Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных Маркушева, Татьяна Вячеславовна

Введение к работе

Актуальность темы

Известно, что в современной биосфере микроорганизмы играют важную роль в вовлечении синтетических производных в естественный обмен веществ и энергии. Микробные клетки способны осуществлять ассимиляцию разнообразных химических субстанций, в ходе которых они выполняют процессы конверсии молекул ксенобиотиков до экологически безопасных продуктов. Именно поэтому в настоящее время применение микроорганизмов рассматривается как основа наиболее выгодных способов поддержания качества окружающей среды.

Существенную роль в конверсии синтетических органических соединений играют бактерии. Это связано с тем, что важной особенностью бактериальных клеток является их высокая приспособляемость к изменяющимся факторам среды, из-за которой они приобретают возможность использовать в качестве источников питания и энергии большое число антропогенных производных, включая и опасные по отношению к другим живым системам.

Значительную часть стойких токсичных экотоксикантов составляют хлорорганические производные, входящие в категорию крупнотоннажных продуктов, производимых для нужд сельского хозяйства, химической, лакокрасочной, деревообрабатывающей промышленности, целлюлозно- бумажного производства, нефтеперерабатывающей и коксохимической отраслей. Источниками эмиссии поллютантов этой группы являются зоны производства, сточные воды и отходы, а также термические установки по их сжиганию, часто производящие еще более токсичные полихлордиоксины (Винокуров С.В. и др., 1995; Майстренко В.Н., Клюев Н.А., 2004; Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010). Реальную опасность представляют собой и места складирования. Например, к настоящему времени на территории «Уфахимпром» - накоплено 412,14 тыс.м отходов в 8 шламонакопителях и 100 тонн высокотоксичных отходов (в т.ч. хлорфенолов), условия хранения которых по оценкам специалистов не соответствуют санитарным и экологическим нормам (Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010). Появление в окружающей среде токсикантов связано также с недостаточным качеством очистки промышленных стоков. По сведениям о работе очистных сооружений, приведенным в Государственном докладе «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2001 году», из 123 биологических очистных сооружений в проектном режиме функционировали 19, остальные - работали неэффективно. Даже в ситуации, когда сброс стоков в поверхностные водные объекты снизился, в водной среде обнаруживаются все химические соединения, которые вырабатываются заводами химического профиля. В питьевой воде г. Уфы идентифицировано более 100 химических соединений-загрязнителей, в т.ч. фенол, бензол, безапирен, ряд пестицидов, включая 2,4-Д, ДДТ, изомеры гексациклогексана, летучие галогенсодержащие углеводороды, 1,2-дихлорэтан, диоксины. Суммарное содержание опасных веществ в отдельные периоды года достигает критических значений (Винокуров С.В. и др., 1995; Ильин В.Г. и др., 1995).

Критические концентрации загрязнителей ароматического ряда обнаружены в Стерлитамаке, Кемерово, Славгороде, Перми, Дзержинске, Чапаевске, Волгограде и Павлодаре. В связи с высоким уровнем объемов накопленных отходов хлорорганического синтеза в 2010 году была организована инвентаризация и учет опасных объектов РФ с целью разработки мер по ликвидации экологического ущерба и определением механизмов их реализации, включая пилотные проекты отработки технологий утилизации загрязнителей (Хизбуллин Ф.Ф. и др., 2011).

Вместе с тем, анализ работ по проблеме утилизации синтетических соединений, показывает, что, несмотря на то, что современный этап исследований биологического воздействия на хлорированные производные характеризуется выраженным практическим интересом к изучению микроорганизмов-деструкторов, число изученных бактериальных культур ограничено. Данные, раскрывающие особенности биологической конверсии фенола и его производных, чаще всего касаются представителей рода Pseudomonas, несколько меньше известно о представителях родов Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus и Sphingomonas (Козловский C. и др., 1993; Lang E. et al., 1996; Prieto M. et al, 2002; Rehfuss М. et al, 2005; Gouda М., 2007; Agarry S. et al., 2008; Liu Y. et al., 2008; Wang C., 2008; Wasi S. et al., 2008; Плотникова Е., 2010).

