Антигенный анализ возбудителей мелиодиоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности Пивень, Николай Николаевич

Введение к работе

Псевдомонады - микроорганизмы рода Pseudomonas, широко распространенные в природе, играют значительную роль в инфекционной патологии людей и животных (Fournier, Chambon, 1958; Ширяев, 1976; Илюхин, 1985; Беляков ссоавт.,1990). Из 16 видов псевдомонад, имеющих клиническое значение, лишь P.pseudomallei, P.mallei и P.aeruginosa имеют нозологическую самостоятельность. За счет своей естественной полипатогенности и полирезистентности эти микроорганизмы вызывают соответствующие инфекционные заболевания людей и животных различной тяжести (Ковалев, 1971; Yayanetra at al., 1974; Shaefer at al., 1983; Nestorescu et al., 1985). Остальные псевдомонады способны приводить к развитию нозокомиальных или оппортунистических инфекций, частота которых в последнее время заметно возросла (Илюхин, 1985; Rodriguexat al., 1995).

Значимость проблемы мелиоидоза за последние десятилетия возросла не только для традиционно эндемичных регионов Юго-Восточной Азии, Северной Австралии и Западной Африки, но и в связи с завозами возбудителя мелиоидоза в районы, где он раньше не регистрировался. Случаи заболевания мелиоидозом имели место в Америке (Северная, Центральная, Южная), Азии (Турция, Иран, Южный Китай), Европе (Англия, Франция, Германия, Дания, Нидерланды) (Propost, Vigier, 1960; Dodin, Ferry, 1974; Dodin, 1976; Galimand, 1979; Bloch at al. 1981; Li L., He J, 1992). Все это указывает на существующую реальную опасность завоза в Россию этого опасного возбудителя из эндемичных районов. Отсутствие средств специфической профилактики мелиоидоза, а также выраженная резистентность ко многим химиотерапевтическим средствам, требует пристального внимания к этому своеобразному и изменчивому микроорганизму, прежде всего с диагностических позиций.

Следует отметить, что ввиду недостаточно четкой нацеленности медицинских учреждений на диагностику мелиоидоза, нет абсолютной гарантии в отсутствии случаев этого заболевания в нашей стране среди лиц, прибывших из эндемичных по мелиоидозу стран. Косвенным подтверждением подобной версии могут служить результаты обширных целенаправленных исследований по выявлению мелиоидоза, проведенных в Таиланде. При интенсивном обследовании только за 1986 год зарегистрировано более 800 бактериологически и серологически подтвержденных случаев мелиоидоза, хотя до этого момента за все предыдущее время было зафиксировано всего лишь три случая этого заболевания (Kanai, Deysirilert, 1988). При этом было установлено, что основной причиной нескольких десятков так называемого

"неожиданного необъяснимого смертельного синдрома" также является мелиоидоз (Yap etal.,1991).

В отличие от мелиоидоза нозоареал сапа существенно сузился, однако сама болезнь не ликвидирована. Сап прежде был широко распространен среди различных животных во многих странах, в том числе во Франции, Германии и России. В дальнейшем в странах Европы и Азии сап лошадей был практически ликвидирован, но в некоторых из них, в частности Турции, Иране, Монголии и Италии, сап продолжал регистрироваться (Беляков, 1990). На всей территории бывшего СССР сап считался полностью ликвидированным. Однако целенаправленные исследования, проведенные специалистами ВолгНИПЧИ на мясокомбинате г. Улан-Удэ в 1984 - 1985 годах, позволили из двухсот забитых лошадей, импортированных из Монголии, в трех обнаружить специфические сапные антигены и антитела. Более того, в одном случае был выделен типичный, вирулентный штамм P.mallei (Мельников с соавт., 1987). Данный факт также дает основание полагать, что диагностика сапа находится не на должном уровне, так как все лошади из Монголии официально подвергались обязательной трехкратной аллергической пробе с маллеином и постановке РСК.

В связи с изложенным, становится очевидной актуальность создания надежных средств как для иммунодиагностики мелиоидоза и сапа, так и для их специфической профилактики.

При диагностике инфекционных заболеваний, наряду с бактериологическими методами, все более широкое применение находят иммунологические приемы. С одной стороны, они направлены на идентификацию и дифференциацию возбудителей, с другой - выявление специфической иммунологической перестройки и оценку степени излеченности макроорганизма (Ashdown, 1981). Для достижения этого необходимы знания антигенной структуры соответствующих микроорганизмов, включающие информацию о наличии общих, перекрест-нореагирующих и видовых антигенов.

В отношении возбудителей мелиоидоза и сапа сведений об их антигенной организации явно недостаточно. Существующие на сегодняшний день препараты для иммунодиагностики мелиоидоза и сапа конструировались эмпирически, без достаточных знаний антигенной организации указанных микроорганизмов. Вследствие этого у P.pseudomallei и P.mallei не изучены парциальные антигенные комплексы и не оценена их структурно-функциональная значимость. Отсутствуют разработки высокоэффективных средств не только для серологической идентификации и дифференциации этих возбудителей, но и для иммунодиагностики мелиоидоза и сапа. До сих пор не ясна роль отдельных биополимеров в патогенезе этих инфекций, что в свою очередь является одним из основных сдерживающих факторов при конструировании специфических химических вакцин.

