Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 15
1.1 Инфекционные заболевания, вызываемые грамположительными бактериями 15
1.1.1 Золотистый стафилококк S. aureus 16
1.1.2 Характеристика ротовой микрофлоры 17
1.1.3 Особенности бактерий Bacillus cereus 19
1.2 Антибиотикотерапия инфекций, вызываемых грамположительными бактериями 22
1.3 Влияние антибиотиков на вирулентность S. aureus 23
1.3.1 Подавление белкового синтеза в клетках 24
1.3.2 Нарушение синтеза клеточной стенки 25
1.3.3 SOS-ответ 25
1.3.4 Глобальные регуляторы вирулентности 26
1.4 Бактериальные биопленки и их структура 28
1.4.1 Образование биопленок бактериями вида S. aureus 33
1.4.2 Формирование биопленок как фактор вирулентности 34
1.5 Устойчивость биопленок к антибиотикотерапии 35
1.6 Производные фуранонов как антибактериальные соединения 36
Заключение 38
Экспериментальная часть 39
2 Материалы и методы исследования 39
2.1 Исследуемые соединения 39
2.2 Методы работы с бактериальными клетками 40
2.2.1 Штаммы 40
2.2.2 Питательные среды 40
2.2.3 Культивирование бактерий 41
2.2.4 Определение количества КОЕ 41
2.2.5 Определение минимальной подавляющей (МПК) и минимальной бактерицидной концентраций (МБК) 42
2.2.6 Окрашивание биопленки генциановым фиолетовым 42
2.2.7 Оценка антимикробных агентов на способность к эрадикации сформированных бактериальных биопленок 43
2.2.8 Анализ кривой эрадикации от времени (Time-kill assay) 43
2.2.9 Анализ антимикробного эффекта при комбинированном применении антимикробных агентов (метод шахматной доски, den Hollander, 1998) 44
2.2.10 Оценка развития устойчивости 45
2.2.10.1 Получение устойчивых штаммов на чашках с градиентным агаром 45
2.2.10.2 Получение устойчивых штаммов на жидкой питательной среде в планшетах 45
2.3 Работа с эукариотическими клетками 46
2.3.1 Линии клеток 46
2.3.2 Условия культивирования 46
2.3.3 Оценка митохондриальной активности 46
2.3.4 Оценка повреждения плазматической мембраны 47
2.4 Микроскопия 47
2.4.1 Световая микроскопия 47
2.4.2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) 47
2.4.3 Атомно-силовая микроскопия (АСМ) 48
2.5 Методы работы с белками 48
2.5.1 Электрофорез белков в нативных условиях 48
2.5.2 Окрашивание полиакриламидных гелей нитратом серебра 49
2.5.3 Идентификация белков-субстратов для соединения Ф105 49
2.6 Аналитические методы 50
2.6.1 Оценка внутриклеточного уровня активных форм кислорода 50
2.6.2 Оценка мембранного потенциала 50
2.6.3 Определение активности глутаминсинтетазы 50
2.6.4 Математическая обработка данных и биоинформатика 51
3 Результаты исследований 52
3.1 Биологическая активность производных 2(5H)-фуранона 52
3.2 Антимикробная активность производного 2(5Н)-фуранона Ф105 в отношении S. aureus 57
3.2.1 Действие производного 2(5Н)-фуранона Ф105 против биопленок S. aureus 57
3.2.2 Синергизм производного 2(5Н)-фуранона Ф105 с различными антибиотиками в отношении S. aureus 60
3.2.3 Механизм антимикробного действия производного 2(5Н)-фуранона Ф105
3.2.3.1 Проникновение аналога Ф105 в бактериальные клетки 63
3.2.3.2 Проникновение аналога Ф105 в биопленку S. aureus 65
3.2.3.3 Индукция Ф105 активных форм кислорода (АФК) 66
3.2.3.4 Влияние Ф105 на мембранный потенциал 67
3.2.3.5 Влияние Ф105 на целостность клеток S. aureus 68
3.2.3.6 Ф105 неспецифично взаимодействует с рядом внутриклеточных белков S. aureus 69
3.3 Антимикробная активность производного 2(5H)-фуранона Ф131 (структурного аналога Ф105) в отношении ротовой микрофлоры 76
3.3.1 Исследование антимикробного действия соединения Ф131 при комбинировании с антибиотиками в отношении Streptococcus spp 80
3.4 Антимикробная активность производного 2(5H)-фуранона Ф123 в отношении B. cereus 83
3.4.1 Синергетический эффект производного 2(5H)-фуранона Ф123 в сочетании с другими антимикробными веществами в отношении B. cereus 85
3.4.2 Оценка развития устойчивости B. cereus к производному 2(5Н)-фуранона Ф123 86
3.4.3 Влияние производного 2(5Н)-фуранона Ф123 на биопленки B. cereus 87
4 Обсуждение результатов 90
Заключение 101
Благодарности 103
Список использованных источников 104
- Бактериальные биопленки и их структура
- Биологическая активность производных 2(5H)-фуранона
- Ф105 неспецифично взаимодействует с рядом внутриклеточных белков S. aureus
- Обсуждение результатов
Бактериальные биопленки и их структура
