Введение к работе
Актуальность проблемы: Ауторегуляция развития живых организмов, Ікл^токТлТГйх-сообществ является важным общебиологическим феноменом, роль которого в поддержании численности популяции, я также общего-, экологического равновесия в биосфере остается малоизученной.
Микробные популяции представляют собой уникальную модель для осуществления самых различных экологических экспериментов, выяснения механизмов взаимодействия клеток, а также решения ряда эволюционных проблем, в том числе и проблемы возникновения многоклеточ-
НОСТИ. > - ' .
Многочисленные эксперименты свидетельствуют о том, что процесс роста популяции бактерий является в значительной степени саморегулируемым, то есть зависит от состава и концентраций выделяемых ими в окружающую среду метаболитов. Идентифицированы ауторе-гуляторы, ингибирующие рост микроорганизмов [Эль-Регистан и др., 1979], имеются свидетельства о наличии аналогичных стимуляторов роста бактерий [Lankford et al., 1966; Пшеничное и др., 19?5]. Несмотря на большую значимость и актуальность проблемы ауторегуля-ции, ее механизмы в целом, однако, остаются малоизученными.
Еще.в меньшей степени изучены вопросы ауторегуляции при голодании бактерий, опубликованные к настоящему времени результаты касаются главным образом регуляции метаболизма и изменения состава и физиологических характеристик клеток.
Популяционные аспекты голодания до сих пор не являлись предметом направленного изучения. Имеющиеся литературные данные весьма ограничены и посвящены главным образом исследованию этого процесса при сравнительно низких плотностях суспензий бактерий.
Целью настоящей работы являлось изучение популяционных аспектов голодания в культурах высокой плотности. В процессе выполнения работы были поставлены следующие основные задачи:
1. Выяснить характер.зависимости параметров кривых выживаемости от плотности популяции бактерий.
2.Определить последовательность и характер физиологических
изменений, при голодании микроорганизмов в культурах различной
1ЛОТНОСТИ. ,''-,.
3.Определить роль выделяемых во внеклеточную среду продуктов
метаболизма и автолиза бактерий в поддержании их жизнеспособности.
4.Осуществить контроль динамики ауторегуляторов роста и гибели бактерий, выяснить ее связь с характером соответствующих кривых выживаемости.
5.Изучить основные свойства ауторегуляторов.
'Для решения этих задач потребовалось проведение ряда дополнительных исследований, результаты которых приведены в Приложении.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.Определяющее влияние на скорость гибели бактерий при голодании оказывает состав формируемой популяцией внеклеточной среды.
2. Голодающая популяция является саморегулируемой системой, поскольку состав и свойства внеклеточной среды зависят от ее плотности.
3.Ауторегуляция выживаемости осуществляется при участии как минимум двух групп биологически активных соединений - аутостимуля-торов роста и ауторегуляторов, ускоряющих гибель бактерий.
Научная новизна.
Впервые обнаружено, что скорость гибели микроорганизмов в культурах высокой плотности связана с составом формируемой ими внеклеточной среды и определяется концентрацией особых ускоряющих гибель клеток аутометаболитов -' УГ-соединений. Разработаны методы определения биологической активности этих веществ-.
Изучены основные свойства и динамика УГ-метаболитов в. процессе роста и голодания бактерий.
Впервые показано, что в процессе голодания во внеклеточную среду выделяются аутостимуляторы роста бактерий (СР). Получены свидетельства, что эти вещества идентичны аутостимуляторам, обнаруженным ранее при изучении процесса роста этого же штамма E.coli.
Проведена частичная хроматографическая очистка УГ- и СР- соединений. Выяснено, что эти вещества являются низкомолекулярными соединениями.
Для описания кривых выживаемости культур голодающих бактерий предложено использовать параметры уравнений линейной регрессии.
.Изучен процесс возникновения колебаний численности микроорганизмов, предложено новое объяснение и математическая модель этого явления.
Показана возможность применения турбидиметрического метода для контроля физиологических изменений при голодании бактерий.
Обнаружено, что, в отличие от других стрессовых воздействии, гибель клеток при голодании может сопровождаться относительным снижением их окрашиваемое бромистий этидием. Выдвинуто предположение, что уменьшение интенсивности является следствием деградации связывающих краситель структур.
Получены данные, свидетельствующие о том, что в процессе голодания может осуществляться репарация клеточных структур.
Предложено оценивать физиологическое состояние голодающих бактерии на основании их способности к росту на жидких питательных средах путем определения соответствующего показателя - фактора эффективности роста (ФЭР). Высказано предположение, что увеличение ФЭР при низкой остаточной выживаемости вызвано реактивацией покоящихся форм бактерий.
Практическая значимость. _ Результаты исследовании могут быть использованы для совершенствования технологий приготовления и хранения бактериальных препаратов. На основании полученных данных разработан лабораторный регламент получения высокоактивных стимуляторов роста микроорганизмов, которые могут быть использованы в качестЁе добавок к питательным средам, получено два авторских свидетельства. Исследуется возможность использования этих соединений в медицинских и ветеринарных целях.
Апробация работы. По материалам работы сделано 6 докладов на конференциях ГосНШІ ОЧБ, проведен семинар в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов .(Пущино), сделаны пленарные доклады на 1 Отраслевой конференции-конкурсе молодых ученых Министерства медицинской и микробиологической промышленности, Кольцово, 1988 (1 премия), Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов", Пущино, 1989, доклад на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского университета, ряд стендовых докладов на Всесоюзных и других конференциях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 ра^от и два изобретения, на одно изобретение подана заявка.
Объем и структуради^^тадии. Работа изложена на 226 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения,, выводов и приложений, библиография - 212 наименований, 102 на русском и ПО на иностранных языках. Диссертация содержит 9 таблиц и 19 рисунков, приложения - 3 таблицы и 12 рисунков.