ЦЕЛЬ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ заключалась в изучении антигенной структуры P. pseudomallei и P. mallei, обнаружении, выделении и иммунохимической характеристике биополимеров, играющих определенную роль в идентификации, диагностике и патогенезе мелноидоза и сапа.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ были следующими:

1. изучить антигенный состав возбудителей мелноидоза и сапа, а также антигенные взаимоотношения некоторых клинически значимых псевдомонад;

2. разработать технологию выделения и очистки антигенных комплексов возбудителей мелноидоза и сапа, имеющих отношение к диагностике и развитию патогенетических механизмов инфекционного процесса;

3. определить значимость отдельных антигенов P.pseudomallei и P.mallei в идентификации этих возбудителей и сконструировать на их основе высокоэффективные диагностические препараты;

4. оценить иммунный ответ макроорганизма при экспериментальном мелиоидозе и сапе, а также возможность использования выявленных иммунологически активных антигенов для установления проявлений гуморального и клеточного звеньев иммунитета;

5. изучить роль экстрацеллюлярных и поверхностных антигенов в реализации вирулентных свойств возбудителей мелноидоза и сапа;

6. выявить и изучить биополимеры P.pseudomallei, индуцирующие протективный эффект при экспериментальном мелиоидозе и сапе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Изучена антигенная структура возбудителей мелноидоза и сапа, впервые разработана антигенная схема P.pseudomallei, показана антигенная взаимосвязь некоторых клинически значимых псевдомонад.

На основе анализа антигенного строения возбудителей мелноидоза и сапа определены антигенные комплексы, играющие ведущую роль при идентификации этих возбудителей. Показана целесообразность применения выявленных биополимеров в качестве основы при получении высокоэффективных иммуноглобулнновых препаратов для серологической идентификации.

Выделен, очищен и изучен поверхностный антиген 6 гликолипо-протеиновой природы - один из основных биополимеров, определяющих видовую принадлежность возбудителей мелноидоза и сапа, а также разграничение штаммов P. pseudomallei на серовары.

Определен комплекс антигенов возбудителя мелноидоза (6+d), стабильно индуцирующих гуморальный иммунный ответ у лабораторных животных при экспериментальном мелиоидозе и сапе.

Выделены, очищены и изучены три экзопротеазы возбудителя мелноидоза, установлены их физико-химические и иммунобиологические свойства.

Выявлен, выделен и охарактеризован поверхностный гликопро-

тейповый антиген 8 - один из ключевых факторов вирулентности возбудителей мелиоидоза и сапа, патогенное действие которого опосредовано его антифагоцитарнымн свойствами.

Установлена химическая гетерогенность антигена 8, а также им-муногенность его отдельных фракций при экспериментальном мелиои-дозе и сапе.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена следующими авторскими свидетельствами и патентами на изобретение:

1) авторское свидетельство N 1218526 от 15.П.85г."Способ по
лучения мелиоидозной преципитнрующей сыворотки";

2. авторское свидетельство N 286000 от ;

3. авторское свидетельство N 310869 от 02.04.90г;-

4. авторское свидетельство N 1621229 от 15.09.90г."Способ получения мелиоидозного аллергена";

5. авторское свидетельство N 1741323 от 15.02.92г."Способ получения мелиоидозного антигенного комплекса";

6. патент на изобретение N 2004250, март 1994г."Способ выделения Агб возбудителя мелиоидоза";

7. патент на изобретение N 2004251, март 1994г."Способ выделения Аг8 возбудителя мелиоидоза";

8. положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке N 95181635/13(020200) "Способ получения экзопротеаз возбудителя мелиоидоза" от 20.06.96;

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Материалы диссертационного исследования использованы при составлении инструктивно-методических документов:

1. методические рекомендации "Референтная система антигенов возбудителя мелиоидоза и их иммунохимическая идентификация" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 24.09.80г.);

2. методические рекомендации "Лабораторная диагностика мелиоидоза" (Утверждены зам.нач. ГУКИ Минздрава СССР О.Г.Имамалиевым 28.09.80г.);

3. методические рекомендации "Способ выделения и дифференциации возбудителя мелиоидоза из различных объектов при помощи плотной среды с мелиоидозной преципитнрующей антисывороткой" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 10.12.80г.);

4. методические рекомендации "Схема идентификации возбудителя мелиоидоза" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 16.07.82г.);

5. методические рекомендации "Схема идентификации псевдомонад, имеющих медицинское значение" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 22.12.86г.);

6. инструкция по изготовлению и контролю на диагностикум полигрупповой эритроцитарный чумной, сапной, мелиоидозный, ту-ляремийный, бруцеллезный иммуноглобулиновый сухой с ингредиен-