В настоящее время отсутствие системных исследований микробных деструкторов является сдерживающим фактором развития безопасных и экономически выгодных технологий для решений частных задач рационального использования и охраны природных ресурсов. Следует подчеркнуть, что биотехнологии примерно в 50 раз дешевле традиционных методов, при этом конверсию загрязнителей можно провести без накопления вредных или токсичных веществ, что позволяет исключить вторичную контаминацию среды. Кроме этого, появляется возможность решения проблемы уничтожения значительных объемов накопленных отходов и невостребованных препаратов.

Вместе с тем, изучение микроорганизмов, способных ассимилировать молекулы экотоксикантов, имеет не только большое практическое значение, но и является одним из фундаментальных направлений микробиологии, раскрывающим новые особенности роли микробов в круговороте веществ. Это направление связано с исследованием теоретических основ жизнедеятельности микроорганизмов в техносфере. Оно охватывает вопросы биоразнообразия, генетической изменчивости, механизмов метаболических взаимоотношений с факторами трансформированной среды, раскрывает процессы адаптации и (микро)эволюции живых систем в условиях сильного антропогенного пресса, включая и случаи прямого их уничтожения.

Познание и освоение потенциала прокариот, обладающих особыми свойствами, а именно, способностью осуществлять контроль над содержанием загрязнителей в окружающей среде и представляющих собой в этом смысле
ценный микробиологический ресурс, современной биологии в целом.

Цель работы

Выявление новых природных бактерий-деструкторов фенола и его хлорированных производных, их сравнительный анализ и определение возможности практического применения. Задачи исследования

1. Выделить новые бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных из образцов смешанных популяций микроорганизмов техногенной экосистемы.

2. Идентифицировать штаммы-деструкторы в соответствии с культурально- морфологическими, физиолого-биохимическими и молекулярными критериями систематики.

3. Исследовать пути метаболизма молекул ксенобиотиков и получить количественные и качественные характеристики процессов их конверсии.

4. Изучить роль экстрахромосомных элементов в генетическом контроле этапов ассимиляции хлорароматических производных.

5. Выявить уровень гомологии ДНК геномов изучаемых штаммов с ранее изученными генетическими системами конверсии хлорфеноксикислот бактерий.

6. Определить возможности практического применения вновь выделенных штаммов - деструкторов.

Научная новизна исследования

Выделены новые штаммы бактерий-деструкторов фенола, 2,4- дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5- трихлорфеноксиуксусной кислот.

Филогенетическое положение штаммов определено в соответствии с результатами исследования культурально-морфологических, физиолого- биохимических признаков, сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК и белкового профилирования. Согласно филогенетической обособленности штаммы Citrobacter sp. 36 4CPA, Stenotrophomonas sp. 33Т и Xanthomonas sp. 33DCP дифференцированы как новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Впервые выделены бактерии-деструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

- важная часть исследований

Впервые установлено, что бактерии родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas выполняют оригинальные реакции ассимиляции хлорфеноксикислот с образованием феноксиуксусной кислоты с последующим раскрытием ароматического кольца.

Выявлено, что генетические системы, детерминирующие метаболизм хлорфеноксиуксусных кислот у штаммов родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas, располагаются на плазмидах.

Методом ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР-анализа с применением олигонуклеотидных праймеров установлено, что системы генетического контроля катаболизма молекул хлорфеноксикислот имеют существенные отличия от известных кластеров tfd- и ft-генов штаммов Cupriavidus necator JMP134 и Burkholderia cepacia AC1100.

Теоретическое и практическое значение работы

Получены новые данные о разнообразии природных штаммов- деструкторов фенола и его хлорированных производных. Данные о деструкторах внесены в Консолидированный каталог культур микроорганизмов Российских немедицинских коллекций Consolidated Catalogue of Microbial Cultures Held in Russian Non-medical Collections / Edit. L.V. Kalakoutskii - Vol. I. Bacteria, 2001.Р. 3915-4077. Режим доступа: ).

Последовательности генов 16S рРНК вновь выделенных штаммов депонированы в международную базу нуклеотидных последовательностей данных GenBank (GenBank accession numbers: HQ877451, HQ891021, HQ891022, DQ333356).

Установлены оригинальные пути ассимиляции моноароматических галогенидов и локализованы генетические элементы их контроля.

Показана принципиальная возможность применения новых штаммов- деструкторов в области защиты среды обитания человека.

Сведения о деструкторах, культуры деструкторов, а также их генетические элементы доступны для использования в научных и практических целях.

