Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Клинически значимые дрожжевые грибы 11
2.1.1 Характеристика дрожжей: место в систематике грибов, физиолого биохимические особенности, экология 11
2.1.2. Дрожжи – представители нормальной и оппортунистической микрофлоры человека: локусы, субстраты, ассоциированные заболевания 13
2.1.3. Современные методы диагностики микозов и идентификации возбудителя 18
2.2. Антигенные субстанции дрожжей 20
2.2.1 Иммунодоминантные антигены дрожжевой клетки на примере Candida
spp 20
2.2.2. Способы выделения дрожжевых антигенов 26
2.2.3. Тест-системы для диагностики кандидозов и микоаллергозов.
2.3. Эндогенные антимикробные пептиды и характеристика их антимикотической активности in vitro 33
2.4. Заключение по обзору литературы 38
3. Собственные исследования 40
3.1. Материалы и методы исследования 40
3.2. Изучение параметров роста клинически значимых дрожжей на синтетических питательных средах
3.2.1. Культивирование дрожжей на плотных питательных средах 50
3.2.2. Культивирование дрожжей в жидких питательных средах
3.3. Разработка способов выделения антигенных комплексов из клеток дрожжей и оценка их специфичности на животных и человеке. 59
3.4. Активность сывороточных АМП при иммунизации и инфекции 79
3.4.1. Оценка изменения совокупной активности АМП в сыворотках мышей в ответ на иммунизацию целыми дрожжевыми клетками и антигенными комплексами 80
3.4.2. Сравнение совокупной активности АМП в сыворотках пациентов с БЛМ и здоровых доноров 83
4. Заключение 85
5. Выводы 91
6. Литература 93
- Характеристика дрожжей: место в систематике грибов, физиолого биохимические особенности, экология
- Антигенные субстанции дрожжей
- Культивирование дрожжей на плотных питательных средах
- Оценка изменения совокупной активности АМП в сыворотках мышей в ответ на иммунизацию целыми дрожжевыми клетками и антигенными комплексами
Характеристика дрожжей: место в систематике грибов, физиолого биохимические особенности, экология
Дрожжи используются человеком уже несколько тысячелетий, но вплотную к их изучению подошли сравнительно недавно. За время изучения дрожжевых грибов представление об их месте в систематике менялось. Сейчас дрожжи не выделяют в отдельный таксон. Их, в зависимости от типа полового процесса, относят к двум отделам - Ascomycota и Basidiomycota.
Представители этих двух отделов отличаются друг от друга по ряду признаков: строению органов полового спороношения (у аскомицетов споры формируются в специальной сумке – аске и называются аскоспорами, а у базидиомицетов – на выростах базидий и называются базидиоспорами), капсулообразующих углеводов, составу клеточных стенок и ядерной ДНК. Дрожжам присуще одноклеточное состояние, но многие из них способны переходить в мицелиальную форму при нехватке субстрата для наиболее полной его утилизации. Это явление получило название мицелиально-дрожжевой диморфизм [Cole G.T., 1981] и стало основной причиной выделения дрожжей в самостоятельный таксон [Голубев В.И., 1992].
Наиболее исчерпывающим и современным определением термина «дрожжи» является следующее:
«Дрожжи – это аско- и базидиомицеты, которые в вегетативной стадии размножаются почкованием или делением, что приводит к одноклеточному росту; половые структуры их не заключены в плодовые тела» [Kurtsman C.P., Fell J.W., 1998].
Практически все дрожжи широко распространены в природе. Некоторые из них могут находиться на объектах внешней среды, на поверхности медицинского инструментария, на предметах домашнего обихода, на игрушках, посуде, в питательном креме для рук, косметике [Magee P.T., Scherer S., 1998]. Так, 12 например, дрожжи С.albicans могут быть выделены с зубных щеток большинства носителей, c зубных протезов, катетеров. В больших количествах эти микроскопические грибы обнаруживаются в молочных продуктах: в творожных сырках (78,6%), твороге (66,6%), сметане (75%). Также эти грибы способны сапрофитировать в окружающей среде на субстратах живой и неживой природы (чаще на богатых сахарами фруктах и овощах, особенно несвежих) [Rangel-Frausto M. S. et al, 1994].