Формирование бактериальных биопленок настолько широко распространено, что почти у каждого вида микроорганизмов есть определенные механизмы, с помощью которых они могут адгезировать к поверхностям и друг к другу. Бактериальные биопленки можно охарактеризовать как сообщество бактериальных клеток, адгезированных на какой-либо поверхности и при этом находящихся под защитной оболочкой, называемой матриксом. В состав матрикса бактериальной биопленки входят различные внеклеточные полимеры [Donlan, 2002], такие как полисахариды, полипептиды и ДНК. Бактериальные биопленки можно четко отличить от свободноплавающих бактерий благодаря их тесному межклеточному взаимодействию, которое включает в себя и физические, и социальные аспекты. Таким образом, представляется невозможным экстраполирование на бактериальные биопленки данных, полученных в ходе исследований, проведенных на свободноплавающих планктонных клетках [Konopka, 2009]. Форма биопленки представляют собой один из наиболее успешных и используемых на Земле способов жизни [Stoodley et. al., 2002], при этом они обеспечивают различные циклические биогеохимические процессы большого количества элементов из таких сред, как почва, вода, осадки и горные породы [Meckenstock et. al., 2015]. С помощью биопленок осуществляются такие биотехнологические процессы, как фильтрация воды, утилизация твердых отходов и сточных вод. Более того, биопленки имеют важное значение при проведении различных процессов биокатализа, массовом производстве химикатов и биотоплива [Halan et. al., 2012]. Человек, как и все другие высшие организмы, колонизированы бактериями, способными образовывать биопленки, которые также могут ассоциироваться с инфекциями, и с заражением медицинских имплантатов и приборов [Shirtliff и Leid, 2009]. С образованием биопленок связано загрязнение технической воды и биообрастание водопроводных труб, которое приводит к снижению качества питьевой воды [Wingender et. al., 2011] и последующей микробиологической коррозии [Little и Lee, 2014].
Биопленки, зачастую состоящие из большого числа видов, образуют сложную биологическую систему с большой плотностью клеток, составляющей от 100 миллионов до 100 миллиардов на один грамм сырой культуры [Balzer et. al., 2010]. Другая особенность биопленок заключается в том, что бактериальные клетки в их составе способны дифференцироваться [Singer et. al., 2010]. Повышенная скорость генетического обмена и повышенная устойчивость к антимикробным препаратам обеспечивается за счет синтеза внешнего полисахаридного матрикса, который защищает клетки биопленки от внешних факторов. Такая биопленка в основном представлена полисахаридами, липидами, белками и внеклеточными нуклеиновыми кислотами, и представляет собой основополагающий фактор для развития физических и социальных взаимодействий [Flemming и Wingender, 2010]. Образование матрикса биопленки – это динамический процесс, зависящий как от наличия питательных элементов, так и от образования и секреции продуктов матрикса наружу, стрессовых факторов, а также межвидовой конкуренции. Очевидно, что образование матрикса требует значительных энергетических затрат [Saville et. al., 2011]; однако эти издержки затем обеспечивают выгодные условия для бактерий, находящихся в биопленке, ввиду физико-химических и структурных особенностей матрикса. Матрикс играет роль посредника между бактериями, находящимися в биопленке и внешней средой, и определяет ключевые процессы как внутри биопленки, так и процессы взаимодействия со внешней средой.
Гидратированный экзополисахарид, а не микробные клетки составляет большую часть биомассы бактериальной биопленки. Межмолекулярные взаимодействия между компонентами экзополисахарида представляют основу для самоорганизации молекул экзополисахарида в матриксе, а также определяют, как механические свойства матрикса, так и физиологическую активность микроорганизмов внутри биопленки [Flemming and Wingender, 2010]. Молекулы экзополисахарида определяют характер формирования биопленки, представляющий собой динамический процесс [Neu and Lawrence, 2014]. В недавнем исследовании был продемонстрирован изящный эксперимент, описывающий организацию микробных кластеров в биопленках кишечной палочки, имеющих сложную надклеточную архитектуру, отвечающую за пространственные и физиологические дифференциации. Оказалось, что биопленки E. coli имеют плотность заряда, которая зависит от высоты и изменяется с течением временем [Birjiniuk et. al., 2014]. Кроме того, для того чтобы обеспечить механическую стабильность бактериальной биопленки, молекулы экзополисахарида заполняют область между клетками, непосредственно определяя условия жизни клеток и окружающую среду [Persat et. al., 2005].
