Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .31
1.1. Характеристика C.diphtheriae 31
1.2. Особенности эпидемического процесса дифтерийной инфекции .36
1.3. Методы изучения и типирования C.diphtheriae
1.3.1. Фенотипические методы типирования .39
1.3.2. Молекулярно-генотипические методы типирования 46
1.4. Применение антибактериальных препаратов при дифтерийной инфекции .63
1.4.1. Характеристика, молекулярный механизм действия макролидных и линкозамидных антибактериальных препаратов и формирование резистентности к ним .64
1.4.2. Характеристика, молекулярный механизм действия рифампицина и формирование резистентности к нему .69
1.4.3. Резистентность штаммов C.diphtheriae к антибактериальным препаратам .75
Результаты собственных исследований
ГЛАВА 2. Антибиотикочувствительность штаммов C.diphtheriaе, выделенных на территории России .78
2.1. Изучение антибиотикочувствительности штаммов C.diphtheriaе с помощью диско-диффузионного метода Кирби-Бауэра и Е-теста .78
2.2. Изучение молекулярных механизмов резистентности к макролидным антибиотикам у штаммов C.diphtheriaе 83
2.3. Изучение молекулярных механизмов антибиотикорезистентности у штаммов C.diphtheriaе к рифампицину 88
ГЛАВА 3. Полноразмерное секвенирование генома мультирезистентного токсигенного штамма С.diphtheriae .100
ГЛАВА 4. Мультилокусное секвенирование штаммов С.diphtheriae, выделенных в России 107
4.1. Генотипирование штаммов C.diphtheriaе с помощью МЛСТ 107
4.2. Филогенетический анализ различных сиквенс-типов штаммов C.diphtheriaе .119
ГЛАВА 5. Изучение особенностей структуры генов tox и dtxR штаммов С.diphtheriae .124
5.1. Изучение особенностей структуры гена tox штаммов С.diphtheriae 124
5.2. Изучение особенностей структуры гена dtxR штаммов С.diphtheriae 133
Заключение
Выводы 160
Практические рекомендации .161
Перспективы дальнейшей разработки темы .161
Список сокращений .163
Список литературы .
- Методы изучения и типирования C.diphtheriae
- Характеристика, молекулярный механизм действия рифампицина и формирование резистентности к нему
- Изучение молекулярных механизмов резистентности к макролидным антибиотикам у штаммов C.diphtheriaе
- Филогенетический анализ различных сиквенс-типов штаммов C.diphtheriaе
Методы изучения и типирования C.diphtheriae
Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit («Thermo SCIENTIFIC», Литва) согласно инструкции производителя. В 1мл физиологического раствора суспендировали суточную культуру С.diphtheriae с 2 чашек Петри до образования однородной взвеси в концентрации не менее 109. После чего центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 мин. К осадку добавляли 250 мкл буфера S1+RNAse и суспендировали до полного его растворения. Добавляли 250 мкл лизирующего буфера и аккуратно перемешивали. Инкубировали при комнатной температуре 5 мин, затем добавляли 350 мкл нейтрализирующего буфера и осторожно перемешивали. Центрифугировали в течение 5 мин при 12000 об/мин. Соединяли колонку, входящую в набор, с пробиркой на 2 мл и на колонку переносили надосадочную жидкость. Центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин. Удаляли жидкость из нижней пробирки. На колонку добавляли 500 мкл отмывочного буфера и центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин. Удаляли жидкость из нижней пробирки. Центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин, после чего удаляли нижную пробирку и помещали колонку в чистый эппендорф. Добавляли 50 мкл элюирующего буфера на фильтр колонки. Выдерживали 2 мин при комнатной температуре и центрифугировали 2 мин при 12000 об/мин. Выделенную ДНК хранили при -200С до 6 мес.