Дрожжи имеют строение, типичное для всех эукариотических клеток: в цитоплазме присутствуют рибосомы, митохондрии, включения в виде гликогена, крупное ядро, ограниченное ядерной мембраной, аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть. Цитоплазма ограничена цитоплазматической мембраной и клеточной стенкой, которая является существенной структурой, обеспечивающей жизнедеятельность дрожжевых грибов [Бабьева И.П., Чернов И.Ю, 2004]
Культивирование дрожжей традиционно проводят как на плотных, так и в жидких средах, содержащих органические компоненты (полноценные среды) или без таковых (синтетические среды). Общепринятыми полноценными средами для выращивания дрожжей считаются среда Сабуро и ГПД (глюкозо-пептон-дрожжевая). В качестве синтетических сред используют среду Чапека, модифицированную среду RPMI 1640 [Espinel-ingroff, 1995] и среду, описанную Ярроу [Yarrow D.,1998]. На этих средах растут нелипофильные дрожжи, тогда как для липофильных дрожжей рода Malassezia требуется введение липидных компонентов и эмульгаторов [Guillot et al,1996; Gueho E, 1996]. Синтетические среды для Malassezia были разработаны с использованием традиционной минеральной основы с добавлением твинов и желчных солей [Арзуманян В.Г., 1999]. Культивирование дрожжей производят в аэробных условиях, поскольку среди дрожжей нет ни строгих анаэробов, ни микроаэрофилов. Многие аскомицеты, включая дрожжи рода Candida при низкой концентрации O2 в среде переходят на брожение, тогда как указанные рода базидиомицетов к этому не способны. Дрожжи способны расти в широком диапазоне pH. Так, для Candida 13 оптимальным является интервал от 5 до 7,6. В природных условиях дрожжи растут в широком диапазоне температур и не погибают при замораживании; в условиях лабораторного культивирования оптимальным для Candida считается интервал от 25 до 37oC, а для Malassezia – от 32 до 35 oC [de Hoog G.S., Guarro J, 1995].
Дрожжи – представители нормальной и оппортунистической микрофлоры человека: локусы, субстраты, ассоциированные заболевания
Дрожжи, встречающиеся в клинической практике и ассоциированные с заболеваниями, принято называть клинически значимыми. Критерии клинически значимых дрожжей сформулированы ранее МакГиннисом [McGinnis M.R. et al, 1980]: обнаружение в клинических образцах; выделение в чистой культуре; достоверная идентификация и причинно-значимая связь с заболеванием. По сути, это та же триада Коха, исключая заражение подопытных животных.
Дрожжи практически не вызывают возникновение болезни у здоровых, иммунокомпетентных людей даже при постоянном контакте с ними в их природных местах обитания [Hurley R. et al., 1974]. Истинные дрожжи не являются абсолютными патогенами, они становятся причиной возникновения заболевания только при наличии ряда обстоятельств.
Наиболее подверженными микозам являются индивидуумы, имеющие опухоли, проходящие антибиотико/химиотерапию, ВИЧ-инфицированные, беременные женщины, люди, получившие механические травмы. Проявление заболевания может зависеть от колонизируемой ткани, факторов вирулентности клеток дрожжей [Hurley R. et al., 1987]. Из всех родов клинически значимых дрожжевых грибов наиболее часто встречающимися в клинике и в норме у здоровых людей являются 7 родов, представленные в таблице 1.
Антигенные субстанции дрожжей
Дот-блот анализ кроличьих сывороток с ЭКЦ указанных дрожжей показал следующее: препарат из C. albicans № 927 вызывал образование IgG-антител у кролика А, при этом антитела у кролика Б к данному препарату отсутствовали, то есть этот препарат не содержал перекрестных эпитопов с препаратом из M. furfur № 1451. Сыворотки обоих кроликов содержали антитела к дрожжам M. furfur № 1451. Это может свидетельствовать как о наличии перекрестных эпитопов у изучаемых препаратов, так и о носительстве дрожжей Malassezia обоими кроликами.