В структуре бактериальной биопленки особый интерес представляют внеклеточные нуклеиновые кислоты. Так, например, катионный экзополисахарид Pel связывает внеклеточные нуклеиновые кислоты в биопленках синегнойной палочки [Jennings et. al., 2005], что придает матриксу свойство структурной целостности. Также, известно, что ДНК-связывающие белки BII позволяют кишечной палочке формировать уропатогенные биопленки за счет стабилизации вторичной структуры ДНК, находящейся вне клетки [Devaraj et. al., 2015]. Кроме того, оказалось, что внеклеточные молекулы ДНК способны обеспечивать стабильную структуру нитевидных сетей биопленок некоторых бактерий, обитающих в воде [Bockelmann et. al., 2006]. До 97 % матрикса бактериальной биопленки составляет вода, в которой содержатся функциональные и структурные компоненты матрикса: полисахариды, внеклеточные нуклеиновые кислоты и белки, а также другие нерастворимые компоненты (целлюлоза, амилоиды, фимбрии, жгутики и пили). Не так давно были обнаружены, разветвления пор и каналов между микроколониями биопленки, образующие пустоты в матриксе [Karimi et. al., 2015], что таким образом обеспечивало транспорт жидкости в пределах биопленки [Wilking et. al., 2013], напоминая тем самым «упрощенную системы кровообращения» в масштабах бактериальной биопленки [Patel, 2005]. Некоторые структурные компоненты матрикса могут выполнять и другие, полезные бактериальной биопленке функции. Например, в биопленке кишечной палочки основным структурным компонентом матрикса является белок карлин, который при участии целлюлозы обеспечивает устойчивость от высыхания биопленки. Сенная палочка B. subtilis имеет белки, которые называются гидрофобины, и играют ключевую роль в образовании высокогидрофобной биопленки, которая формируется на границе жидкости с воздухом [Hobley et. al., 2015]. Из других функциональных компонентов матрикса бактериальной биопленки значительный интерес представляют белковые филаменты и наноканалы, обеспечивающие перенос электронов [Lovley and Malvankar, 2015]. Для детального изучения электрохимических свойств бактериальных биопленок все чаще используются биофизические методы, включая реологические и электрохимические методы [Koch et. al., 2015]. В биопленках, образованных синегнойной палочкой, экзополисахаридный матрикс организуется жидкокристаллическим образом за счет энтропийных взаимодействий между полимерами, что заметно усиливает вязкость биопленки. Грамотрицательные бактерии имеют ферменты, упакованные во внеклеточные мембранные везикулы, которые способны изменять потенциал деградации матрикса биопленки.
Таким образом, матрикс бактериальной биопленки представляет собой не бесформенную гелеобразную структуру, которая содержит полисахариды, протеины и нуклеиновые кислоты. Матрикс биопленки является гетерогенным, упорядоченным комплексом, включающим в себя широкий набор биополимеров, которые способствуют ее функционированию и дающим определенные свойства [Hobley et. al., 2015]. Отдельные зоны биопленки, имеющие более низкую вязкость, представляют собой своеобразные тоннели и позволяют микроорганизмам перемещаться по матриксу [Billings et. al., 2015]. Например, субпопуляция подвижных свободноплавающих клеток B. thuringiensis способна передвигаться по таким тоннелям глубоко в матрикс биопленки на довольно высокой скорости, которая может составлять до 20 мкм/с. Показано, что частичное разрушение матрикса биопленки может приводить к активному рассеиванию бактериальной биопленки [Petrova and Sauer, 2016]. Таким образом, высокоорганизованный матрикс биопленки не представляет собой конечную форму организации бактериальной биопленки, он способен к постоянной реконструкции. Такая способность к быстрой реорганизации биопленки дает возможность бактериям отвечать на изменения окружающей среды. В процесс реконструкции вовлечен ряд специфических ферментов, которые деградируют и реконструируют бактериальную биопленку, что с одной стороны ведет к разрушению, а с другой – к распространению биопленки в другие области, где они затем могут реколонизировать новые поверхности [Whitfield et. al., 2015].
Устойчивость к высыханию представляет собой важное свойство для бактериальных биопленок, поскольку в условиях окружающей среды микроорганизмы часто подвергаются обезвоживанию. Бактерии, находящиеся в биопленке, способны активно реагировать на обезвоживание с помощью синтеза специальных молекул, защищающих биопленку от высыхания из-за высокой доли насыщенных водой полимеров в матриксе экзоолисахарида, имитируя гидрогель, сохраняющий в биопленке воду. Также биопленки могут противостоять высыханию путем образования тонкой пленки в верхних слоях экзополисахарида, представляющей собой эффективный испарительный барьер [Flemming, 2011]. Исследования бактериальных биопленок, выделенных из подземных вод, продемонстрировали восстановление ферментативной активности высохших образцов после возвращения влажных условий окружающей среды [Weaver et. al., 2015]. Таким образом, бактерии, находящиеся в матриксе биопленки имеют гораздо лучшие протекторные свойства от потенциального высыхания, в отличии от свободноплавающих планктонных клеток, не обладающих матриксом экзополисахарида. Бактериальные клетки в матриксе биопленки обладают способностью к дифференцировке, повышенной скоростью генетического обмена между клетками, а также повышенной устойчивостью к противомикробным агентам за счет производства внешнего полисахаридного матрикса. Экзополисахарид обеспечивает механическую устойчивость биопленки, а нуклеиновые кислоты способны поддерживать стабильную структуру нитевидных сетей биопленок. Бактериальные биопленки могут обеспечивать транспорт, образуя своеобразные тоннели, что позволяет микроорганизмам перемещаться по матриксу с высокой скоростью. При этом, высокоорганизованный матрикс биопленки не представляет собой конечную форму организации бактериальной биопленки, он способен к постоянной реконструкции, что дает бактериям возможность быстро реагировать на изменения окружающей среды.
