Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Взаимодействие ассоциативных бактерий с высшими растениями 11
1.1.1. Роль высших растений в бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии 12
1.1.2. Роль ассоциативных бактерий в бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии 14
1.1.3. Этапы формирования бактериально-растительного ассоциативного взаимодействия 19
1.2. Ассоциативная азотфиксация в различных биоклиматических зонах 22
1.3. Морфологические и физиолого – биохимические особенности ассоциативных азотфиксаторов 27
1.4. Биопрепараты на основе ассоциативных азотфиксирующих бактерий 35
ГЛАВА 2. Объекты, характеристика растений и методы, используемые в опыте 40
2.1. Объекты 40
2.2. Характеристика растений, используемых в опытах 40
2.3. Методы 41
2.3.1. Метод отбора проб корней, проведенный во Вьетнаме и получения накопительных культур 41
2.3.2. Метод выделения чистых культур 42
2.3.3. Метод опредедения нитрогеназной активности накопительных культур и чистых культур 42
2.3.4. Метод определения ростактивирующего эффекта чистых культур.. 43
2.3.5. Метод определения влияния чистых культур на рост, массу стеблья, нитрогеназную активность растения и нитрогеназную активность на корнях растения в модельном опыте 43
2.3.6. Метод определения морфологических и физиолого-биохимических особенности отобранных культур 45
2.3.6.1. Метод диагностики способности образования 3-кетолактозы 46
2.3.6.2. Метод диагностики способности образования кислоты из глюкозы 47
2.3.6.3. Метод определения способности образования оксидазы 47
2.3.6.4. Метод наблюдения способности подкисления среды при использовании этанола 47
2.3.7. Метод определения филогенетического положения выделенных микроорганизмов 47
2.3.8. Определение влияния разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай растения в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы 48
2.3.9. Статическая обработка полученных данных 50
ГЛАВА 3. Изучение нитрогеназной активности накопительных культур и выделенных чистых культур 51
3.1. Изучение нитрогеназной активности накопительных культур 51
3.2. Изучение нитрогеназной активности чистых культур 53
ГЛАВА 4. Изучение ростового эффекта чистых ассоциативных азотфиксаторов 58
ГЛАВА 5. Изучение влияния чистых ассоциативных азотфиксаторов на нитрогеназную способность, рост и развитие огурца и разнолистной капусты в модельном опыте 64
5.1. Влияние чистых культур на растения огурца в модельных опытах 64
5.2. Влияние чистых культур на растения разнолистной капусты в модельных опытах 66
ГЛАВА 6. Морфологические, физиолого- биохимические особенности выделенных чистых ассоциативных азотфиксаторов 69
ГЛАВА 7. Определение филогенетического положения выделенных чистых ассоциативных азотфиксаторов 74
Глава 8. Изучение влияния разных штаммов agrobacterium tumefaciens на урожай огурца и разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы 77
8.1. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай огурца в мелкоделяночном опыте 78
8.1.1. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на рост огурца 78
8.1.2. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на нитрогеназную активность на корнях огурцы 80
8.1.3. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на содержание нитратов в плодах и общего азота в листьях огурца 82
8.2. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте 84
8.2.1. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на массу стебля и нитрогеназную активность на корнях разнолистной капусты после 2 недель выращивания 84
8.2.2. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай, содержание общего азота и нитратов в товарной продукции разнолистной капусты 85
Выводы 88
Библиографический список использованной
Литературы 90
- Этапы формирования бактериально-растительного ассоциативного взаимодействия
- Метод отбора проб корней, проведенный во Вьетнаме и получения накопительных культур
- Изучение нитрогеназной активности чистых культур
- Влияние чистых культур на растения разнолистной капусты в модельных опытах
Этапы формирования бактериально-растительного ассоциативного взаимодействия
Известно, что ассоциативные бактерии весьма активно проникают в органы высших растений (корни, листья, стебли). Это воздействие приводит к общему результату – ускоренный рост растений, повышение иммунитета, способности и устойчивости к стрессам. Следовательно, ассоциативные бактерии образуют с высшими растениями ассоциацию с положительным взаимодействием партнеров (Bais et al., 2006).
В бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии участвуют многие представители азотфиксирующих бактерий: Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, Pseudomonas, Erwinia и другие (Chelins Marisa et al., 2000; Егоров, 2003; Arkhipova et аl., 2004; Phm Bch Hin, Phm Vn Ton, 2003). Способность бактерий образовывать фитогормоны (в том числе ауксины, гиббереллины, цитокинины), а также витамины и другие биологические активные вещества является одним из важнейших факторов, определяющим функционирование бактериально-растительного ассоциативного комплекса (Мишке, 1988; Каменева и др., 1999; Емцев, 2001; Цавкелова и др., 2005). Среди ауксинов – индолил-3-уксусная кислота (ИУК) является фитогормоном, который синтезирует большинство ризобактерий (Costacurta et al., 1995; Каменева и др., 1999; Кацы, 2003; Yasmin et al., 2004; Leveau et al., 2005; Somers et al., 2005). К представителям ассоциативных бактерий, которые обладают способностью к синтезу ИУК, относятся бактерии родов Agrobacterium, Acetobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter и другие. Spaepens S. и соавторы (2007), а также и другие исследователи, изучали метаболизм и гены, обусловливающие синтез ИУК. Costacurta А. с соавторами (1995) выявили 5 путей биосинтеза ИУК, 4 из которых являются трептофанзавивимыми. Выявленные четыре пути биосинтеза осуществляются в условии наличия предшественника L-триптофана, выделяемого из экссудатов растений (Bais et al., 2006; Frankenberger, Arshad, 1995). Только один путь биосинтеза ИУК не связан с метаболизмом триптофана, хотя такие бактерии как азоспириллы могут осуществлять такой путь биосинтеза. Азоспириллы могут использовать одновременно несколько путей образования ИУК. Роль ИУК в бактериально-растельной ассоциации заключается в стимулировании деления клеток, дифференциации и растяжения клеток и тканей высших растений, однако главное действие – это ускорение ксилемо- и корнеобразования (Дефлинг, 1995; Цавкелова и др., 2005). Установлено, что некоторые бактерии способны разлагать фитогормоны, например, штаммы Рseudomonas putida расщепляют ИУК, что приводит к снятию ингибирующего действия на растения суперпродуцентов ИУК (Leveau, Lindow, 2005). В настоящее время найдены новые биологически активные вещества, которые являются летучими метаболитами, стимулирующими рост Arabidopsis thaliana. К этим соединениям относятся ацетон, 2,3-бутандиол, продуцируемые штаммами Bасillus subtilis и Bаcillus аmyloliquefaciens (Ryu et at., 2003). Подобный эффект летучих метаболитов на Arabidopsis thaliana был выявлен у штаммов Burkholderia cepacia и Staphylococcus epidermidis (Vespermann et al., 2007). Представитель ризобактерий, способный к синтезу цитокининов является Bac. subtilis, который оказывает эффективную стимуляцию на рост салата ( rkhipova et аl., 2004).
Следует особо отметить роль лектинов, представляющих собой углеводсодержащие белки, синтезируемые всеми живыми организмами и которые участвуют в межорганизменных взаимодействиях. В бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии бактериальные лектины участвуют в процессе колонизации корней (проникновении бактерий в корни), а также адгезии, стимулировании активности ферментов растений и оказывают ростовой эффект (Карпунина, 2005; Никитина и др., 2005). Например, лектины разных видов Azospirillum участвуют в адгезии бактерий к корням пшеницы и формируют азотфиксирующую ассоциацию.
Ассоциативные бактерии могут улучшать питание растений такими элементами, как азот, фосфор, калий. Большинство необходимых растениям соединений фосфора относится к минеральным и органическим нерастворимым солям, которые недоступны для растений (Mantelin, 2004). Как известно, ризосферные бактерии способны к растворению труднодоступных почвенных фосфатов, что положительно сказывается на фосфорном питании растений (Rodriguez, Fraga, 1999; Andres, 2009). Этот процесс осуществляется благодаря жизнедеятельности многих бактерий, которые подкисляют среду, например при утилизации сахаров образуются органические кислоты, в результате чего ризобактерии осуществляют растворение труднодоступных фосфатов. Учными были выделены гены, определяющие процесс расщепления органических соединеий фосфора под действием кислой фосфатазы и фитазы ферментов, а также гены, обусловивающие процесс растворения минеральных фосфатов (Rodriguez, Fraga, 1999).
