Введение к работе
Актуальность проблемы. Повышенный интерес исследователей к представителям рода Rhodococcus (Zopf 1891) Goodfellow and Alderson 1977 обусловлен широкими метаболическими возможностями родококков, осуществляющих деградацию большого спектра органических загрязнителей и биосинтез практически ценных соединений.
Становление таксономической структуры данного рода еще не завершено, имеют место случаи переноса отдельных видов Rhodococcus в другие таксоны, а также описание новых штаммов и видов родококков (Briglia et al., 1994, 1996; Stoecker et al., 1994; Rayney et al., 1995). По-прежнему остро стоит проблема классификации новых видов в пределах изучаемого рода и объективной идентификации свежевыделенных изолятов. Предложенная классификация родококков на основе изучения генетических и хе-мотаксономических свойств трудоемка. В этой связи поиск новых надежных таксономических признаков сохраняет актуальность. Среди таксономических критериев, применяемых в видовой диагностике Rhodococcus spp., представляется перспективным использование анализа чувствительности бактериальных культур к антибиотическим веществам различной природы и спектра действия.
Основная биологическая особенность алканотрофных родококков - способность использовать в качестве единственного источника углеродного питания газообразные и жидкие я-алханы. Потребление родококками углеводородных субстратов во многом определяет своеобразие их структурной и метаболической организации, способствует появлению новых физиологических свойств (Ившина и др., 1987, 1996). В этой связи представляет интерес сравнительное изучение чувствительности родококков к антибиотическим веществам при культивировании в присутствии н-алканов и на средах без них.
Пропанокисляющие родококки относятся к трудноизолируемой группе организмов, получение которых в чистой культуре требует больших затрат труда и времени, поскольку в накопительной культуре они растут в виде микробных сообществ с быстрорастущими спутниковыми бактериями, не усваивающими газообразные н-алканы и тормозящими развитие родококков. Это обусловливает необходимость создания не только элективных, но и селективных условий при изоляции пропанокисляющих родококков. Разработка метода селективного выделения газоокисляющих родококков представляется возможной после изучения антибиотикочувствительности природных ассоциаций, развивающихся в присутствии пропана (н-бутана) как единственных источников углерода.
Цель настоящей работы - изучение резистентности бактерий рода Rhodococcus к антибиотическим веществам различной природы и механизма действия.
Конкретные задачи исследования:
-
Оценка возможности использования показателей антибио-тикочувствительности в качестве дополнительного критерия видовой дифференциации бактерий рода Rhodococcus, в частности разработка диагностических критериев для разделения труднодиффе-ренцируемых близкородственных видов родококков.
-
Изучение влияния состава среды и условий культивирования алканотрофных родококков на их чувствительность к антибиотическим веществам различного биологического происхождения и механизма действия.
-
Исследование механизмов антибиотикорезистентности родококков в условиях их роста на н-алканах.
-
Модификация метода выделения алканотрофных родококков из природных образцов путем разработки селективных питательных сред с добавлением антибиотических соединений.
Научная новизна работы. Исследована чувствительность значительного числа коллекционных и евежевыделенных из контрастных экосистем штаммов родококков к большому набору антибиотических веществ различного механизма и спектра действия. Показано, что анализ антибиотикочувствительности может служить таксономическим критерием видовой диагностики Rhodococcus spp.
Подтверждена зависимость чувствительности родококков к антибиотикам от используемого источника углеродного питания. Установлено повышение антибиотикорезистентности родококков, культивируемых на минеральных средах в присутствии газообразных и жидких н-алканов, по сравнению с организмами, растущими на богатых питательных средах. Выявлены механизмы резистентности, связанные с изменением липидной структуры бактериальной клеточной оболочки и повышением активности окислительных ферментных систем родококков, осуществляющих деструкцию и инактивирование антибиотиков.
Изучена антибиотикочувствительность естественных бактериальных ассоциаций, развивающихся в присутствии пропана. Установлено, что пропанокисляющие родококки обладают повышенной устойчивостью к ряду антибиотиков по сравнению со спутниковыми негазоокисляющими эубактериями. Данные антибиотические соединения использованы при создании селективных условий выделения родококков из природных сред.
Практическое значение. Определены таксономически значимые антибиотики, тесты на чувствительность к которым предложены в качестве новых дифференцирующих критериев для разделения близкородственных видов родококков: R."longus" и R.opacus; R.rhodochrous и R.ruber. Предложенные тесты, отличающиеся простотой постановки и высокой воспроизводимостью результатов, рекомендованы для включения в диагностические ключи определения данных видов Rhodococcus.
Разработаны селективные среды для эффективной изоляции пропанокисляющих родококков из природных популяций. Разработанные среды могут быть успешно использованы в экологических исследованиях данной группы бактерий, а также при культивировании смешанных культур родококков в нестерильных производственных условиях. Получено положительное решение ВНИИГПЭ от 10.07.97 на выдачу патента 96124751 «Способ селективной изоляции пропанокисляющих родококков».
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Антибиотикочувствительность бактерий рода Rhodococcus является объективным дополнительным критерием при определении видовой принадлежности родококков, подтвержденным результатами генетического анализа с использованием видоспецифической поли-меразной цепной реакции.
-
В условиях углеводородного питания происходит неспецифическое увеличение антибиотикоустойчивости родококков, коррелирующее с изменением липиднои структуры их клеточной оболочки и обусловленное повышением активности бактериальных окислительных ферментных систем.
-
Для эффективного выделения алканотрофных родококков из природных образцов рекомендуются селективные питательные среды с добавлением оптимальных концентраций индивидуальных антибиотических веществ и комбинаций антибиотиков.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме «International Symposium on Subsurface Microbiology - ISSM'93», Бат, Великобритания, 1993; Конференции молодых ученых «Механизмы поддержания биологического разнообразия», Екатеринбург, 1995; Международной конференции «Microbial Diversity: current situation, conservation strategy, and ecological aspects -ICOMID'96», Пермь, 1996. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и
4 16 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, обсуждения и выводов. Список литературы включает 245 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.