Биологическая активность производных 2(5H)-фуранона
Среди различных соединений, проявляющих антимикробную и анти-биопленочную активность, в последние два десятилетия интенсивно изучаются производные 2(5//)-фуранона. В некоторых исследованиях сообщалось о способности синтетических фуранонов подавлять образование биопленок различных бактерий [Hentzer et al, 2002; Lonn-Stensrud et al, 2009; Ren et al, 2001; Trizna et al, 2015].
В ходе данной работы производные 2(5//)-фуранона, содержащие в своей структуре различные функциональные группы (атом галогена, сульфанильная или сульфонильная группа, фрагменты терпенов /-ментола или /-борнеола, см. Рисунок 5), были изучены на их способность подавлять рост различных бактерий (Таблица 1).
В ходе углубленного исследования антибактериальной активности производного 2(5//)-фуранона с условным названием Ф105, была установлена антимикробная активность в отношении всех исследованных грамположительных бактерий. При этом структурные аналоги соединения Ф105, не содержащие в своем составе /-ментоловый фрагмент Ф70 (3-хлор-5-гидрокси-4-[(4-метилфенилсульфонил)]-2(5//)-фуранон) или сульфонильную группу Ф104 (3-хлор-5(Л)-[(1/?,2 ,5/?)-2-изопропил-5 метилциклогексилокси]-4-[(4-метилфенил)сульфанил]-2(5//)-фуранон) [Kayumov et al, 2015; Latypova et al, 2014], не проявляли активности в отношении S. aureus, что свидетельствовало о необходимости обеих функциональных групп для проявления бактерицидной активности. Производное 2(//)-фуранона Ф131, отличающееся от соединения Ф105 наличием /-борнеоловой группы вместо /-ментоловой, продемонстрировало более выраженную антимикробную эффективность в отношении S. mutans, представителя ротовой микрофлоры. Соединения, имеющие в своем составе только галогеновые и терпеновые фрагменты (Ф123 и Ф125), проявляли антимикробную активность в отношении грамположительных бактерий, однако бактерицидный эффект наблюдался только для соединения Ф123, и только на клетках В. cereus, подтверждая ключевую роль ;г-толилсульфонильной группы в бактерицидной активности Ф105 в отношении золотистого стафилококка. Примечательно, что соединения Ф123 и Ф125, содержащие в своем составе по два атома хлора, проявляли относительно высокую активность против грамположительных бактерий, сходную с активностью Ф105.
В ходе дальнейших исследований было установлено, что Ф123 имеет минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) 8 мкг/мл против B. cereus, в то время как МБК соединения в отношении других видов бактерий составляет более 128 мкг/мл, что указывает на высокую специфичность Ф123 в отношении B. cereus. Примечательно, что все исследуемые соединения не обладали антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий.
В результате проведенного анализа антимикробной активности можно констатировать факт, что соединения Ф105 и Ф131 проявляют активность в отношении всех исследованных грамположительных бактерий, однако демонстрируют специфичность в отношении S. aureus и S. mutans, соответственно. Соединение Ф123 оказалось эффективным в отношении почти всех исследуемых грамположительных бактерий за исключением S. mutans, однако при этом проявляет селективное бактерицидное действие в отношении B. cereus. МБК данных соединений превышала МПК не более чем в 4 раза (Таблица 2), что указывает на бактерицидный характер действия данных соединений. Для отобранных соединений были определены значения цитотоксичности СС50, приводящие к двукратному снижению целостности мембраны и митахондриальной активности эукариотических клеток.