Известно, что азот является одним из основных элементов, входящих в состав нуклеиновых кислот, белков, АТФ и других главных полимеров клеток живых организмов. Дефицит доступного азота в почве – один из основных факторов, лимитирующих рост и развитие растений. Биологическая азотфиксация – способность усваивать молекулярный азот атмосфера – уникальная способность прокариотов. Азотфиксация является процессом восстановления атмосферного азота до аммиака (Dixon, Kahn, 2004), которой становится доступным для растений. Нитрогеназа представляет собой ферментную систему, катализирующую реакцию азофиксации (Игнатов,1998). Известен ряд генов, которые обусловивают процессы синтеза и регулирования активности фермента нитрогеназы (Берцова и др., 2005; Задорина, 2008; Слободова, 2006), в том числе ген nifH кодирует один из основных компонентов в структуре нитрогеназного комплекса (Компонент - Fe-белок). Существуют общие принципы генетического контроля процесса азотфиксации для всех азотфиксирующих микроорганизмов (свободноживующие, ассоциативные, симбиотические) (Каменев, Муромец, 1999).
В бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии ризобактерии играют определнную роль в защите растений от негативных факторов и абиотических стрессов, особую роль в этих процессах играет этилен. Этилен в стрессовых реакциях представляет собой сигнальную молекулу и с помощью бактериальных ферментов (1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминаза) в растениях снижается содержание этилена (Белимов, 2008; Czarny et al., 2006). После адгезии и проникновения в растеие ассоциативные бактерии используют АЦК как источник питания, при этом следует снижение содержания АЦК, что приводит к биосинтезу этилена в корнях (Mantelin, Touraine, 2004; Czarny et al., 2006). Следовательно, уменьшается ингибирующий эффект этилена на развитие растения. После Glickа B. R. с соавторами (1994), в 2005 г. Belimov . с соавторами выявили ростовой эффект АЦК деаминазы при переносе гена (определяемым АЦК деаминазой) в штаммы с отсутствием этого фермента. В течение многих лет, ученые изучали способность ассоциативных бактерий к подавлению развития фитопатогенных микроорганизмов (Bais et al., 2006; Cheng et al., 2007; Bloemberg, Lugtenberg, 2001). Эта биоконтрольная функция у бактерий осуществляется за счет способности ассоцитивных бактерий улучшать жизненный статус растений – следовательно, повышается устойчивость растений к заболеванию. Кроме того, ассоциативные бактерии способны напрямую подавлять фитопатогены, так как имеет место конкуренция в эконишах за пищевые субстраты между ассоцитиваными бактериями и фитапатогенами, что приводит к вытеснению фитопатогенов из экониш (растение) (Cheng et al., 2007; Paulitz, Blanger, 2001). Также ассоциативные бактерии способны к выделению антифунгальных веществ (антибиотики, токсины, антигрибные метаболиты), ингибирующих рост фитопатогенов. Возможно, сигнальные молекулы зашитных реакций, направленные на обеспечивание устойчивости к фитопатогенам, представляют собой сидерофоры, бактериальные липополисахариды, салициловую кислоту и другие соединенич (Neilands, 1995). Показана способность синтеза сидерофор у рода Pseudomonas. Установлено, что с помощью сидерофор бактерии усваивают железо и образуют недоступные для фитопатагенов Fe-сидерофоные комплексы.
Метод отбора проб корней, проведенный во Вьетнаме и получения накопительных культур
Опыты по инокуляции растений выделенными бактериями проводили на партенокарпическом гибриде F1 огурца (Cucumis sativus) F1 Кассандра селекции Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А.Тимирязева и разнолистной капусте (Brassica integrifolia) сорта «VK 13» агрофирмы «Vinh Nng».