Для выделения тотальной ДНК выращивали суточную культуру С.diphtheriae в 5 мл сердечно-мозгового бульона (BHI, «Conda С. А.» Pronadisa, Испания) с получением взвеси плотностью не менее 109 клеток/мл. Взвесь центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин и удаляли супернатант с помощью пипетки. Полученый осадок тщательно ресуспендировали в 1,5 мл TES до получения гомогенной суспензии. После чего суспензию переносили в эппендорфы и центрифугировали 5 мин при 15000 об/мин, удаляли супернатант. Полученый осадок тщательно ресуспендировали в 200 мкл смеси, состоящей из TES/сахарозы, лизоцима и мутанолизина. Выдерживали 1 час при 420С. Далее добавляли 3 мкл раствора РНКазы и выдерживали 30 мин при 370С. Добавляли 15 мкл раствора протеиназы К и оставляли в термостате при 370С на 16 часов. После чего добавляли 800 мкл лизирующего раствора, перемешивали переворачиванием, а потом вортексированием на низкой скорости, оставляли на 10 мин при 600С. Центрифугировали 10 мин при 15000 об/мин. Далее наносили супернатант двумя порциями по 500 мкл на колонку, каждый раз центрифугируя в собирательной пробирке при 10000 об/мин в течение 1 мин, и удаляли проскок. После чего дважды промывали колонку по 500 мкл промывочным буфером, каждый раз центрифугируя в собирательной пробирке. Удаляли проскок и выполняли дополнительное центрифугирование для осушения колонки. Переносили колонку в чистый эппендорф на 1,5 мл. Элюирование ДНК проводили раствором ТЕ-буфера. Для этого 50 мкл подогретого до 450С ТЕ-буфер нанесли на мембрану, инкубировали 2 мин при комнатной температуре и выполняли центрифугирование в собирательной пробирке на 2 мл при 10000 об/мин в течение 1 мин.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для выявления фрагментов генов, кодирующих резистентность к эритромицину (ermX) и рифампицину (rpoB), у штаммов С.diphtheriae Выявление фрагментов генов ermX и rpoB осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции, проводимой по протоколам [131, 135, 140] с нашей модификацией. Дизайн праймеров для амплификации фрагментов генов был осуществлен на основе информации, депонированной в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). ПЦР смесь содержала 1,5mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,0 мкМ каждого праймера, по 200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1 мкл ДНК и 1 ед. Taq DNA-полимеразы («Fermentas», Литва) в окончательном объеме 27 мкл. Последовательности праймеров для амплификации фрагментов генов ermX и rpoB: ErmX-FTTCCGTTGAGGAGGTCGT ErmX-R-CAAATCCAAGGAGCACACC rpoB 1F-ACGCAAGTCGTTCGCAAAG rpoB 1R-CAAAGCCTCGTCGGTATTA
Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей проводили в автоматическом режиме на термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», г. Москва). Детекцию результатов амплификации осуществляли путем горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле при 160V в течение 1 часа с последующим сравнением электрофоретической подвижности специфических светящихся фрагментов амплифицированных продуктов с подвижностью фрагментов маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Учет результатов реакции осуществлялили с помощью гель-документирующей системы «Vilber Lourmat Quantum ST-4-1100/26M». Наработанные фрагменты нуклеотидных последовательностей подвергали последующему секвенированию.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для выявления фрагментов гена tox у нетоксигенных штаммов С.diphtheriae Выявление фрагментов гена tox у нетоксигенных штаммов С.diphtheriae проводили с помощью коммерческой тест-системы “Ампли-Сенс-ПЦР” ("Интерлабсервис", г. Москва). Данная тест-система позволяет идентифицировать фрагмент гена дифтерийного токсина (tox) длиной 360 п.н. Приготовление реакционной смеси, амплификацию ДНК и детекцию результатов ПЦР осуществляли в соответствии с инструкцией производителя, которая в настоящее время снята с производства. Также выявление фрагмента гена tox у нетоксигенных штаммов С.diphtheriae осуществляли в соответствии с опубликованным протоколом [250] и использованием пары праймеров: F-5 – ATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCA-3 R-5 - GAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAA-3 для секвенирования целевого гена размером 248 п.н. ПЦР смесь содержала 1,5mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,0 мкл каждого праймера, по 200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1 мкл ДНК и 1 ед. Taq DNA-полимеразы («Fermentas», Литва) в окончательном объеме 27 мкл. Амплификцию проводили на термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Москва) в автоматическом режиме: 960С – 2 мин, 940С – 15 сек, 500С – 15 сек, 720С – 30 сек (30 циклов), 720С – 10 мин. Детекцию результатов амплификации осуществляли путем горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле при 160V в течение 1 часа с последующим сравнением электрофоретической подвижности специфических светящихся фрагментов амплифицированных продуктов с подвижностью фрагментов маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Учет результатов реакции осуществлялили с помощью гель-документирующей системы «Vilber Lourmat Quantum ST-4-1100/26M».