Значения СС50 при оценке целостности плазматической мембраны составили 45 мкг/мл для Ф105, 60 мкг/мл для Ф123 и 64 мкг/мл для Ф131 (Таблица 3). Использующийся в качестве препарата сравнения бензалкония хлорид (БХ), использующийся только при наружном применении, имел значение СС50 2 мкг/мл, что связано с его прямым повреждением мембраны клеток, что ведет к высвобождению аденилат киназы, ключевого фермента метаболизма, являющегося индикатором жизнеспособности. Второй метод определения цитотоксичности (CellTiter-Blue Cell Viability Assay, Promega) показал снижение митохондриальной активности для всех производных 2(5Н)-фуранонов. Значения СС50 составили 21 мкг/мл для Ф105, 34 мкг/мл для Ф123 и 40 мкг/мл для Ф131, тогда как для БХ значение СС50 составило 5 мкг/мл. Скорее всего, это связано с тем, что действие производных 2(5Н)-фуранонов в первую очередь направлено на метаболизм клетки, тогда как БХ действует на цитоплазматическую мембрану.
Таким образом, были отобраны соединения Ф105, Ф123 и Ф131, продемонстрировавшие наибольшую антибактериальную активность в отношении S. aureus, B. cereus и S. mutans, соответственно. Однако с учетом их относительно высокой цитотоксичности данные соединения представляют интерес только для наружного применения.
Ф105 неспецифично взаимодействует с рядом внутриклеточных белков S. aureus
Лишь в нескольких исследованиях сообщалось о молекулярных мишенях производных 2(5H)-фуранона у грамположительных бактерий [Lonn-Stensrud et al., 2009; Zang et al., 2009; Kayumov et al., 2015]. Чтобы охарактеризовать механизм антибактериальной активности, анализировались изменения в протеоме S. aureus, вызванные действием соединения Ф105. Для этого бактериальные клетки выращивали с качанием в течение 24 ч при 37 С в присутствии соединения Ф105 в концентрации суб-МПК, после чего клетки центрифугировали и промывали PBS. Неочищенные экстракты из обработанных и необработанных клеток окрашивали флуоресцентными красителями Cy5 и Cy3 соответственно, после чего разделяли с помощью 2D-электрофореза. Преимущественное присутствие на геле зеленых точек (Рисунок 17) свидетельствовало о подавлении экспрессии значительного количества белков в клетках при выращивании в присутствии сублетальных концентраций соединения Ф105. Точки, окрашенные в зеленый цвет (белки, которые присутствуют только в контрольных клетках), и пятна, окрашенные в красный цвет (белки, экспрессируемые в ответ на обработку соединением Ф105), вырезали и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии, сопряженной с жидкостным хроматографом. Среди белков с повышенным количеством содержания в клетках, было идентифицировано 7 белков (Таблица 8). Идентифицированные полипептиды относились к ключевым белкам различных клеточных процессах, от синтеза ДНК до ответа на клеточный стресс, но не принадлежали к какому-либо конкретному биохимическому пути. Сходным образом, белки с повышенным содержанием в клетке (Таблица 9) также не принадлежали ни к одной отдельной группе, что свидетельствует о неспецифическом взаимодействии соединения Ф105 с клеточными белками.
Предполагается, что отрицательно заряженная сульфонильная группа соединения Ф105 взаимодействует с положительно заряженными аминокислотами белков. В этом случае можно ожидать изменения как заряда, так и конформации белка и, как следствие, изменения его электрофоретической подвижности в геле в нативных условиях. Для оценки способности соединения Ф105 взаимодействовать с белками, клеточный экстракт S. aureus обрабатывали Ф105 (64 мкг/мл) в течение 1 часа при 37 C, после чего с помощью двумерного электрофореза сравнивали его электрофоретическую подвижность с протеомом необработанного экстракта (Рисунок 18). Как и в экспериментах in vivo, здесь также был идентифицирован ряд белковых пятен с зеленой и красной флуоресценцией. Этот факт позволяет предположить, что соединение Ф105 взаимодействует с некоторыми белками, что приводит к изменениям их зарядов и подвижности в геле, поскольку разделение белков в геле также зависит от заряда белка.
Белковые точки, окрашенные в зеленый и красный цвета, также были выделены и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (Таблица 10). Интересно, что пять белков, включая енолазу, молекулярный шаперон GroEL, инозин-5-монофосфатдегидрогеназу, тиоредоксинредуктазу и альфа-кетокислотную дегидрогеназу с разветвленной цепью, были идентифицированы также in vivo (Таблица 9), что позволяет предположить, что соединение Ф105 преимущественно взаимодействуют с этими белками. Для того, чтобы охарактеризовать свойства предполагаемых белков-субстратов для Ф105, некоторые биохимические характеристики белков с измененной подвижностью, идентифицированные как in vivo, так и in vitro, были предсказаны in silico и сравнены с транслированным протеомом S. aureus (Рисунок 19). Было обнаружено, что большинство белков, идентифицированных как предполагаемые субстраты для Ф105, демонстрируют значения pI в диапазоне от 5 до 6 и слегка отрицательный заряд при физиологическом значении pH.