Огурец (Cucumis sativus) - однолетнее травянистое растение семейства Тыквенные (Cucurbitaceae), вегетационный период длится 45 – 72 дней, многочисленные боковые корни находятся преимущественно в верхнем слое почвы толщиной 20-25 см, распространяясь широко в стороны до 70 – 100 см. Партенокарпический гибрид F1 огурца F1 Кассандра раннеспелый – первые плоды достигают технической стадии зрелости менее чем через 45 дней после появления всходов. Товарная урожайность 21,3 кг/ м2. В среднем за вегетацию одно растение поглощает в день 0,1 – 0,2 г азота, 0,05 – 0,08 г фосфора, 0,2 – 0,4 г калия при урожайности 10 – 15 кг/м2. В теченеие 2 – 3 недель после появления всходов растения не требует усиленного питания: от начала цветения до образования завязей в растение поступает около 20% питательных веществ, а основная часть (70%) потребляется в период плодоношения. В первые 10 - 15 дней огурец больше нуждается в азоте, затем до начала цветения - в фосфоре, а во время плодоношения - в азоте и особенно калии (Портянкин, Шамшина, 2010).
Средние показатели выноса (г/кг продукты) азота при возделывании огурца в теплицах составляют 1,4 г/кг (Круг, 2000).
Капуста разнолистная из семейства капустные (Brassicaceae) -происходящая из Индии, Китая, и выращивается в Индии, Китае, и Вьетнаме, однолетнее растение, высотой 50-100 см, вегетационный период длится 20 -30 дней. Научная информация о разнолистной капусте очень ограничена.
Для анализа азотфиксирующих микроорганизмов ризопланы были отобраны образцы корней двух видов овощных культур из Вьетнама -Ipomoea aquatwa и Brasswa integnfolia. Профиль образцы почвы из Вьетнама: пах (0-20 см), черной окраски, комковатый, Bg (20-30 см) сизой окраски с рыжими прожилками, рНсол. - 6,4; рН вод. - 6,9; органическое вещество - 1,3%; подвижный калий - 123 мг/кг; подвижный фосфор - 48 %; аммонийный азот - 217 мг/кг; нитратный азот - 62 мг/кг.
Корни растений отмывали в стерильной воде, помещали во флаконы с безазотистой питательной средой Федорова-Калининской (Нетрусов и др., 2005) (г/л дистиллированной воды): К2НРО4 - 1,74; КН2РО4 -0,91; MgSO47Н20 - 0,3; NaCl - 0,5; СаС12-6Н20 - 0,1; FeСl3-6Н20 - 0,01. К ней добавляли (г/л): глюкозу - 10, дрожжевой автолизат - 0,1, и бромтимолблау раствор 0,5% спиртовой - 2 мл, инкубировали при температуре 25-28С. Затем культуры пересевали в пенициллиновых флакончиках (объем 15мл) с 5 мл полужидкой средой Федорова-Калининской с сахарозой или малатом и смесью витаминов (мкг/л): биотин – 10, рибофлавин – 200, витамин В12 – 2, тиамин, пиридоксин, пантотенат кальция, никотиновую и парааминобензойную кислоту – по 100. Инкубацию культур проводили при 28С в течение 2 недель. Всего было получено 36 накопительных культур.
Метод выделения чистых культур Из накопительных культур, показавших высокий уровень нитрогеназной активности, выделяли чистые культуры бактерий на средах DAS (Завалин и др., 2001) (следующего состава г/л: KH2PO4 - 0,4; K2HPO4 -0,1; MgSO4.7 H2O - 0,2; NaCl - 0,1; CaCl2.2 H2O - 0,02; FeCl3.6 H2O - 0,01; Na2MoO4. 2 H2O - 0,002; малат натрия - 2,5; сахара - 1,0; дрожжевой экстрат -1,0г; агар - 20,0; и 2 мл бротимолблау 0,5% спиртов раствор) и Эшби (Нетрусов и др., 2005) (следующего состава г/л: маннит - 20,0; KH2PO4 - 0,2; MgSO4.7 H2O - 0,2; NaCl - 0,2; K2SO4 - 0,1; CaCO3 - 5,0; агар - 20,0). Затем пересевали чистые культуры в пенициллиновые флакончики (объем 15 мл) с 5 мл полужидкой среды Федорова-Калининской с сахарозой и через неделю использовали для определения нитрогеназной активности. Параленно, для сохранения каждой чистой культуры для дальнейщего анализа, их пересевали в пробирки на скошенную среду DAS.