Характеристика, молекулярный механизм действия рифампицина и формирование резистентности к нему
Модификация проницаемости клеточной стенки микроорганизмов может быть обусловлена двумя механизмами: снижением проницаемости клеточной стенки и усилением экспрессии мембранносвязанных эффлюксных насосов. Мультирезистентность Mycobacterium обусловлена как мутационными процессами, так и особенностями самой микробной клетки низкой проницаемостью ее клеточной стенки за счет липидных компонентов и повышенного выброса антибиотика из клетки [245, 285, 286, 296,]. Было установлено, что у Mycobacterium intracellulare РНК-полимераза чувствительна к рифампицину, однако отмечается сниженная проницаемость клеточной стенки микроорганизмов к данному антибиотику [201]. Siddiqi A. с соавторами [177, 285] показали взаимосвязь между устойчивостью к антибиотикам и уровнем транскрипции гена rv1258c M.tuberculosis. Установлено, что уровень транскрипции гена rv1258c увеличивается в 10 раз при условии роста микроорганизма в присутствии рифампицина и офлоксацина. Подобные результаты позволяют предполагать, что эффлюксные насосы активируются в ответ на антибиотикотерапию. Оперон mtr N.gonorrhoeae кодирует систему эффлюксного насоса, состоящего из белков MtrCDE [192, 223]. Данный насос обеспечивает транспорт различных антибиотиков из клетки, мутации в гене mtrR способствуют повышенной экспрессии эффлюксного насоса.
Пенициллины и макролиды стали применяться для лечения дифтерийных бактерионосителей и дифтерии (с целью ингибирования размножения возбудителя и уменьшения продукции им токсина) еще в 1950 76 х годах. Первые результаты изучения чувствительности штаммов C.diphtheriae к пенициллину и эритромицину показали, что значения минимальной подавляющей концентрации (МПК) могут варьировать в достаточно широких пределах [179, 319]. McLaughlin с соавт. [232] усовершенствовали методику постановки антибиограммы и показали отсутствие корреляции между биологическими свойствами C.diphtheriae (биовар, способность к продукции токсина) и их чувствительностью к антибиотикам.
Штаммы C.diphtheriae, резистентные к эритромицину, были впервые выявлены в начале 1970-х годов в Сиетле (США) и Канаде у больных с кожной формой дифтерии [207, 253]. К этому же периоду относится и первое сообщение об обнаружении в Индонезии значительного числа штаммов C.diphtheriae (до 86%), резистентных к тетрациклинам. Данные штаммы также были выделены от больных с кожной формой заболевания [271].
В дальнейшем были описаны случаи выделения в разных странах мира штаммов C.diphtheriae, резистентных к пенициллину, оксациллину, тетрациклину, эритромицину, рифампицину и клиндамицину [14, 24, 25, 52, 53, 66, 174, 185, 214, 224, 237, 251, 252, 255, 271, 310]. В настоящее время отмечается тенденция к росту штаммов C.diphtheriae, резистентных к пенициллину. Пропорция таких штаммов достигает 15% [251, 255, 310]. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о снижении чувствительности к эритромицину и циркуляции до 27% штаммов C.diphtheriae, резистентных к этому препарату, причем наибольший процент таких штаммов регистрируется у больных с кожной формой дифтерии и дифтерийных бактерионосителей [185, 213, 214, 224, 237, 251, 310]. Кроме того, выявляется до 17% штаммов C.diphtheriae, резистентных к клиндамицину. В большинстве случаев резистентность к клиндамицину коррелирует с устойчивостью к эритромицину [185, 226, 227, 251]. По данным исследований отечественных авторов, проведенных в прошлые годы, для штаммов C.diphtheriae регистрируются рост МПК эритромицина до 23% и МПК пенициллина до 21% [24, 25, 52, 53].
Представленные данные свидетельствуют о том, что в последние десятилетия накоплен значительный потенциал знаний о биологии возбудителя дифтерии и особенностях формирования его популяции. К настоящему времени разработана система мониторинга штаммов C.diphtheriae, включающая использование не только классических микробиологических, но и молекулярно-генетических методов исследования. Показана динамика изменения биологических свойств штаммов C.diphtheriae, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции: смена биоваров, варьирование уровня токсинообразования, клональный состав популяции штаммов в риботипировании, УП-ПЦР и МЭЭ, особенности структуры генов патогенности. Вместе с тем высокотехнологичные молекулярно генетические технологии, высокопроизводительное секвенирование и достижения метагеномики и сравнительной геномики позволяют получить новые данные и расширить знания о биологии возбудителя дифтерийной инфекции.
