Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Хитин и хитозан: химическое строение и свойства 10
1.2. Хитозан - источник хитоолигосахаридов
1.2.1. Ферментативное получение хитоолигосахаридов 14
1.2.2. Способы получения хитоолигосахаридов
1.2.2.1. Кислотный гидролиз хитозана 15
1.2.2.2. Химический синтез хитоолигосахаридов 16
1.3. Антибактериальные и антимикотические свойства хитозана 18
1.3.1. Действие хитозана на грамотрицательные бактерии 20
1.3.2. Действие хитозана на грамположительные бактерии 26
1.3.3. Действие хитозана на микроскопические грибы
1.4. Чувствительность микроорганизмов к хитозану 35
1.5. Влияние структуры на биоцидные свойства хитозана
1.5.1. Биоцидные свойства наночастиц хитозана 45
1.5.2. Биоцидные свойства производных хитозана
1.6. К проблеме условий определения антимикробных свойств 53
1.7. К проблеме характеристики хитозанов 56
2. Экспериментальная часть материалы и методы исследования результаты исследований 67
1. Оценка растворимости хитозана в зависимости от его молекулярной массы и рН среды
2. Подбор буферной системы 72
3. Антибактериальные и антимикотические свойства олигохитозанов
3.1. Антибактериальные свойства олигохитозанов 74
3.2. Антимикотические свойства олигохитозанов в отношении дрожжеподобных и мицелиальных грибов
3.3. Антибактериальные свойства ацильных производных хитозана
3.4. Влияние рН на антибактериальные свойства олигохитозанов с различной молекулярной массой
3.5. Влияние хитозана на морфологию бактериальных клеток 90
3.6. Оценка влияния хитозана на проницаемость цитоплазматической мембраны
3.7. Оценка активации олигохитозанами лизостафина 96
3.8. Влияние хитозана на морфологию дрожжеподобных грибов 97
3.9. Влияние хитозана на морфологию мицелиальных грибов 102
3. Обсуждение результатов
1 1. Характеристика растворимости низкомолекулярных и олигомерных форм хитозанов
2. Антибактериальная активность олигохитозанов 105
3. Антимикотическая активность олигохитозанов 113
Выводы 116
Список литературы 118
- Хитозан - источник хитоолигосахаридов
- Действие хитозана на микроскопические грибы
- Подбор буферной системы
- Антибактериальные свойства ацильных производных хитозана
Хитозан - источник хитоолигосахаридов
Существует ряд методов получения хитозана и хитоолигосахаридов непосредственно из биологических источников, например из клеточных стенок некоторых грибов. Однако коммерчески доступным является хитозановыи полимер, полученный в результате гетерогенного процесса деацетилирования.
Хитозан может быть получен из хитина двумя принципиально разными методами — в условиях гомогенного и гетерогенного процесса [Sannan et al., 1976].
В первом случае хитин растворяется в щелочном растворе в процессе деацетилирования при интенсивном перемешивании. Обычно этот процесс происходит при низких температурах. В случае гетерогенного процесса хитин подвергают деацетилированию в горячем щелочном растворе, где процесс отщепления от полимера ацетильных остатков происходит только на поверхности твёрдого хитинового субстрата. При деацетилировании хитина в гомогенных условиях расположение ацетилированных и деацетилированных углеводных остатков в полимерной цепи будет иметь случайное распределение в соответствии с распределением Бернулли. Тогда как в случае гетерогенного процесса получаемый хитозан имеет в своём составе неравномерное распределение двух разных видов мономерных остатков.
Несмотря на наличие ряда работ, указывающих на тот факт, что в случае гетерогенного деацетилирования также могут образовываться полимеры хитозана со случайным распределением двух разных мономерных остатков, используемые в таких случаях методы ЯМР-спектроскопии также не могут дать точный ответ на данный вопрос в связи с возможностью детекции только среднего распределения в исследуемом образце. Это означает, что хитозан, полученный при гетерогенном процессе, может содержать области с повышенной степенью ацетилирования, представляющие собой блоки из областей исходного хитина с повышенной кристаллической макроструктурой.
Годовой объем синтеза хитина в природе составляет порядка ІО МО11 тонн в год. Количество хитина, хитозана и их производных, которое используются или производятся в промышленных процессах, в последние годы ежегодно составляет порядка 30 000 тонн для хитина и около 10 000 тонн для хитозана. Большая доля хитина находит примененние в качестве сырья для производства моносахарида -глюкозамина, который является довольно распространенной пищевой добавкой в США для облегчения боли при остеоартрите.