Антигенсодержащий препарат ЭКЦ, полученный из дрожжей R. mucilaginosa № 132, проверяли вместе с препаратами из C. albicans № 927 и M. furfur № 1451 методом дот-блот анализа с сывороткой больной атопическим дерматитом в возрасте 6 лет, которая являлась носителем R. mucilaginosa на поверхности кожи. Результаты анализа представлены на рис. 7 Из рисунка видно, что: 1. Изучаемая сыворотка крови содержала IgG и IgE-антитела к дрожжам R. mucilaginosa. 2. Данная пациентка не имела антител к дрожжам M. furfur, что можно объяснить отсутствием этих дрожжей на коже в силу возраста [Арзуманян В.Г., 2002]. 3. Антигенный препарат ЭКЦ из M. furfur не содержал перекрестных эпитопов с дрожжами R. mucilaginosa ни на уровне IgG-антител, ни на уровне IgE-антител. 4. Пациентка либо имела IgG-антитела к C. albicans, либо препарат из C. albicans содержал перекрестные эпитопы на уровне IgG-антител с препаратом из R. mucilaginosa. Препарат ЭКЦ из R. mucilaginosa изучили методом иммуноблоттинга с той же сывороткой (рис. 8). Наличие иммуноглобулинов классов G и E к белкам этих дрожжей в сыворотке крови больной АД подтвердилось. При этом антигеном, участвующим в развитии IgG и IgE-ответа у данной больной, явился белок 73,5 кДа. Кроме того, видно наличие широких полос в 1 и 2 треках, соответствующих молекулярным массам примерно 140 кДа и 172 кДа. Это, очевидно, маннопротеины, которые и представляют собой основную часть полисахаридной составляющей данного препарата.
Далее, для получения антигенных препаратов, культивирование всех штаммов дрожжей проводили только в жидких синтетических питательных средах до конца экспоненциальной фазы роста. Антигенные препараты получали следующими способами: - экстракцией из клеток раствором 1% SDS (ЭКЦ) (рис.9); - экстракцией из клеточных стенок последовательно: - раствором 6% SDS при 500С (ЭКС-1), - раствором 6% SDS при кипячении (ЭКС-2), - раствором 50 мМ NaOH (ЭКС-3); - очисткой культуральной жидкости по следующей схеме - фильтрованием через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («TRP», Германия), концентрированием путем лиофильного высушивания и растворения в меньшем объеме, удалением полисахаридных фракций многократным замораживанием/оттаиванием, удалением высокомолекулярных фракций ( 100 кДа) путем ультрафильтрации с помощью мембранных фильтров («Amicon ultra», Германия) (АКЖ). Иммуногенные свойства полученных антигенных препаратов изучали с помощью дот-блот анализа с сыворотками мышей, иммунизированных либо клетками дрожжей, либо внеклеточными антигенными препаратами в соответствии со схемой, описанной в разделе «Материалы и методы» (Таблица 10).
Установлено, что все препараты ЭКЦ реагировали с гомологичными сыворотками, однако, в различной степени они содержали перекрестные эпитопы, о чем свидетельствует наличие реакций с негомологичными сыворотками. Вероятнее всего перекрестными эпитопами явились цитоплазматические белки или гликопротеины поверхностных слоев клеток, которые могли присутствовать в полученных препаратах. Очевидно, что описанный способ получения антигенных препаратов путем экстракции из клеток раствором 1% SDS не обеспечивает достаточной специфичности таковых.
При получении препаратов ЭКС-1 и ЭКС-2 в экстракт поступали ковалентно связанные белки, а ЭКС-3 – щелочерастворимые белки. Препараты ЭКС-1 и ЭКС-2 демонстрировали слабую реакцию с некоторыми гомологичными и негомологичными сыворотками. Препараты ЭКС-3 не взаимодействовали ни с одной из сывороток.