Достигнут значительный прогресс в изучении природы и расшифровке молекулярных механизмов резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Однако бесконтрольное применение антибактериальных препаратов не только для лечения, но и для профилактики различных инфекционных заболеваний, а также реализация передачи генетической информации между различными видами микроорганизмов приводит к формированию и широкому распространению антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов. Вместе с тем в последние десятилетия распространенность резистентных штаммов C.diphtheriae к макролидам и рифампицину и молекулярные механизмы их резистентности к этим антибиотикам остаются не изученными
Изучение молекулярных механизмов резистентности к макролидным антибиотикам у штаммов C.diphtheriaе
Следовательно, с помощью мультилокусного секвенирования было установлено, что для штаммов С.diphtheriaе биовара mitis отмечается более выраженая гетерогенность по принадлежности к сиквенс-типам, чем для штаммов биовара gravis.
Далее нами проанализированы данные о принадлежности токсигенных и нетоксигенных штаммов С.diphtheriaе двух биоваров к сиквенс-типам. Оказалось, что для токсигенных и нетоксигенных штаммов различных биоваров характерны определенные сиквенс-типы. Так, токсигенные штаммы С.diphtheriaе биовара gravis принадлежали к 14 сиквенс-типам: ST8, ST12, ST18, ST19, ST25, ST32, ST43, ST44, ST66, ST-new1, ST-new2, ST-new4, ST new6, ST-new8. Токсигенные штаммы С.diphtheriaе биовара mitis принадлежали к 13 сиквенс-типам: ST5, ST17, ST24, ST28, ST41, ST45, ST46, ST48, ST53, ST60, ST67, ST-new3, ST-new7. Нетоксигенные штаммы С.diphtheriaе биовара gravis относились к ST62. Нетоксигенные штаммы С.diphtheriaе биовара mitis принадлежали к 8 сиквенс-типам: ST29, ST30, ST40, ST47, ST76, ST202, ST-new5, ST-new9. Отдельную группу составляли НТТН-штаммы С.diphtheriaе, которые разделились на два сиквенс-типа ST40 и ST76. Следовательно, прослежена прямая взаимосвязь между фенотипическими свойствами (токсигенность и биовар) и принадлежностью штаммов С.diphtheriaе к определенному сиквенс-типу. Для большинства токсигенных штаммов С.diphtheriaе биовара gravis были характерны два сиквенс-типа - ST25 (к нему относилось 33 штамма) и ST8 - 27 штаммов (Рисунок 26); 3 токсигенных штамма С.diphtheriaе биовара gravis относились к ST-new1, к остальным 11 сиквенс-типам принадлежали единичные штаммы. 33 27 111 1111 gj 1111
Среди токсигенных штаммов С.diphtheriaе биовара mitis преобладали четыре сиквенс-типа: большинство штаммов (13 штаммов) относились к ST5, 9 штаммов – к ST24, 7 штаммов - к ST28, 4 штамма - к ST46, 3 - к ST-new3, 2 - к ST-new7, остальные сиквенс-типы встречались в единичных случаях (Рисунок 27).
Нетоксигенные штаммы С.diphtheriaе биовара mitis разделились следующим образом: большинство штаммов (8 штаммов) относились к ST76, 4 штамма - к ST30, 2 - к ST40, все остальные сиквенс-типы встречались в единичных случаях (Рисунок 28).
Частота встречаемости нетоксигенных штаммов С.diphtheriaе биовара mitis различных сиквенс-типов Ранее многолетними исследованиями, проведенными в ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора с помощью молекулярно–генетических методов - риботипирования, мультилокусного энзимного электрофореза (МЭЭ), УП-ПЦР изучена структура популяции штаммов C.diphtheriae циркулировавших на территории России, и показана её клональность в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции.