Результаты работы используются в образовательном процессе в курсах общебиологических дисциплин БГПУ им. М.Акмуллы и УГАТУ (биология, микробиология, экология, биохимия, генетика и биотехнология), а также при подготовке спецкурсов для магистров и бакалавров.

Практические рекомендации

Штаммы-деструкторы рекомендуются для очистки водной среды и почвы в условиях предприятий нефтехимического профиля.

Штаммы-деструкторы Bacillus subtilis (Патент РФ № 1742226), Arthrobacter globiformis (Патент РФ № 2076523), Agrobacterium tumefaciens (Патент РФ № 2077575) и Serratia marcescens (Патент РФ № 2074254) рекомендуются для ремедиации объектов окружающей среды с целью утилизации фенолов в стоках нефтехимических предприятий Северного промузла Республики Башкортостан.

Штаммы-деструкторы Bacillus cereus (Патент РФ № 2129605), и Gluconobacter oxydans (Патент РФ №2130067) рекомендуются для утилизации фенолов и его хлорированных производных в почве.

Генетические ресурсы штаммов-деструкторов рекомендуются для создания новых штаммов с заданными свойствами in vitro (Патенты РФ №№ 2064501, 2130074 и 2125263).

Основные положения, выносимые на защиту

6. 1. В составе почвенной биоты, подвергавшейся воздействию химических факторов промышленного производства, присутствуют бактерии- деструкторы фенола и его хлорированных производных.

   2. Деструкторами хлорфеноксикислот являются представители родов

   Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

   6. 3. Ассимиляция хлорфеноксикислот у культур деструкторов происходит через процессы дегалогенирования ароматического кольца с последующим его раскрытием.

      4. Штаммы-деструкторы обладают оригинальными генетическими кластерами, детерминирующими катаболизм молекул хлорфеноксикислот и их можно применить для создания новых штаммов-деструкторов in vitro.

      5. Генетические детерминанты, контролирующие процессы катаболизма хлорфеноксикислот в клетках бактерий-деструкторов, могут располагаться на плазмидах.

      6. Вновь выделенные бактерии-деструкторы рекомендуется использовать в качестве действующих элементов технологий очистки водной среды и почвы от фенола и его хлорированных производных, включая 2,4- дихлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную, 2,4-дихлорфеноксиуксусную и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоту.

      Апробация работы

      Результаты исследований докладывались и обсуждались на международных научных мероприятиях, в частности, на Экологическом Конгрессе (Япония, 1990), I Конгрессе европейских микробиологов (Словения, 2000), симпозиумах ELSO (Германия, 2003, Франция, 2004), Сахаровских чтениях (Республика Беларусь, 2006, 2009); на 1 Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), II С.- Петербургском международном экологическом форуме (2008); съездах: XVI Менделеевском (1998), Всероссийского общества генетиков и селекционеров (2000, 2004, 2008), Биохимического общества (Москва, 2002), Общества биотехнологов (Москва, 2006); в ходе работы в научно-практических конференций, направленных на решение экологических проблем: «Экологический императив сельского хозяйства РБ» (Уфа, 1998), «Реновация: отходы-технологии-доходы» (Уфа, 2004), «Актуальные экологические проблемы» (Уфа, 2007), «Проблемы безопасности и защиты населения и территорий от чрезвычайных ситуаций» (Уфа, 2009), а также в рамках профильных конференций: «Микробиологические методы защиты окружающей среды» (Пущино, 1988), «Научные аспекты экологических проблем России» (Москва, 2001), «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и его сопредельных территорий» (Оренбург, 2001), «Наука-Бизнес-Образование» (Пущино, 2005), «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), «Микробное разнообразие» (Пермь, 2008), «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010), «Факторы экспериментальной эволюции» (Киев, 2010). Материалы исследований были обсуждены на межлабораторном научном семинаре Института биологии Уфимского научного центра и расширенном заседании диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Уфа, 2011).

      Публикации

      Основные научные результаты диссертации изложены в 136 печатных работах, в том числе: 14 публикациях, указанных в Перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК Министерства науки и образования РФ, 9 патентах, в 1 работе, депонированной в ВИНИТИ, в 1 монографии, 7 публикациях в научных электронных изданиях, 32 работах в научных сборниках и 72 - в материалах всероссийских и международных конференций.

      Объем и структура диссертации