В опытах на мышах, иммунизированных целыми клетками, показано, что препараты АКЖ реагировали только с гомологичными сыворотками, кроме препарата из M. furfur № 1451, который не реагировал ни с одной из сывороток, что, по-видимому, обусловлено отсутствием каких-либо антигенных субстанций в культуральной жидкости этой культуры. Остальные АКЖ, очевидно, не содержали перекрестных эпитопов.
В экспериментах по иммунизации мышей антигенными препаратами, полученными из культуральной жидкости, получены результаты, аналогичные предыдущим. Это свидетельствует, с одной стороны, о формировании иммунного ответа на введение данных препаратов, а с другой – о специфичности этих препаратов. Таким образом, результаты дот-блот анализа показали, что препараты из культуральной жидкости являются гораздо более специфичными, чем препараты, полученные путем экстракции из клеток и клеточных стенок дрожжей. Далее в качестве объекта для исследования иммуногенных свойств был выбран именно препарат из культуральной жидкости - АКЖ.
Культивирование дрожжей на плотных питательных средах
Специфичность тех же препаратов проверяли в реакции преципитации с сыворотками от пациента с БЛМ (с высевом C. albicans), пациента с АД (с высевом R. mucilaginosa), а также от здорового донора. Эти препараты взаимодействовали (преципитировали) только с гомологичными сыворотками, что свидетельствует о специфичности полученных антигенов. Наличие сывороток от носителей C. albicans дало возможность выявить иммунодоминантные белки в препарате из этих дрожжей. С помощью иммуноблоттинга удалось установить, что в пуловой сыворотке больных БЛМ антитела к антигенам следующих молекулярных масс: 40, 63, 88, 124 кДа. Сравнивая эти значения с данными литературы, можно предположить, что белок с молекулярной массой 40 кДа является аспартилпротеиназой или липазой, 88 кДа – фосфолипазой [Lpez-Ribot J.L., et al, 2004; Naglik J.R., et al, 2003], тогда как белок весом 63 кДа – не имеет аналогов среди иммунодоминантных.
Иммуноферментный анализ 9 сывороток от пациентов с БЛМ и 9 контрольных сывороток с теми же внеклеточными антигенами дрожжей семи родов показал, что уровень IgG-антител к C. albicans № 927 у пациентов с БЛМ в 2,1 раза превышает таковой в контрольной группе и в 4 - 8 раз превышает таковой к остальным грибам в данной группе. Установлено, что пороговым значением оптической плотности для выявления кандидоза можно считать 1. Кроме того носительство дрожжей R. mucilaginosa у пациента с АД сопровождалось повышением уровня IgG-антител к этим дрожжам в 1,5 раза по сравнению с контролем. Эти данные подтверждают специфичность полученных антигенных препаратов.
Таким образом, разработан новый способ получения специфических антигенсодержащих препаратов из 7 типовых родов/видов клинически значимых дрожжей, основанный на культивировании в жидких синтетических питательных средах, отделении внеклеточной жидкости, удалении высокомолекулярных полисахаридных и белковых фракций.
Одним из традиционных подходов в диагностике микозов является оценка иммунного ответа, а именно, уровня специфических иммуноглобулинов, в то время как еще одним важным фактором врожденного противомикробного гуморального иммунитета являются антимикробные пептиды (АМП) [Bahar A.A. Ren D., 2013]. Основными клетками, продуцирующими АМП, являются нейтрофилы, моноциты, макрофаги и эпителиоциты. В крови человека циркулируют следующие АМП: лактоферрин, кальпротектин, лизоцим, секреторный ингибитор лейкопротеазы, кателицидины, дефензины и липокалин, хотя список АМП, действующих в других локусах, еще шире. В настоящее время идет процесс накопления данных о роли каждого АМП в развитии различных заболеваний, однако, результаты этих исследований весьма противоречивы. В доступной литературе описаны количественные способы определения индивидуальных АМП [Salmon V. et al, 1997; Lulloff S.J., 2004; Samaranayake Y. H., 1997 -2001; den Hertog A.L., 2005], однако, эти способы не дают возможности оценить совокупную активность АМП, в то время, как изучение этого параметра может иметь не меньшее значение при диагностике микозов, чем определение уровней иммуноглобулинов.