Практически всё производство хитозана из хитина основано на химических процессах, а ферментативные альтернативы, обладающие аналогичной эффективностью и себестоимостью, до сих пор не предложены. В качестве ферментативного метода возможно использование дезацетилаз [Hekmat et al., 2003], которые гидролизуют N-ацетильные связи и превращают ацетилглюкозамин в глюкозамин. Основной проблемой на пути использования данных ферментов лежит малая доступность субстрата ввиду высокой кристалличности исходного материала. Хитиндезацетилазы также могут быть использованы для изменения структуры N-ацетилирования молекул олигохитозанов. Хотя данная технология находится в зачаточном состоянии, однако её развитие представляется весьма перспективным. 1.2.1. Ферментативное получение хитоолигосахаридов Несмотря на распространённость химического метода получения хитоолигосахаридов, использование ферментативных технологий можно считать более перспективным при необходимости получения хитоолигосахаридов с заданными молекулярно-массовыми характеристиками и степенью деацетилирования. Специфичность хитозан-расщепляющих ферментов традиционно оценивалась по способности быстро расщеплять хитозан с последующей характеристикой получаемого низкомолекулярного продукта. Однако последние исследования показали, что кинетика реакции гидролиза такова, что химический состав продуктов реакции деполимеризации значительно варьирует в зависимости от стадии процесса. Поскольку различные ферменты имеют сродство к различным последовательностям ацетилированных и деацетилированных звеньев полимерной цепи хитозана, реакция деполимеризации может иметь сложную многостадийную кинетику, где по окончании каждой фазы образуются промежуточные продукты с определённой химической структурой, которые существенно отличаются от продуктов других фаз процесса. При этом динамика процесса гидролиза каждого последующего промежуточного продукта может существенно отличаться друг от друга. В целом это означает, что выбор исходного образца хитозана, фермента или ферментного препарата, а также выбор условий и режима процесса деполимеризации оказывает существенное влияние на конечный продукт, что также указывает на возможность регулирования в нужном направлении протекающего процесса [Sikorski et al., 2005], о чём свидетельствует также наличие многочисленных публикаций по данной теме [Sikorski et al., 2005; Heggset et al., 2009; Sasaki et al., 2006].
Для деполимеризации хитозана также возможно использование неспецифических ферментов, в первую очередь целлюлаз, а также некоторых протеаз и липаз [Sashiwa et al., 2003; Terbojevich et al., 1996; Xie et al., 2010]. В ряде случаев авторы используют неочищенные ферментные препараты, которые могут содержать примеси энзимов с искомой ферментативной активностью, в связи с чем способность этих ферментов расщеплять некоторыми исследователями ставится под сомнение. Тем не менее, использование таких дешёвых ферментных препаратов может оказаться полезным для практического получения хитоолигосахаридов.
Действие хитозана на микроскопические грибы
В последние годы резко возрос интерес к наночастицам самой разнообразной химической природы, в том числе и на основе хитозанового полимера [Ильина с соавт, 2008]. Особенность таких частиц состоит в том, что их размер соизмерим с радиусом действия сил межатомного взаимодействия, то есть с расстоянием, на которое должеы быть удалены атомы частицы, чтобы их взаимодействие не сказывалось на их свойствах в значительной степени. Поэтому наночастицы взаимодействуют между собой и объектами окружающей среды иначе, нежели макрочастицы, в чём и проявляются особенности их свойств.
Антибиотические свойства наночастиц хитозана исследованы не достаточно. Показано, что наночастицы на основе хитозана проявляют антибактериальную активность в отношении E.coli, S.choleraesuis, S. typhimurium, S. aureus, при этом они были значительно более эффективными по сравнению с исходным хитозаном [Qi et al., 2004; Saita et al., 2012]. Под действием наночастиц наблюдалась агрегация бактериальных клеток, изменение морфологии клеточной стенки, нарушение барьерной функции мембран, выход электролитов и лизис клеток [Qi et al., 2004; Kong et al., 2008]. Как и у обычного хитозана антибактериальные свойства наночастиц связаны с аминогруппами, которые взаимодействовали с отрицательно-заряженными компонентами микробных клеток и хелатировали двухвалентные ионы металлов. Взаимодействие наночастиц с клетками кишечной палочки приводит к изменению микроструктуры внешного монослоя наружной мембраны, что проявляется в изменении конформации мембранных белков. При этом более сильное действие оказывают хитозановые наночастицы, содержащие остатки олеиновой кислоты, когда изменения структуры происходя во внутреннем монослое наружной мембраны [Qi et al., 2004; Kong et al., 2008].