Активность фиксации азота определяли ацетиленовым методом (Звягинцев, 1991) с помощью газового хроматографа Chrom-4, на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова. Диазотрофные культуры выращивались в пенициллиновых флакончиках, закрытых ватными пробками. Перед измерением пробки заменяли на эластичные резиновые, прочно заворачивали в полиэтилен, добавляли во флакон 1 мл ацетилена, а затем инкубировали образцы сутки при 28C. Азотфиксирующую активность выражали в наномолях образовавшегося этилена за 1 час инкубации. Активность азотфиксации вычисляли по формуле: АФ = (наномоль С2Н/ ч), где 0,0067 - калибровочная коэффициента на этилен, S - площадь пика этилена (мВсек), V - объм воздуха в пенициллиновом флакончике, T -время инкубации с ацетиленом (час).
Метод определения ростактивирующего эффекта чистых культур Для выяснения ростактивирующего эффекта выделенных культур был проведен опыт с кресс-салатом. Повторность опытов трхкратная. Семена замачивали в течение 30 минут в суточной бактериальной культуре разной концентрации: разведение в 10, 100, 1000 раз; контроль - вода. После этого в чашках Петри на фильтровальную бумагу раскладывали по 20 обработанных семян и вносили 2 мл воды. Затем семена проращивали в термостате при 25С. Через 72 ч измеряли длину корешков и стебельков проростков.
Изучение нитрогеназной активности чистых культур
Влияние разных штаммов на урожай растений в мелкоделяночном опыте раскрывает способность этих штаммов к постоянному развитию и размножению в ризоплане овощных культур. Эта способность зависит от степени сохранения их исходных свойств: ростактивирующей способности, азотфиксации, а также зависит от способности к конкуренции с другими почвенными микробами и фитосанитарного эффекта.
Внедрение микробного удобрения, созданого на основе азотфиксирующих бактерий, проведенного во Вьетнаме, способствовало увеличению урожая риса на 6 – 12 %; арахиса 15 – 20 %, и уменьшению содержания NO3- в товарной продукции (Nguyn Kim V, 1995). При инокуляции Azospirillum, общее содержание азота в урожае повышается на 20 – 60 % и более (Avivi, 1982; Kapulnik, 1983; Okon, 1985). К сожалению, увеличение урожайности растений обусловивается способностью сохраниять положительные исходные свойства азотфиксирующих штаммов в ассоциации с растениями, даже в случае удачного сочетания микробный штамм – сорт растения (Dobereiner, 1977; Okon, 1986). Кроме того, влияние ассоциативных диазотрофов на растении зависит от фаз развития растения. Например, биопрепарат Агрофор, на основе Agrobacterium radiobacter 57/136 рекомендуется применять для стимуляции роста растений на ранних этапах развития.. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай огурца в мелкоделяночном опыте
Для мелкоделяночного опыта с огурцом (рис. 35) были отобраны штаммы С7, C19, C22, С43, F12, а для разнолистной капусты (рис. 40) – C19, C22, E17, F12, J26, поскольку данные штаммы показали наибольшую эффективность в модельных опытах на стерильном субстрате.
Измерение биометрических показателей через две недели после закладки мелкоделяночного опыта с огурцом (рис. 27, 28) показало, что длина стебля была выше у инокулированных растений только в двух вариантах (F12 и С43). В этих же вариантах (С43 и F12) был отмечен прирост массы побегов растения по сравнению с контролем на 13,4 и 15,0 %. Инокуляция штаммом С22 привела к замедлению роста стебля и снижению биомассы по сравнению с контролем. Рисунок 28. Влияние штаммов Agrobacterium tumefaciens на массу растения огурца через 2 недели после посадки, г/растение На пятой неделе вегетации, длины стеблей растений у всех вариантов с инокуляцией не отличались от контроля (рис. 31), хотя в варианте с инокуляцией штаммом F12 были, как и в первый срок наблюдений, отмечены самые высокие значения длины и массы стебля (рис. 29, 30). Эти отличия были связаны исключительно с развитием растений в первые недели жизни.
Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на нитрогеназную активность на корнях огурца Изучение нитрогеназной активности на корнях огурца после 2 и 5 недель опыта, не наблюдалось корреляции. Более того, также между нитрогеназной активностью на корнях огурца после 2 недель выращивании и массой стебля огурца по результатам того же периода, корреляции не обнаруживается. Мы объясняем это тем что, в отличие от модельного опыта, на нитрогеназную активность на корнях растений, выращиваемах в производственных условиях в защищенном грунте, оказывает влияние микрофлора грунта в теплице (рисунок 32). Растения на разных стадиях развития предъявляют неодинаковые требования к условиям среды. Что касается огурца, то в течение 2-3 недель после появления всходов он не требует усиленного питания: от начала цветения до образования завязей в растение поступает около 20% питательных веществ, а основная часть (70%) потребляется в период плодоношения.
Определение содержания общего азота в листьях инокулированных и контрольных растений в период плодоношения показало, что все испытанные штаммы в той или иной степени оказывали положительное влияние на азотное питание растений. Штаммы F12 и C7 давали наиболее существенное повышение содержания общего азота в листьях огурца (рис. 33). Например, содержание общего азота в листьях растений, инокулированных этими штаммами, в среднем было на 0,42–0,57% выше, чем в контроле (прирост от 26,6 до 35,9% относительно контроля), что свидетельствует о более благоприятном режиме азотного питания в этом случае. Содержание нитратов в зеленцах оставалось в пределах допустимой нормы (меньше 400 мг/кг) (приложение 3).
Влияние чистых культур на растения разнолистной капусты в модельных опытах
Однако, зависимости между активностью азотфиксации бактерий в ассоциации с растениями огурца и увеличением массы стебля растений после 20 дней выращивания выявлено не было. Но через 20 дней (40 дней выращивания) было отмечено возрастание азотфикцирующей способности на корнях огурца, которое тесно коррелировло с увеличением массы стебля (коэффициент корреляции г = 0,9; tr = 9, 67 t05). В условиях модельного опыта, инокуляция следующими изолятами оказывает хорошее влияние на массу стебля огурца: C43 (150% от контроля), F12 (168% от контроля), С22 (179% от контроля), С7 (180% от контроля), С19 (186% от контроля) (Приложение 2). При инокуляции этих изолятов стимулирующий эффект заметен визуально (рис. 17). Эти изоляты были отобраны для мелкоделяночного опыта с огурцом.
Между активностью азотфиксации на корнях растений и массой стебля после 40 дней выращивания наблюдается слабая корреляция (r = 0,45; tr = 2,37 t05) (рис. 18). Наибольшее увеличение массы стебля растений огурца было отмечено в вариантах с инокуляцией чистыми культурами: J26 (113% от контроля), E17 (146% от контроля), С19 (165% от контроля), С22 (167% от контроля) и F12 (177% от контроля). Эти чистые культуры были выбраны для проведения мелкоделяночного опыта с разнолистной капустой. Рисунок 18. Активность азотфиксации растений разнолистной капусты после
Таким образом, в условиях модельного опыта на стерильном субстрате, инокуляция растений изучемыми бактериями оказывает положительное влияние на рост и развитие, как огурца, так и разноличтной капусты. Лучшие показатели были отмечены в вариантах с инокуляцией штаммами С19 в опыте с разнолистной капустой (увеличение биомассы надземной части растений на 186% от контроля) и F12 в опыте с огурцом (177% от контроля).
Для дальнейших исследований были отобраны следующие изоляты: C43, C7, C22, C19, F12 для мелкоделяночного опыта с огурцом, и J26, E17, C19, C22, F12 для мелкоделяночного опыта с разнолистной капустой (приложение 2). Параллельно с этим, мы изучали морфологические, физиолого биохимические особенности, и филогенетическое положение отобранных чистых кульур
Исследование физиолого-биохимических особенностей чистых культур в сочетании с характеристикой морфологии бактерии иногда позволяет установить их принадлежность к тому или иному таксону (классу, порядку, семейству) (Нетрусов и др., 2005). В результате, из 227 чистых культур ассоциативных азотфиксирующих бактерий, выделенных из ризопланы тропических овощных культур Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia, нами были отобраны 7 штаммов, которые характеризуются наиболее высокой нитрогеназной активностью как на питательных средах, так и в ассоциации с растениями, а также оказывают стимулирующее влияние на культурные растения в модельных опытах. Было определено таксономическое положение данных организмов по морфологическим и физиолого-биохимическим особенностям (табл. 6, рис. 20-25).