Чтобы проверить предположение о том, что соединение Ф105 может напрямую взаимодействовать с белками, ряд белков обрабатывали соединением Ф105 и разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в нативных условиях по сравнению с необработанными образцами (Рисунок 20). Значительные изменения в подвижности белков, обработанных соединением Ф105, были обнаружены для глутаминсинтетазы из Bacillus subtilis и малого белка теплового шока IbpA из Acholeplasma laylawii. Измененение электрофоретической подвижности также наблюдалось для ДНКазы и БСА. Эти данные согласуются с предыдущим наблюдением о том, что Ф105 способен взаимодействовать с белками и, по-видимому, повреждает их структурные или физико-химические свойства, что в свою очередь может приводить к последующей гибели клеток. Однако замер активности глутаминсинтетазы, обработанной Ф105, не выявил различий в уровне активности. Вероятно, в данном случае Ф105 не затрагивал активного центра фермента. Таким образом, общий механизм антимикробного действия производного 2(5Н)-фуранона Ф105, очевидно, связан с его способностью легко проникать в бактериальные клетки грамположительных бактерий, вызывать окислительный стресс благодаря индукции образования продукции АФК и, взаимодействуя, с некоторыми белками, вероятно, нарушать их функцию. В результате, наблюдается нарушение мембранного потенциала бактериальных клеток и их последующая гибель.
Исследование развития устойчивости к соединению Ф105 выявило, что изменения чувствительности S. aureus к соединению Ф105 не наблюдалось (Рисунок 21), что является несомненным преимуществом этого соединения, в то время как значение МПК бензалкония хлорида увеличилось с 1 мкг/мл до 4 мкг/мл и более того, после семи пассажей в отсутствие антимикробного вещества в среде, его МПК не снижалось.
Обсуждение результатов
Растущий уровень антибиотикорезистентности среди бактерий требует интенсивной разработки новых антимикробных препаратов. Более того, способность образовывать биопленки также снижает эффективность антибиотиков в отношении бактерий, которые скрываются под защитной оболочкой биопленки, состоящей из экзополимеров [Yang et al., 2012]. Для борьбы с инфекциями, ассоциированными с бактериальными биопленками могут применяться различные стратегии, основанные на (1) подавлении образования биопленок, например, производными фуранонов [Yujie et al., 2013], (2) эрадикации зрелых биопленок, например, ферментами разрушающими компоненты матрикса [Baidamshina et al., 2017], и наконец (3) проникновении антимикробных агентов в матрикс биопленки, с последующим бактерицидным действием на бактерии [Singh et al., 2010].
Среди различных соединений, проявляющих антимикробную и анти-биопленочную активность, в последние два десятилетия интенсивно изучаются производные 2(5H)-фуранона. В ходе данной работы производные 2(5H)-фуранона, обладающие различными функциональными группами (атом галогена, сульфанильная или сульфонильная группа, часть l-ментола или l-борнеола, см. Рисунок 5 для структур),
В данной работы идентифицированы три новых производных 2(5H)-фуранона с условными названиями Ф105, Ф123 и Ф131, специфически подавляющие рост и образование микробных биопленок клетками грамположительных бактерий, а именно S. aureus, B. cereus и S. mutans, соответственно. При этом соединения проявляют в большей или меньшей степени синергизм с аминогликозидными антибиотиками, позволяя в концентрациях около 1 мкг/мл снизить МПК последних в 2 раза. К значимым преимуществам новых производных 2(5H)-фуранона также можно отнести низкую вероятность развития бактериальной устойчивости и способность проникать в зрелые биопленки и оказывать антибактериальный эффект в отношении клеток, погруженных в матрикс биопленки.
Анализ антибактериальной активности ряда новых производных 2(5H)-фуранона в отношении различных бактерий позволило выявить 3 вещества с минимальными значениями МПК (Таблица 2). Соединение с условным названием Ф105 проявляло антимикробную активность в отношении всех исследуемых грамположительных бактерий. МПК соединения Ф105 был в два раза выше (20 мкг/мл) на клетках MRSA по сравнению с MSSA. Это различие в чувствительности к антибактериальному соединению между двумя штаммами S. aureus, MSSA и MRSA, вероятно, может объясняться изменением состава пептидогликана из-за устойчивости к метициллину, как описано ранее [Dejonge and Tomasz, 1993], которая может препятствовать эффективному проникновению соединения в клетки. Сниженная восприимчивость может быть также связана с кассетой SCCmec, которая, помимо метициллин-резистентных факторов (аллелей тесА), содержит до 50 других открытых рамок считывания. Некоторые из этих открытых рамок считывания ответственны за устойчивость к различным соединениям (например, опероны cadDX или arsRBC и arsDARBC за устойчивость к кадмию и арсенату) [Li et al, 2011], другие имеют неизвестные функции и также могут влиять на восприимчивость или проницаемость клеток к соединению Ф105.