Наночастицы на основе хитозана могут проявлять более сильное фунгицидные свойства в отношении дрожжеподобных и мицелиальных представителей грибного царства, чем исходные образцы полимера [Ing et al., 2012, Saita et al., 2012]. Антимикотическое действие таких наночастиц зависит от размера частиц и молекулярной массы используемых для их создания образцов хитозана. Наилучшие результаты по использованию хитозановых наночастиц были продемонстрированы в отношении С. albicans и Fusarium solani, ингибирование роста которых вызывали частицы на основе образцов с молекулярной массой и 70 и 310 кДа. Тогда как Aspergillus niger немного лучше, чем при использовании исходного хитозана, подавлялся только наночастицами на основе более высокомолекулярного образца.
Наноструктурирование хитозана не обязательно приводит только к усилению его биоцидных свойст. Имеются данные, свидетельствующие об обратном эффекте, когда наночастицы хитозана и его производных демонстрировали более низкую эффективность в подавлении роста золотистого стафилококка по сравнению с исходными веществами [Sadeghi etal., 2008].
Интенсивно проводятся исследования биологических свойств наноматериалов состоящих из комплекса полиэлектролитов с металлами и их солями. Созданы наночастицы хлорида палладия, стабилизированные хитозаном, обладающие повышенными антибактериальными свойствами в отношении S. aureus и Е. coli [Amarnath et al., 2012]. Наночастицы связываются с поверхностью клеток Е. coli и вызывают нарушение целостности внешней мембраны, что влечёт за собой разрушение клеточной стенки, выход цитоплазматического содержимого наружу и гибель клетки [Amarnath et al., 2012]. Наночастицы серебра обладают выраженными антибактериальными свойствами, однако наночастицы этого металла обладают нежелательными побочными эффектами, в числе которых гено- и цитотоксичность в отношении клеток человека, что проявляется в виде разрывов ДНК, аберрации хромосом, а в случае повышенной концентрации приводит клетки к гибели [Papageorgiou et al., 2007]. Поэтому является актуальным создание таких форм наночастиц серебра, которые обладают уменьшенным побочным эффектом в отношении клеток эукариот, но сохраняют высокую активность в отношении прокариот. Одним из таких решений стало создание наночастиц серебра покрытых хитозаном, что позволило сохранить высокие антимикробный свойства такого нанокомплекса в отношении S. aureus, Salmonella typhi, а также Mycobacterium smegmatis [Jena et al., 2012]. Такие наночастицы обладали низкой гено- и цитотоксичностью в отношении макрофагов человека и при этом вызывали гибель М. smegmatis находящихся внутри макрофагальных клеток. Наночастицы хитозана с серебром демонстрируют хорошую антибактериальную активность в составе текстильных материалов [Abdel-Mohsen et al., 2012].
Выраженными антибактериальными свойствами в обладают и наночастицы на основе хитозана, содержащие сульфат меди [Mallick et al., 2012]. Для предотвращения превращения сульфата меди в оксид под действием кислорода такие частицы также содержат йод. Такой комплекс подавляет рост культуры Е. coli гораздо сильнее, чем составляющие его вещества по отдельности, что свидетельствует о наличии у наноструктур особенностей взаимодействия с живыми клетками. Такие наночастицы эффективно связываются с мембранными структурами грамотрицательных клеток бактерий, в том числе с сульфосодержащими белками внешней мембраны, вызывают в ней многочисленные разрывы, приводящие актериальную клетку к гибели (рис. 2). Повышенными антибактериальными свойствами обладали наночастицы, содержащие медь, также в отношении S. choleraesuis, S. typhimurium и S. aureus [Qi et al., 2004].
Подбор буферной системы
Другую группу хорошо растворимых образцов составляют олигохитозаны со степенью полимеризации от 20 до 32. Для них показатель рКа составляет 6,5. Данные образцы, в отличие от вышеуказанных, образовывали в слабощелочных условиях заметное количество осадка, однако, не сразу, а по прошествии нескольких часов.
К последней группе можно отнести все образцы со степенью полимеризации около 50 и выше, в том числе исходный высокомолекулярный хитозан, которые имеют самый низкий уровень значений рКа, равный 6,4.
