатанты объединяли, добавляли 2 мл хлороформа и 2 мл воды, перемешивали 15 мин на холоду. Смесь центрифугировали (6000 g, 20 мин), при этом она разделялась на три слоя: верхний содержал аминокислоты и сахара; интерфаза - белки, нижний слой — фосфолипиды, изопреноиды и т.п. Полученный раствор фосфолипидов отбирали одноразовым шприцем с длинной иглой, выпаривали на вакуумном испарителе при 30С [Говорухина, Троценко, 1989]. Остаток суспендировали в 200 мкл хлороформа, суспензию разливали по 50 мкл в пробирки Эппендорфа и хранили плотно закрытыми при -20С.
Разделение фосфолипидов методом ТСХ проводили на пластинках Kieselgel 60 F (Merck, Германия), предварительно отмытых в системе хлороформ: метанол (65:30 об/об). Одномерную хроматографию проводили в системе хлороформ : метанол : вода : 7N NH4OH (60 : 37.5 : 3.4 : 1). После разгонки пластинки высушивали при комнатной температуре. Наносили количество липидов, соответствующее 0.5 ед. ОП с цветным реактивом при 660 нм.
Обнаружение фосфолипидов. Пластинки после извлечения из хроматографической камеры высушивали на воздухе в течение 30 мин и проявляли. Фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и другие липиды со свободными аминогруппами проявляли 0.25% раствором нингидрина в ацетоне. Аминсодержащие липиды обнаруживались в виде розово-фиолетовых пятен через 1-2 ч при комнатной температуре. Для выявления холинсодержащих липидов использовали реагент Драгендорфа. Для его приготовления брали следующие растворы: А) 1.7 г нитрата висмута, растворенного в 100 мл 20% уксусной кислоты; Б) 10 г иодида калия, растворенного в 25 мл. Непосредственно перед проявлением пластинок смешивали 20 мл раствора А с 5 мл раствора Б и добавляли 70 мл воды. Полученной смесью опрыскивали хроматограммы. Через несколько минут холинсодержащие липиды проявлялись в виде оранжевых пятен. Для обнаружения всех липидов кизельгелевые пластинки опрыскивали раствором молибденовой кислоїы (5 мл 60% (в/о) НСІО4, 10 мл ЇМ ІІС1 и 25 мл 4% (NH MoO-O и выдерживали при комнатной температуре до появления на желтом фоне синих пятен липидов [Skidmore, Entenman, 1962].
Количественное определение фосфолипндов проводили путем измерения концентрации содержащегося в них неорганического фосфора [Toshima, Yoshimura, 1975]. Для этого из отмеченных участков хроматофамм, обесцвеченных после проявления в парах йода, шпателем полностью снимали кизельгель и переносили в чистые эппендорфы Фосфолипиды экстрагировали 0.5 мл подкисленного метанола (97.9 мл СНзОП, 2 1 мл НС1) при комнатной температуре в течение суток, затем носитель осаждали центрифугированием (6000 g, 10 мин), а супернатант переносили в чистые пробирки и высушивали при комнатной температуре до полного испарения метанола. Затем фосфолипиды в пробах гидролизовали 0.1 мл 57% HCIO4 и прогревали 10 мин при 180С в закрытых стеклянных пробирках. После охлаждения к полученным смесям приливали 0 8 мл воды, 0.16 мл 1.5% Tween 20 и 0.4 мл цветного реактива на неорганический фосфор (0.2% малахитовый зеленый и 4.2% (ЫН МоОд в 5N НС1) Через 20 мин определяли 011 проб при 660 нм против контроля, не содержащего липидный экстракт. Содержание отдельньгх фосфолипидов выражали в процентах от общего количества их в клетке.
Изменения состава жирных кислот и фосфолипидов клеток
Анализ профилей жирных кислот Mb. dichloroinethanicum ЩЛА,Мр. helvetica ДМб н A. methylovorans ДМ 10 при росте на ДХМ и повышенной солености среды позволил сравнить влияние растворителя СН2СІ2 и продуцируемых при его дегалогенировании ионов хлора на клетки деструкторов (таблица 5.1.1-2).