Структурные аналоги Ф105 без 7-ментолового фрагмента (3-хлор-5-гидрокси-4-[(4-метилфенилсульфонил)]-2(5Я)-фуранон, Ф70) или сульфонильной группы (3-хлор-5(Л)-[(1і?,2 ,5і?)-2-изопропил-5-метилциклогексилокси]-4-[(4-метилфенил)сульфанил]-2(5Я)-фуранон, Ф104) [Latypova et al, 2014; Kayumov et al, 2015] не проявляли активности в отношении S. aureus, что свидетельствовало о необходимости обеих функциональных групп для подавления соединением микробного роста (Таблица 1). Производное 2(H)-фуранона Ф131, отличающееся от соединения Ф105 /-борнеоловой группой вместо /-ментоловой, было активно только в отношении S. mutans, представителя ротовой микрофлоры. Соединения, имеющие в своем составе только галогеновые и терпеновые фрагменты (Ф122, Ф123, Ф125), проявляли активность в отношении грамположительных бактерий, однако бактерицидный эффект наблюдался только для соединения Ф123, и только на клетках В. cereus, подтверждая ключевую роль 7г-толилсульфонильной группы в бактерицидной активности Ф105 в отношении золотистого стафилококка.
Необходимо отметить, что МБК данных соединений (Ф105, Ф123 и Ф131) превышала МПК не более чем в 4 раза (Таблица 2), что говорит о бактерицидном действии данных соединений. Примечательно, что все исследуемые соединения не подавляли рост грамотрицательных бактерий. В настоящее время грамотрицательные бактерии представляют собой наиболее резистентную группу бактерий благодаря своим специфическим механизмам устойчивости к антимикробным соединениям, включая особенности строения клеточной стенки, наличия большого набора генов устойчивости к антибиотикам и секреции непроницаемого для антибиотиков внеклеточного полимерного матрикса [Bassetti et al, 2017]. Несмотря на ряд работ, в которых производные 2(5Н)-фуранона способны интерферировать системой чувства кворума грамотрицательных бактерий и подавлять образование ими биопленки [Brackman and Coenye, 2015], соединения Ф105, Ф123 и ФІЗІ не были способны подавлять образование биопленки клетками этих бактерий (Таблицы 4, 12 и 15) Эти выявленные особенности позволяют предложить хемотипы Ф122, Ф123, Ф125 как основу создания антибактериальных препаратов с узкой специфичностью, что позволит снизить негативный эффект на резидентную микрофлору.
Одним из выявленных недостатков соединений Ф105, Ф123 и Ф131, ограничивающих их системное применение, является их высокая цитотоксичность, которая может быть обусловлена атомами галогенов [Lattmann et al., 2004]. Для отобранных соединений значения цитотоксичности СС50, приводящие к двукратному снижению жизнеспособности эукариотических клеток, выражающейся в повреждении плазматической мембраны, составили 45 мкг/мл для Ф105, 60 мкг/мл для Ф123 и 64 мкг/мл для Ф131 (Таблица 3), что превышало значения МПК и БПК в 3-8 раз (Таблицы 4, 11 и 15). С другой стороны, широко используемый в практике антимикробный препарат бензалкония хлорид (БХ), предназначенный для наружного применения, демонстрировал в тех же условиях значение СС50 2 мкг/мл. Другой метод определения цитотоксичности (CellTiter-Blue Cell Viability Assay, Promega) показал снижение митохондриальной активности для всех производных 2(5Н)-фуранонов. Значения СС50 составили 21 мкг/мл для Ф105, 34 мкг/мл для Ф123 и 40 мкг/мл для Ф131, тогда как для БХ значение СС50 составило 5 мкг/мл.
Высокая цитотоксичность БХ, по всей видимости, связана с его прямым повреждением мембраны клеток, что ведет к высвобождению аденилат киназы, ключевого фермента метаболизма, являющегося индикатором жизнеспособности. Действие производных 2(5Н)-фуранонов основано, по всей видимости, на их воздействии на внутриклеточные белки, приводящим к нарушению их функций, так как это показано для соединения Ф105 (рисунки 17 и 18, таблицы 8, 9 и 10), а также для ряда других соединений, действующих на грамположительные бактерии [Kuehl et al., 2009; Lonn-Stensrud et al., 2009; Kayumov et al., 2015]. Таким образом, цитотоксичность соединений Ф105, Ф123 и Ф131 значительно ниже, ччем у бензалкония хлорида, что позволяет предложить их для наружного использования в качестве альтернативных антибактериальных веществ.