Совокупную активность АМП изучали на сыворотках мышей, иммунизированных клетками и внеклеточными антигенными препаратами дрожжей семи родов, а также на человеческих сыворотках, полученных от больных БЛМ. Для отделения высокомолекулярной фракции, содержащей антитела и компоненты системы комплемента, сыворотки подвергали ультрафильтрации, после чего определяли их активность по отношению к тест-культуре Candida albicans № 927. Оказалось, что при иммунизации мышей клетками любой из культур дрожжей активность АМП возрастала по сравнению с контролем. Такая же закономерность прослеживалась при иммунизации мышей внеклеточными антигенами. Логично было бы ожидать большего повышение активности АМП у мышей, иммунизированных клетками или антигенами C. albicans № 927, однако, это не так. На основании полученных данных можно лишь заключить, что, в отличие от иммуноглобулинов, ответ АМП не является специфичным. Это можно объяснить небольшим размером молекул АМП (М.м. 3,5-90 кДа) по сравнению с крупными и имеющими сложную структуру молекулами иммуноглобулинов (М.м. 150-500 кДа). Кроме того, отмечено наличие высокой корреляции между величинами общей активности АМП и уровнями специфических иммуноглобулинов класса G к внеклеточным антигенам соответствующих видов дрожжей независимо от способа иммунизации.
При исследовании человеческих сывороток установлено, что носительство дрожжей C. albicans пациентами с БЛМ сопровождалось повышением активности АМП. При этом отмечена корреляция средней силы между уровнем АМП-активности, уровнем иммуноглобулинов класса G и обсемененностью мокроты.
Описанный метод может использоваться для изучения звена гуморального иммунитета, связанного с функционированием АМП. Очевидно, что иммунизация животных клетками убитых культур или внеклеточными антигенами, а также инфекционные заболевания человека на примере бронхолегочного микоза в стадии обострения, сопровождаются не только повышением уровней специфических сывороточных иммуноглобулинов класса G, но и увеличением суммарной активности антимикробных пептидов.
Оценка изменения совокупной активности АМП в сыворотках мышей в ответ на иммунизацию целыми дрожжевыми клетками и антигенными комплексами
Термин «дрожжи» вошел в употребление в клинической микологии сравнительно недавно, поскольку это понятие традиционно связывали с пекарскими и винными дрожжами. Однако профессиональные зимологи давно выяснили, что «грибки – кандиды» - это не что иное, как дрожжи (дрожжевые грибы), принадлежащие к отделу аскомицетов. Их родовое название на протяжении XIX - XX веков неоднократно менялось (Oidium, Dematium, Monilia, Myceloblastanon, Mycotorula, Syringospora, Procandida), и, наконец, в 1923 г. было выбрано современное название Candida [http://www.cbs.knaw.nl]. По мере развития клинической микологии стало очевидно, что число родов возбудителей микозов гораздо шире. Наиболее часто встречающимися в клинической практике являются дрожжи Candida albicans и Cryptococcus neoformans [Mayer, F.L. et al., 2013; Cogliati, M., 2013], однако, этот список можно продолжить такими родами, как Trichosporon spp., Rhodotorula spp., Malassezia spp., Geotrichum spp. и Saccharomyces spp. [Marcon M.J., Powell D.A, 1992; Lun L.W. et al, 2006; Kushawaha A., 2009]. Известны и другие рода клинически значимых дрожжевых грибов, однако, они являются телеоморфами родов, указанных выше.
В связи с постоянным расширением списка заболеваний с участием оппортунистических инфекционных агентов, в том числе грибов, весьма актуальными для использования в клинике являются серологические методы диагностики микозов. Коммерческие диагностические препараты дрожжевых антигенов в настоящее время получают лишь из дрожжей C. albicans, C. neoformans и M. furfur путем деструкции клеток, что приводит к обогащению неспецифическими субстанциями и, как следствие, ложноположительным результатам [Chaffin W. L. et al, 1998; Hernando FL, 1993; Pavia J. et al,2001].