Учитывая небольшое количество изученных штаммов С.diphtheriaе, мы предприняли попытку проанализировать распространение штаммов С.diphtheriaе различных сиквенс-типов в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции. С этой целью все изученные штаммы С.diphtheriaе были разделены на шесть групп. В первую группу вошли штаммы С.diphtheriaе, выделенные в допрививочный период и первые десять лет проведения массовой иммунизации (1957 - 1969 гг.), во вторую группу -штаммы С.diphtheriaе, выделенные в 1970 - 1979 гг., в третью группу -штаммы С.diphtheriaе, выделенные в 1980 – 1989 гг., в четвертую группу -штаммы С.diphtheriaе, выделенные в период подъема и начала снижения заболеваемости дифтерией (1990 – 1999 гг.). Пятая группа состояла из штаммов С.diphtheriaе, выделенных в 2000 – 2009 гг., и в шестую группу вошли штаммы С.diphtheriaе, выделенные в последние шесть лет (2010 - 2015 гг.) (Рисунок 29).
Среди штаммов С.diphtheriaе, выделенных в 1957 - 1969 гг., были зарегистрированы штаммы четырех сиквенс-типов - ST25, ST5, ST19 и ST62. Из них большинство штаммов (83,0%) принадлежало к биовару gravis и сиквенс-типу ST25, который характерен для контрольного токсигенного штамма С.diphtheriaе № 665, выделенного в 1960-е годы. Изученные токсигенные штаммы С.diphtheriaе принадлежали к трем сиквенс-типам, из которых штаммы биовара gravis относились к двум сиквенс-типам - ST19 и ST25, а штаммы биовара mitis - к одному сиквенс-типу ST5.
Среди штаммов С.diphtheriaе, выделенных в 1970 - 1979 гг., были зарегистрированы штаммы шести сиквенс-типов - ST25, ST5, ST24, ST-new2, ST32 и ST202. Токсигенные штаммы С.diphtheriaе принадлежали к пяти сиквенс-типам - ST25, ST-new2, ST32, ST5 и ST24. Среди них токсигенные штаммы С.diphtheriaе биовара gravis были представлены тремя сиквенс-типами - ST25, ST-new2 и ST32. У токсигенных штаммов С.diphtheriaе биовара mitis зарегистрированы два сиквенс-типа - ST5 и ST24. В этот период среди циркулирующих штаммов С.diphtheriaе также преобладали штаммы С.diphtheriaе биовара gravis сиквенс-типа ST25, но их удельный вес к концу 1970-х годов несколько снизился и увеличился удельный вес штаммов биовара mitis сиквенс-типа ST5.
Филогенетический анализ различных сиквенс-типов штаммов C.diphtheriaе
При секвенировании полученных ПЦР-продуктов гена rpoB, полученных с праймерами rpoB-3F – rpoB-3R и rpoB-4F – rpoB-4R, у всех резистентных штаммов С.diphtheriae обнаружены мутационные изменения в 29 позициях, из которых в 26 позициях мутационные изменения не затрагивали кодоны аминокислот. Однако в трех позициях - 1291, 1307 и 1484 выявлены мутации, затрагивающие кодоны аминокислот – гистидина (Н) на аспарагин (N) в положении Н431N; серина (S) на фенилаланин (F) или серина (S) на тирозин (Y) в положении S436F или S436Y, соответственно; пролина (Р) на лейцин (L) или пролина (Р) на глутамин (Q) в положении Р495L или Р495Q, соответственно. Причем наиболее часто (у 78,6% штаммов) мутации регистрировались в двух позициях 1307 и 1484 гена rpoB. Следовательно, молекулярный механизм резистентности штаммов С.diphtheriae к рифампицину обусловлен мутационными изменениями в трех позициях гена rpoB - 1291, 1307 и 1484, затрагивающих кодоны аминокислот H431N, S436F, S436Y, P495L и P495Q в -субъединице РНК-полимеразы, которые, как и у других микроорганизмов [140], локализуются в центральной части полипептида в 1 кластере.