тами (Утверждена К НС, февраль 1987г.);

7. инструкция но изготовлению и контролю на иммуноглобулины полигрупповые чумные, сапные, мелиоидозные, туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспоровые, люминесцирующие сухие) (Утверждена КВС, февраль, 1987г.);

8. методические рекомендации по получению и применению мелиоидозного аллергена (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 14.02.90г.);

9. методические рекомендации "Получение н применение антигенного мелиоидозного диапюстикума" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 10.07.90г.);

10. методические рекомендации "Разработка способов получения и тестирования некоторых факторов патогенності! возбудителя мелио-идоза" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 19.12.90г.);

11. методические рекомендации "Применение неконкурентного твердофазного радиоиммунологического анализа для обнаружения антител при мелиоидозе" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 25.04.91г. и вошли в сборник "Современные методы диагностики ООИ и способы их применения" под редакцией Зыкина Л.Ф. и Ко-ровкина С.А. - Саратов, - 1992 г., утвержденный зам.нач. ГЭУ МЗ

. СССР Г.Г.Онищенко 25.09.91г.);

12. методические рекомендации по очистке Агб и Аг8 возбудителя мелиоидоза методом аффинной хроматографии на колонках с мо-ноклональными иммуносорбентами (Утверждены нач. ГЭУ МЗ СССР М.И.Наркевичем 28.10.91г.);

13. экспериментально-производственный регламент на иммуноглобулины полигрупповые чумные, сапные, мелиоидозные, туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспоровые) люминесцирующие, сухие (Утвержден директором Ставропольского НИПЧИ 07.12.92г.);

14. временная фармакопейная статья на иммуноглобулины полигрупповые чумные, сапные, мелиоидозные, туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспоровые) люминесцирующие сухие (Утверждена директором института "Микроб" 09.02.93г.);

15. инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных, сапных, мелиоидозных, ту-ляремийных, бруцеллезных, сибиреязвенных сухих (Утверждена зам.министра здравоохранения РФ М.Москвнчевым, февраль, 1993г.);

16. методические рекомендации "Лабораторная днагностн-ка.лечение и профилактика мелиоидоза" (Утверждены зам.пред. Гос-комсанэпиднадзора РФ Г.Г.Онищенко 01.10.94г.);

17. методические рекомендации "Выделение, очистка и детекция антигена 8 возбудителя мелиоидоза" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 15.02.94г.);

18. методические рекомендации "Экзопротеазы возбудителя ме-

лиоидоза: выделение, очистка и их обнаружение" (Утверждены директором ВолгНІІ ПЧИ 15.02.94 г.);

19. методические рекомендации "Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа" (Утверждены зам.пред. Госкомсанэпид-надзора РФ Г.Г.Онищенко 16.03.95г.);

20. методические рекомендации "Получение и использование латексных иммуноглобулиновых диагностикумов для идентификации некоторых патогенных псевдомонад" (Утверждены директором ВолгНППЧИ 12.12.95г.).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной научной конференции "Молекулярная биология, генетика и иммунология возбудителей ООИ" (Ростов-на-Дону, 1984г); на Всесоюзной научной конференции специалистов ПЧУ (Иркутск, 1984); на Всесоюзной научной конференции "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций (Ставрополь, 1986); на итоговой научной конференции "Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики ООИ (Ставрополь, 1989); на Всесоюзной научной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1990); на Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций (Волгоград, 1992); на институтских и межлабораторных конференциях ВолгНИПЧИ (1983-1994), на юбилейной конференции ВолгНИПЧИ (Волгоград, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 43 статьи, получено 5 авторских свидетельств, 2 патента на изобретение и положительное решение о выдаче патента на изобретение. Материалы диссертации вошли в 2 коллективные монографии.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 296 страницах машинописи, иллюстрирована 45 рисунками, 36 таблицами. Состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов.

Список используемой литературы включает 148 работ отечественных и 283 работы иностранных авторов.

1. новые данные по научной обоснованности принципов выбора антигенных структур P.pseudomallei, P. mallei и некоторых условнопа-тогенных псевдомонад с целью последующей разработки средств идентификации и дифференциации этих микроорганизмов;

2. результаты изучения антигенной структуры возбудителя ме-лиоидоза и создание его антигенной схемы, позволяющей проведение иммунохимической идентификации каждого входящего в нее антигенного комплекса;

3. разработка средств выявления иммунологической перестройки макроорганизма при мелиоидозной и сапной инфекциях, основанная

на анализе антигенон, адекватно отражающих специфический ответ гуморального и клеточного звеньев иммунитета;

4. доказательства прямой связи вирулентных свойств возбудителей мелиоидоза и сапа с экспрессией поверхностного гликопротеино-вого антигена 8, обладающего выраженной антифагоцитарной активностью;

5. новые данные по протективному эффекту, достигаемому при иммунизации животных отдельными фракциями Аг8 возбудителя мелиоидоза при экспериментальном мелиондозе и сапе.