При росте на ДХМ у всех исследуемых штаммов преобладали насыщенные жирные кислоты за счет увеличения доли пальмитиновой (Сіб:о) и снижения относительного содержания октадеценовых (Сі8:і) и эйкозеновой (Сгом) кислот. Такие изменения свидетельствуют о снижении текучести мембран деструкторов в присутствии СН2СІ2.
У штаммов с сериновым путем Сі-метаболизма отмечено уменьшение количества гепта- (Сі7:о) и октадекановых (Сіх о) жирных кислот, при росте на ДХМ и на метаноле с 0.5-1.5% NaCl в среде. Однако в присутствии таких концентраций соли для этих деструкторов было характерно преобладание ненасыщенных жирных кислот за счет возрастающей доли октадеценовых (Ci8:i) и эйкозеновой (Сго:і) кислот и уменьшения пальмитиновой (Сіб.о) и пальмитолеиновой (Сіб.і) ЖК, приводящее к увеличению текучести мембран.
Подобная реакция клеток на повышение солености среды была обнаружена у некоторых грамотрицательных галофильных бактерий. Однако у других организмов наблюдали обратную тенденцию [Ventosa et al., 1998]. В отличие от сериновых метилобактертій, A. methylovorans ДМ10 при росте в присутствии 1.5% NaCl демонстрировал увеличение содержания насыщенных жирных кислот (таблица 5.1.2). Этот эффект достигался за счет повышения уровней пента- (С о), гекса- (Ск, о), гепта-(Ci7o) и октадекановых (Ci8:o), а также уменьшения содержания октадеценовых (Ci8:i) кислот. При этом концентрации гекса- (Сіб:і) и гептадеценовых (С і) кислот изменялись незначительно. Кроме того, отмечено увеличение доли 3-гидрокси- и изо- Cis:o, Сіб-о и Єно- кислот.
Обнаруженное у Мр. helvetica ДМ6 и A. methylovorans ДМ 10, выращенных в присутствии 1.5% NaCl или ДХМ, уменьшение доли циклопропановых кислот (С-ші), может быть следствием ингибирования хлор-ионами циклопропан-ЖК-синтетазы, как это было показано для умеренно галофильной эубактерии НХ [Kuchta, Russell, 1994]. Однако при росте на среде с ДХМ A. methylovorans ДМ10 подобных изменений не наблюдалось, что может свидетельствовать о наличии у этого штамма эффективных механизмов защиты от внутриклеточно образуемых ионов СГ.
Анализ фосфолипидного состава клеток деструкторов при росте в присутствии 0.5 -1.5 % NaCl выявил уменьшение содержания нейтральных и накопление отрицательно заряженных липидов у метилобактерий с сериновым путем (таблица 5.1.3). Так, у Мр. helvetica ДМ6 при повышении солености среды возрастал уровень фосфатидплглицерина (ФҐ) при одновременном снижении концентраций фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭА). Увеличение доли фосфатидилсерина (ФС) в клетках Mb. dichloromethanicum ДМ4, выращенных на среде с метанолом при 0.5% NaCl, компенсировало незначительное уменьшение количества ФГ и аккумуляцию ФХ. Такие изменения являются типичным ответом на солевой стрессор и служат для стабилизации мембранного бислоя в этих условиях [Ventosa et al., 1998; Cui et al., 2005]. Считается, что создание на мембране негативно заряженной плотности может служить для баланса зарядов на поверхности, участвуя в регуляции проницаемости мембран для внеклеточных ионов [Sutton et al., 1991; Ventosa et al., 1998].
Однако только штамм ДМ6 поддерживал такую фосфолипидную композицию при росте на среде с дихлорметаном. У Mb. dichloromethanicum ДМ4 и A. methylovorans ДМ 10 при инкубации с ДХМ, напротив, происходило снижение уровня негативно заряженного ФГ и накопление ФХ, в результате чего в клетках преобладали нейтральные фосфолипиды. Незаряженные липиды, несущие структурную функцию, вероятно, служили для стабилизации мембран в присутствии ДХМ. Аналогичные изменения липидного состава, найденные у клеток штамма ДМ10, выращенных на среде с метанолом
Изменения фосфолишщного состава мембран у не растущего на ДХМ трансконъюганта Mb. extorquens АМ1/рМЕ8221 при инкубации с СН2СЬ или 0.5% NaCI включали увеличение содержания ФГ при снижении количества ФЭА и ФХ. Эти изменения также отражали типичную реакцию клеток на воздействие солевого стрессора (табл 5.1.4).