Форма колонии на среде DAS Круглая сваликомпо краю,выпуклаяи гладкая,непигментированная Концентри ческая, выпуклая и гладкая, непигмент ированная Круглая с валиком по краю, выпуклая и гладкая, непигмен тированн ая Концентр ическая, выпуклая и гладкая, непигмен тированн ая Концентр ическая, выпуклая и гладкая, непигмен тированн ая Круглая сваликомпо краю,выпуклаяи гладкая,непигментированная. Круглаясваликомпокраю,выпуклая игладкая,непигментированная.
Окраска по Граму - - - - - - Форма клеток Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Рисунок 20. Колония штамма С43, выделенного из ризопланы Ipomoea aquatica (среда DAS)
Все исследованные штаммы показали способность к образованию 3-кетолактозы при росте на лактозе, что характерно исключительно для A. tumefaciens и A. radiobacter (Герхардт et al., 1984). Отнесение штамма к одному из этих видов осуществляется исключительно по признаку фитопатогенности, в остальном они идентичны (Хоулт et al., 1997; Г. Спайнк et al., 2002). Однако, как уже отмечалось, данный признак связан с наличием или отсутствием Ti-плазмиды и поэтому не может рассматриваться как видоопределяющий. Поскольку ДНК типовых штаммов A. tumefaciens и A. radiobacter проявляют высокую степень гомологии, их можно рассматривать как один вид (Спайнк et al., 2002).
Для указанных выше семи штаммов было определено филогенетическое положение на основании секвенирования гена 16S рРНК. Было показано, что все они принадлежат к семейству Rhizobiaceae филогенетической группы Alphaproteobacteria. При этом наиболее близкой (99,8% гомологий) к полученным последовательностям гена 16S рРНК была аналогичная последовательность типового штамма представителя рода Agrobacterium – A. tumefaciens. Для определения точной филогенетической позиции исследуемых штаммов внутри семейства Rhizobiaceae, и его родства с A. tumefaciens были использованы доступные из базы данных GenBank последовательности представителей других родов семейства Rhizobiaceae. Последовательности гена 16S рРНК изучаемых штаммов оказались практически идентичными (99,8% гомологий) с последовательностью типового штамма A. tumefaciens (рис. 26). Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 1 нуклеотидной замене на каждые 10 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью bootstrap – анализа 1000 альтернативных деревьев.
Таким образом, выделенные нами штаммы являются представителями вида Agrobacterium tumefaciens, который хорошо известен как фитопатоген. К настоящему времени известно (Kanvinde L., Sastry G.R.K., 1990), что A. tumefaciens может фиксировать азот в свободном состоянии, расти на безазотистой среде, восстанавливать ацетилен до этилена и включать в состав биомассы 15N2. Как и для большинства других, хорошо охарактеризованных диазотрофных бактерий, присутствие NH4+ в среде и аэробные условия подавляют фиксацию азота A. tumefaciens. Нитрогеназная система содержит молибден. Некоторые особенности фиксации азота у А. tumefaciens напоминают другие хорошо изученные диазотрофные бактерии, такие как Klebsiella pneumonia (Robert, Brill, 1981). Последовательности ДНК структурных генов, ответственных за нитрогеназу (nifH, nifD, и nifK) высоко консервативны (Ruvkun, Ausubel, 1980).
Таким образом, филогенетические особенности и физиолого-биохимические тесты изученных культур, в частности образование 3-кетолактозы, дают нам основание утверждать, что изученные штаммы относятся к Agrobacterium tumefaciens. Надо полагать, что при отсутствии или повреждении Ti-плазмиды A. tumefaciens не может вызывать заражение растений но, как свидетельствуют наши данные, оказывает положительное воздействие на растения в ассоциации с ней. Помимо снабжения растений азотом и синтеза ростактивирующих веществ, можно ожидать, что данные штаммы конкурируют с патогенными за одни и те же сайты связывания, защищая таким образом растение от болезнетворных агентов.