Таким образом, на первоначальном этапе экспериментальной работы было установлено, что имеющиеся образцы хитозана обладают различной растворимостью в нейтральных и слабощелочных водных растворах. Растворимость образцов зависит от их молекулярной массы и тесно связана с уровнем их рКа. Данный показатель характеризует способность хитозанового полимера связывать диссоциированные протоны своими свободными аминогруппами, благодаря чему он приобретает свойства поликатиона
Хитозан, представляющий собой природный сополимер ацетилглюкозамина и глюкозамина, объединяет гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени ацетилирования (деацетилирования), расположению ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости и значению рКа [Singla and Chawla, 2001; Tharanathan and Kittur, 2003]. Именно этим обусловлены наблюдаемые различия физико-химических свойств рассматриваемых образцов хитозанов, а также их биологическая активность. Поэтому для проведения детального исследования некоторых биологических свойств хитозанового полимера, в том числе его антибактериальной активности, возникает необходимость использования сравнительно широкого диапазона условий внешней среды.
Для хитозана, являющегося поликатионом, одним из наиболее существенных параметров внешней среды является её кислотность, от которой зависит заряд полимера, его растворимость и способность образовывать надмолекулярные ассоциаты. Так как обычно антибактериальные свойства веществ оценивают при значениях кислотности близких к нейтральным, возникла необходимость поиска буферной системы, позволяющей проводить исследования в условиях от умеренно кислых до умеренно щелочных. Для решения данной задачи были подобраны несколько органических кислот, каждая из которых по отдельности может быть использована для приготовления раствора, способного поддерживать стабильный уровень кислотности в узком диапазоне значений рН (рис. 6.). Подбор органических кислот с частично перекрывающимися буферными диапазонами - для MES от 5,50 до 6,70, для ACES от 6,10 до 7,50, для TES от 6,80 до 8,20, позволил получить буферную систему на основе их смеси, позволяющую готовить растворы одинакового химического состава, способные поддерживать стабильный уровень рН в широком диапазоне значений - от 5,50 до 8,20
Проведение потенциометрического титрования растворов хитозанов выявило различие в значениях рКа для образцов с разной степенью полимеризации (табл. 6).
Как видно из табл. 6 при увеличении степени полимеризации с 4 до 49 уровень рКа снижается с 7,1 до 6,4. При дальнейшем увеличении степени полимеризации хитозана данный показатель остаётся на одном уровне. Эти результаты, а также полученные данные о растворимости хитозанов, позволяют условно разделить используемые в данной работе образцы на две группы: олигохитозаны (в том числе олигомеры) со степенью полимеризации до 32 и низкомолекулярные хитозаны со степенью полимеризации более 32. Таблица 6. Характеристика образцов хитозана
Минимальную ингибирующую (бактериостатическую) и бактерицидную концентрацию низкомолекулярных хитозанов и олигохитозанов определяли с использованием растворов, имеющих различную концентрацию вещества, подготовленных методом двойных разведений, с дальнейшей оценкой роста культуры и подсчёта живых клеток бактерий. Определение антибактериальной активности хитозанов было проведено как на грамотрицательных, так и на грамположительных бактериях. Установлено, что различные виды бактерий обладают различной чувствительностью к хитозану. Наиболее чувствительным оказался S. epidermidis, для которого минимальная ингибирующая и бактерицидная концентрации некоторых хитозанов оказалась менее 1 мкг/мл (табл. 7). Повышенную чувствительность к хитозану проявляла К. рпеитопеае. Для остальных бактерий минимальные ингибирующие концентрации составляли более 100 мкг/мл.
Не было выявлено различий в чувствительности к хитозану бактерий в зависимости от строения клеточной стенки. Несмотря на то, что S. epidermidis обладал очень высокой чувствительностью к хитозану, другой грамположительный кокк - Staphylococcus aureus оказался одним из самых устойчивых к действию хитозанового полимера, а среди грамотрицательных бактерий К. рпеитопеае была более чувствительна по сравнению с другими видами энтеробактерий.
Очевидно антибактериальная активность хитозана зависит от его молекулярной массы. Так с ростом молекулярной массы антибактериальные свойства хитозанов усиливались вне зависимости от вида микроорганизма.
Антибактериальные свойства ацильных производных хитозана
В работе был использован уникальный ряд олигомерных и низкомолекулярных форм хитозана, который представлен образцами с молекулярными массами непрерывно перекрывающих весь диапазон перехода полимера от олигомеров к типичным низкомолекулярным хитозанам. Наряду с этим расматриваемые образцы хитозана обладают высокой степенью деацетилирования и низким уровнем полидисперсности, что позволило более точно определить взаимосвязь молекулярной массы хитозана с его физико-химическими свойствами и биологической активностью.