Итак, модификация жирнокислотного и фосфолипидного профилей штаммов-деструкторов при росте на ДХМ является ответом на повышение внутри- и внеклеточной концентрации ионов СГ и служит для защиты клеток от этого растворителя. При этом для Mb. dichloromethanicum ДМ4 и A. methylovorans ДМ 10 основное значение при использовании ДХМ, по-видимому, имеет стабилизация мембран, достигаемая увеличением доли насыщенных ЖК и нейтральных ФЛ. Тогда как у М. helvelica ДМ 6 способность к росту на CH2CI2 подразумевает также защиту клеток при изменениях ионного баланса путем аккумуляции негативно заряженных липидов.
Поскольку при дегалогенировании ДХМ аэробными метилобактериями в среде культивирования накапливаются ионы хлора, и повышается осмотическое давление, решено было проверить возможность существования морфологических изменений клеток при использовании данного субстрата. Для этого был проведен сравнительный анализ ультратонких срезов клеток исследуемых деструкторов и трансконъюганта Mb. extorqnens АМ1/рМЕ8221, инкубированных с ДХМ, а также с 0.5-1.5% NaCl (рис. 5.2.1-4) В качестве контролей использовали клетки, выращенные на среде «К» с метанолом (рис. 5.2.1-4, а).
Как видно из электронных микрофотографий, в присутствии ДХМ (рис. 5.2.1-4, в) и при повышении солености среды (рис. 5.2.1-4, б), у клеток не происходило заметного сокращения периплазматического пространства и уплотнения клеточной стенки, наблюдаемых у некоторых грамотрицательных бактерий при солевом стрессе [Ventosa et al., 1998]. Особенностью морфологии клеток деструкторов при росте на среде с метанолом и 0.5% - 1.5% NaCl являются необычные электронно-плотные структуры, расположенные на поверхности клеточного конверта. Однако, у трансконъюганта Ш). extorqnens АМ1/рМЕ8221, экспрессирующего активную ДХМДГ из Mb. dichlovomelhanicwn ДМ4, инкубация с ДХМ, в отличие от солевого стресса, не приводила к появлению подобных поверхностных структур (рис. 5.2.4, б-в). Поскольку в целом у исследуемых штаммов рода Methylobactermm обнаруженный эффект был выражен слабо, наблюдаемые изменения при деградации ДХМ, по-видимому, специфичны для Мр. helvetica ДМ6 и А. methylovoram ДМ10.
Ранее у грамотрицательного галофила Halobacleroides acetoethylicus в условиях повышенной солености в клеточной стенке были выявлены необычные внутренние кристалло-подобные формы, предположительно участвующие в ответе на воздействие стрессора [Rengpipat et al., 1988]. Во внешней мембране галоалкалтолерантного оксалотрофа Ammoniphilus oxalivorans также наблюдали электронно-плотные гранулы, похожие на целлулосомы Clostridium thermocellwn, однако истинная природа и функция этих структур не были определены [Zaitsev et al., 1998]. На поверхности клеточного конверта у сотен видов филогенетически гетерогенных бактерий и архей обнаружены S-слои, образованные белковыми или гликопротеидными субъединицами. У грамотрицательных бактерий эти формирования свзяываются с липополисахаридами внешней мембраны и могут служить для защиты клеток от неблагоприятных факторов внешней среды, в частности в условиях солевого стресса [Beveridge et al., 1997; Sara, Sleytr, 2000]. Показано, что S-слои цианобактерии Synechococcus GL-24 в условиях высокой концентрации кальция и сульфатов в среде способны служить фильтром, предотвращающим минерализацию других слоев клеточной стенки [Schultze-Lam, Beveridge, 1994].