Углубленные исследования антимикробной активности Ф105, Ф123 и Ф131 показали их способность подавлять образование биопленок S. aureus, B. cereus и S. mutans соответственно. Биопленки представляют собой сложные трехмерные микробные сообщества, прикрепленные к различным поверхностям, и представляют собой предпочтительный образ жизни бактерий в естественных и искусственных экосистемах [Donlan and Costerton, 2002; Bremer et al., 2011]. В биопленках бактериальные клетки погружены во внеклеточный матрикс, состоящий из таких органических полимеров, как полисахариды, пептиды и внеклеточная ДНК, которые синтезируются и высвобождаются самими бактериями [Lewis, 2001; Atshan et al., 2015; Fagerlund et al., 2016]. Биопленка значительно снижает восприимчивость бактерий к различным факторам внешнего стресса [Donlan, 2002]. Клетки, находящиеся в биопленке могут иметь устойчивость к противомикробным препаратам в 1000 раз превосходящую устойчивость планктонных клеток [Cosgrove et al., 2002; Sanchez-Vizuete et al., 2015], а также более высокую устойчивость к иммунной системе организма хозяина, приводящую к рецидивам и осложнениям при лечении хронических инфекций. Образование биопленок устойчивыми к метициллину клетками S. aureus на ранах и поверхностях, контактирующих с различными тканями, делает бактерии недоступными как для противомикробных препаратов, так и для иммунной системы хозяина. Открытие природных производных фуранона, обладающих активностью против биопленок [Ren et al., 2001; Ren et al., 2004] дало начало исследованию этих соединений в качестве анти-биопленочных агентов [Brackman and Coenye, 2015]. В то время как многие производные 2(5H)-фуранона действуют на системы кворума AI-АII грамотрицательных бактерий, блокируя образование биопленки [Ren et al., 2001], было показано, что ряд производных фуранона имеют активность в отношении грамположительных бактерий S. epidermidis и B. subtilis [Ren et al., 2004; Lonn-Stensrud et al., 2009; Kayumov et al., 2015; Trizna et al., 2015].
Кроме подавления роста клеток и образования ими биопленки, соединение Ф105, несущее сульфонильный и l-ментоловый фрагменты, проявляло антибактериальную активность в отношении клеток S. aureus в составе биопленки. Несмотря на то, что антимикробную активность соединения Ф105 можно охарактеризовать как умеренную, так как МПК других производных фуранона в отношении S. aureus варьировались от 4.65 мкг/мл (15 мкМ) [Kuehl et al., 2009] до 16 мкг/мл (107 мкМ) [Lattmann et al., 2005], эффект соединения Ф105 на зрелые биопленки был удивительно сильным и превосходил активность обычных антибиотиков на несколько порядков. Оставляя структуру биопленки практически неизмененной, соединение Ф105 легко проникало во внеклеточный матрикс биопленки и убивало встроенные в матрикс клетки, в отличие от других антибиотиков, таких как гентамицин, ампициллин, хлорамфеникол или ванкомицин [Parra-Ruiz et al., 2010; Singh et al., 2010; Kayumov et al., 2015]. Существует всего несколько антибиотиков со специфическим механизмом действия, которые проявляют некоторую активность по отношению к биопленкам S. aureus, например, рифампин и в меньшей степени даптомицин или фторхинолоны [Garcia et al., 2013; Siala et al., 2014; Stein et al., 2016].
В последние годы многочисленные данные указывают на быстрое развитие устойчивости S. aureus к антибиотикам [Zhou et al., 2015], процесс, который протекает с еще более быстрыми темпами в бактериях, находящихся в биопленке [Di Domenico et al., 2017; Dryden et al., 2017]. Четырнадцать серийных пассажей S. aureus на среде, содержащей соединение Ф105, не привели к развитию резистентных клеток (Рисунок 21). Следовательно, соединение Ф105 представляется перспективным противомикробным препаратом с низким риском развития резистентности и высокой специфической эффективностью в отношении клеток стафилококков в составе биопленки. Поэтому соединение Ф105 представляется перспективной основой для создания антисептиков для борьбы с биопленками, образованными клетками стафилококка, в том числе с лекарственной устойчивостью.
До настоящего времени молекулярные мишени и механизмы действия производных фуранона против грамположительных бактерий остаются неясными. Соединение Ф105 состоит из трех фармакофоров: хлорированный 2(5Н)-фураноновый, сульфонильный и l-ментоловый фрагменты, Было высказано предположение, что наличие терпеновой группы (ментола) в составе Ф105 обеспечивает ему проникновение в толщу биопленки и клетки бактерий: показано, что l-ментол увеличивает частоту валентного колебания CH2–групп липидного слоя мембраны, что ведет к нарушению межмолекулярных водородных связей в области полярных головок мембраны и понижению Tm на 2–8 C, увеличивая уровень текучести липидной системы, скорее всего, путем образования новых аквапоринов [Narishetty and Panchagnula, 2005]. Именно поэтому, вероятно, ментол является одним из наиболее эффективных терпенов, используемых для усиления проникновения фармацевтических препаратов через кожу [Kamatou et al., 2013]. Также ранее было показано, что ментол способен проявлять ингибирующее действие на биопленку и приводить к ее разрушению [Kifer et al., 2016]. Введение фрагмента l-ментола в карбаматные производные значительно повышает их анти-биопленочные свойства по отношению к MRSA [Rogers et al., 2010].