Различие в значениях рКа у образцов с различной молекулярной массой указывает на различие доли положительно заряженных аминогрупп полимерной цепи этих образцов при каждом конкретном уровне рН среды. Так, при рН 6,5 ровно половина аминогрупп молекул хитозана со степенью полимеризации в диапазоне от 20 до 32 будут заряжены положительно, тогда как другая половина будет депротонирована. В этих же условиях у олигомерных форм хитозана с более высокими показателями рКа, доля протонированных аминогрупп будет превышать долю незаряженных. При этом доля заряженных аминосахаридных остатков будет возрастать с уменьшением степени полимеризации образца. Тогда как в случае с более высокомолекулярными образцами, со степенью полимеризации выше 50, доля аминогрупп связавших ионы водорода будет немного меньшей, чем доля незаряженных аминогрупп всилу наименьшего значения рКа данных образцов, составляющего 6,4.
Так как именно наличие положительного заряда у полимерной молекулы хитозана обуславливается его антибактериальная и антимикотическая активность, то становится очевидной проблема сопоставления их биологической активности образцов со значением молекулярной массы. Возникает дилемма проведения сравнительного ингибирующего действия на микроорганизмы различных образцов хитозана. В одном случае - при одном значении рН, но при этом молекулы будут иметь разные доли протонированных аминогрупп, либо, в другом случае, -при различных значениях рН среды для каждого хитозана, которые обеспечат одинаковую долю протонированных и депротонированных аминогрупп всех взятых в опыт образцов.
Для решения данной проблемы необходимо выполнить два условия -подобрать довольно широкий ряд образцов хитозана с различной молекулярной массой, одновременно обладающих высокой степенью деацетилирования и низким уровнем полидисперсности и подобрать состав буферной системы для проведения биологических экспериментов в широком диапазоне уровней кислотности среды, включающей в себя с запасом значения рКа всех образцов хитозана.
Для решения этой задачи была подобрана комплексная буферная система на основе трёх органических кислот - морфолинэтансульфоновой -MES, ACES и TES с различным уровнем рН в пределах от 5,50 до 8,00. Данная буферная система позволяет поддерживать кислотность среды в интервале значений рН от 5,50 до 8,00, т.е. включающий интервалы значений рН, которые стабильно поддерживают данные кислоты по отдельности. Таким образом, использование комплексного буферного раствора MES-ACESES-Na, позволит оценить антибактериальную активность хитозана в том диапазоне кислотности среды, который недоступен для образования другими известными буферными системами на основе иных компонентов и подходящих для создания растворов хитозанового полимера без выпадения его в осадок.
Хитозан относится к неспецифическми антибактериальным веществам широкого спектра действия. В отличие от классических антибиотических веществ, которые имеют конкретные мишени для своего действия в бактериальной клетке, и благодаря чему очень эффективны в очень низких концентрациях, хитозановый полимер характеризуется отсутствием единственной мишени в клетках микроорганизмов. Хитозан воздействует на различные структуры и процессы в клетках прокариот, благодаря чему обадает широким спектром действия, проявляя ингибирующее действие как на грамотрицательные, так и на грамположительные бактерии.
Полученные результаты в основном подтвердили это положение, поскольку большинство видов бактерий обладали сопоставимой чувствительностью к хитозанам с определённой молекулярной массой. Для наиболее эффективных форм хитозана с молекулярными массами от 8 кДа минимальные бактерицидные концентрации составляли 125-250 мкг/мл. Были отмечены и виды, для подавления роста которых требовалось гораздо меньше хитозана. Так, повышенной чувствительностью к поликатиону обладали К. pneumoniae и S. epidermidis. Эффективная концентрация хитозана при действии на эти микроорганизмы была близкой к эффективности таких антибиотиков как канмицин, триметоприм, рифампин. В случае с клебсиеллой для ингибирующего эффекта хитозана требовалось даже меньшее количество, чем для антибиотика низина. Высокую чувствительность эпидермального стафилококка к хитозану можно объяснить его сравнительно невысокой резистентностью к антибактериальным агентам по сравнению с золотистым стафилококком, вероятно связанную с особенностями строения его клеточной стенки. Вероятно этим же можно объяснить и повышенную чувствительность к хитозану К. pneumoniae, которая относится к той же группе энтеробактерий, куда входят и остальные взятые в эксперимент виды, но при этом обладает меньшей чувствительностью.