В этой связи актуальными являются расширение спектра родов клинически значимых дрожжей и усовершенствование метода получения диагностических антигенов. При разработке любых антигенных препаратов микробного происхождения важными этапами являются культивирование микроорганизмов, выделение антигенных субстанций и оценка их специфичности. Дизайн исследования представлен на рис. 2.
Исследования по культивированию типовых видов клинически значимых дрожжевых грибов - Candida albicans № 927, Geotrichum candidum № 1206, Malassezia furfur № 1451, Rhodotorula mucilaginosa № 132, Cryptococcus neoformans № 3465, Trichosporon cutaneum № 18, Saccharomyces cerevisiae Y-375-проводили на плотных и в жидких синтетических средах. Опираясь на полученные данные, можно заключить, что плотные среды удобны для получения небольших количеств антигенов из клеток грибов. Однако для более масштабных исследований удобными являются жидкие среды, использование которых также может обеспечить получение внеклеточных антигенных комплексов. За основу жидкой синтетической среды взяли среду Ярроу [Yarrow, 1998], которая обеспечивает рост большинства нелипофильных дрожжей. Для культивирования липофильных дрожжей M. furfur № 1451 использовали разработанную ранее синтетическую среду, содержащую Tween 40 и эмульгатор [Арзуманян В.Г., 2002]. Для каждой культуры рассчитывали параметры роста: удельную скорость роста, длительность экспоненты, время удвоения [Перт С.Дж., 1978]. Оказалось, что наиболее быстрорастущими являются C. albicans № 927 и S. cerevisiae Y-375, а самыми урожайными - R. mucilaginosa № 132 и C. neoformans № 3465. Эти данные использовали далее для получения культур клеток и внеклеточных субстанций, пользуясь следующим принципом: наиболее специфичные антигенные комплексы как правило соответствуют экспоненциальной фазе роста культуры [Баснакьян И.А., 2010]. Кроме того, клетки дрожжей, выращенные в жидкой синтетической среде, использовали для иммунизации животных.
Для получения антигенных препаратов из целых клеток был опробован ряд детергентов. Оказалось, что наиболее эффективным по количеству экстрагируемого белка является раствор 1% SDS, что согласуется с данными литературы [Lortal S. et al,1992; Арзуманян В.Г., 2002].
В соответствии с алгоритмом исследования (рис 2) начальным этапом получения антигенов явилась SDS-экстракция из целых клеток дрожжей R. mucilaginosa № 132, C. albicans № 927 и M. furfur № 1451, выращенных на плотных синтетических средах. Иммуногенность и специфичность полученных препаратов ЭКЦ оценивали методом дот-блот анализа с сыворотками иммунизированных кроликов и с сывороткой от пациентки-носителя дрожжей Rhodotorula spp. на поверхности кожи. На основании результатов по данной серии опытов можно заключить, что антигенные препараты обладали высокой иммуногенностью, но низкой специфичностью. С помощью иммуноблоттинга удалось установить, что антигеном, участвующим в развитии IgG и IgE-ответа у данной больной явился белок с молекулярной массой 73,5 кДа.
Культивирование в жидкой синтетической среде позволило модифицировать подходы к выделению антигенных комплексов: помимо SDS-экстрактов целых клеток стало возможным получение экстрактов клеточных стенок и внеклеточной культуральной жидкости. Кроме того, в данной серии экспериментов был расширен набор видов клинически значимых дрожжей. Антигенные препараты, полученные тремя описанными способами, исследовали на специфичность и иммуногенность методом дот-блот анализа с сыворотками мышей, иммунизированных целыми клетками, а в отдельной серии опытов – внеклеточными антигенными препаратами.
Препараты ЭКЦ показали высокую иммуногенность, но низкую специфичность, экстракты клеточных стенок обладали низкой иммуногенностью и специфичностью, в то время как препараты АКЖ оказались высокоиммуногенными и высокоспецифичными, за исключением препарата из M. furfur № 1451. Очевидно, что этот вид практически не выделяет антигенных белков во внеклеточное пространство. В этой связи для дальнейших исследований использовали ЭКЦ M. furfur № 1451, но АКЖ прочих видов.