Так как постоянная циркуляция возбудителя дифтерии среди населения России и других стран мира [36] свидетельствует о существовании угрозы возникновения вспышек дифтерийной инфекции, а результаты исследований указывают на достаточно высокий уровень распространенности штаммов C.diphtheriae, устойчивых к антибиотикам, целесообразно продолжать мониторинг антибиотикорезистентности штаммов, что позволит клиницистам правильно оценивать потенциальную эффективность лекарственных препаратов. который впервые был подвергнут полноразмерному секвенированию. Данный штамм, по результатам определения антибиотикочувствительность диско-диффузионным методом и Е-тестом, был резистентным к пенициллину, ампицилину, эритромицину, азитромицину, линкомицину и клиндамицину. Секвенирование генома штамма C.diphtheriae производилось на платформе 454 GS Junior, сборка осуществлялась при помощи программного обеспечения Newbler v. 2.7 (http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=20588). В результате сборки получено 36 контигов размером от 780 до 840 954 п.н. Суммарная длина полученной геномной последовательности составила 2 492 191 п.н., среднее покрытие прочтениями было равно 31x. GC-состав равен 53.5%, что соответствует данным о других представителях вида C. diphtheriae (53.3%-53.7% в штаммах, представленных в NCBI Genome). Общее число генов составило 2 321, также алгоритмом аннотации было обнаружено 42 псевдогена.
Полногеномное выравнивание последовательности штамма C.diphtheriae 17801 с финализированными геномами 13 штаммов C.diphtheriae, аннотированными в базе данных GenBank/NCBI. Показало, что представленные геномы C.diphtheriae имеют очень высокий уровень гомологии между собой. Наиболее близким родственником оказался штамм C.diphtheriae NCTC 13129 биовара gravis, выделенный во время эпидемической вспышки в Великобритании в 1997 г. Уровень сходства выровненных последовательностей данных штаммов составил 98,2%. Однако анализ обоих пар локусов CRISPR, у этих штаммов, показал что они дивергировали от общего предка приблизительно в одно и тоже время.
С целью мониторинга патогенных свойств нами продолжены ранние исследования [41, 43, 44] по изучению у циркулирующих штаммов С.diphtheriae особенностей структуры детерминант - генов tox и dtxR, кодирующих дифтерийный токсин и его регуляторный DtxR белок. Изучены особенности структуры гена tox у 16 токсигенных штаммов С.diphtheriae, выделенных в различных регионах России в 2010 – 2015 гг. С этой целью проведена ПЦР с четыремя парами специфических праймеров, используемых для секвенирования целевого гена tox. После секвенирования фрагментов гена tox идентифицированные нуклеотидные последовательности сопоставлены с нуклеотидными последовательностями гена tox 12 штаммов С.diphtheriae, опубликованными в EMBL/GenBank. Были выявлены мутации в 6 позициях гена tox – (-58), (-19), 913, 1083, 1233 и 1590, из которых две мутации (-58) и (-19) локализовались в промоторной области гена tox и четыре мутации в позициях 913, 1083, 1233 и 1590 – в В субъединице гена. При сравнении полученных результатов с данными [41, 43] об особенностях структуры гена tox штаммов C.diphtheriae, выделенных в прошлые годы, оказалось, что у современных токсигенных штаммов, так же как и штаммов, выделенных в прошлые годы, нами выявлены замена нуклеотида С на Т в позиции (-58) промоторной области гена tox, замены нуклеотидов G на A в позициях 1083, 1233 и 1590 области, кодирующей В субъединицу, не затрагивающие кодоны аминокислот. Нами также у современных штаммов C.diphtheriae не обнаружено мутаций в А фрагменте гена tox - замена нуклеотида Т на С в позиции 415 и в 3 некодирующей области гена - замена Т на С в позиции 1704, которые были отмечены у штаммов прошлых лет, и также не зарегистрирована мутация в гене tox, выявленная у двух токсигенных штаммов биовара mitis риботипа Otchakov , в положении 1252 - замена глицина на аргинин в положении 393 (G393R) в R домене В субъединицы дифтерийного токсина. В то время как у современных штаммов C.diphtheriae выявлена дополнительная мутация в промоторной области гена tox - замена нуклеотида C на G в позиции (-19) и у четырех штаммов была обнаружена мутация в одной позиции 913, затрагивающая кодон аминокисоты А305Т в Т домене В субъединицы, который отвечает за трансмембранный перенос А субъединицы дифтерийного токсина в клетку макроорганизма. Однако, анализ трехмерной структуры, расположенной в базе данных PDB (идентификатор 1F0L), показал, что замена А305Т находится в альфа-спирали, и его радикал расположен на поверхности белковой глобулы и, по-видимому, не приводит к значительным изменениям третичной структуры белка, хотя потенциально способна влиять на его функционирование.