Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Сведения о механизмах реализации патогенности микроорганизмов и, в первую очередь, факторах, определяющих способность приживаться в тканях организма хозяина, а также размножаться в них, вызывая патологические изменения, лежат в основе разработки эффективных методов профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Совокупность генотипических особенностей микроорганизмов, детерминирующих патогенность, фенотипически проявляется вирулентностью. В настоящее время полидетерминированность вирулентности патогенных микроорганизмов и, в частности, возбудителя чумы - Y.pestis - является общепризнанной При этом каждая из биомолекул (факторов патогенности) может обладать несколькими активностями, направленными на преодоление различных звеньев системы защиты макроорганизма. Реализация патогенных свойств Y. pestis в организме восприимчивого хозяина требует присутствия у возбудителя чумы целого набора факторов патогенности различной функциональной направленности и систем регуляции, обеспечивающих их координированную экспрессию. Абсолютизирование роли любого отдельно взятого из указанных факторов - некорректно (Burrows, 1957, 1963; Ми-шанькин, 1987; Brubaker, 1991). Однако детальный анализ каждого из этих факторов лежит в основе системного подхода при изучении патогенности и вирулентности Y. pestis.
Один из "классических" факторов патогенности Y. pestis - капсульный антиген FI - обладает целым рядом свойств, традиционно связываемых со способностью бактерий к перси-стенции (Finlay, 1989; Бухарин, 1994). Капсула, образованная из FI (Chen, 1977), защищает клетки Y.pestis от захвата интактными нейтрофилами хозяина (Cavanaugh, 1959; Burrows, 1963). Это согласуется с общепризнанной ролью бактериальных капсул, препятствующих поглощению бактерий фагоцитарными клетками макроорганизма (Van Oss, 1978). С одной стороны, капсулы экранируют пептидогликан или ЛПС бактериальной клетки, препятствуя инициации альтернативного пути активации комплемента (Muller-Eberhard, 1975), с другой стороны, повышение устойчивости к фагоцитозу обычно коррелирует с увеличением отрицательного заряда микробной клетки, способствующего электростатическому отталкиванию от одноименно заряженных фагоцитов (Van Oss, 197S). Но FI истощает систему комплемента за счет избирательной активации С2 и С'4 компонентов системы комплемента и таким образом препятствует комплемент-опосредованной опсонизации бактерий (Williams, 1972), а синтез капсулы, сопровождался снижением отрицательного заряда клеточной поверхности (Корсуков, 1990; Дятлов, 1992). Более того, отсутствие FI у некоторых штаммов Y. pestis обусловливало снижение эффективности захвата бактерий макрофагами морских свинок, но не белых мышей (Гребцова, 1990). В то же время известно, что размножение клеток Y. pestis внутри макрофагов является обязательным этапом патогенеза чумы (Каганова, Покровская, 1947; Cavanaugh, 1959), а вирулентность чумного микроба коррелирует не столько с устойчивостью к захвату фагоцитами, сколько со способностью выживать и размножаться в фаго-лизосомах фагоцитарных клеток за счет подавления антибактериальных функций фагоцитов (Коробков, 1963; Шанина, 1968; Charnetzky, 1985; Куклева, 1985; Васильева, 1987). Показано, что FI способна образовывать в двухслойных фосфолипидных мембранах поры, проницаемые для воды (Rodrigues, 1992). Высказано предположение, что это приводит к нарушению осмотической регуляции и последующей гибели клетки-мишени теплокровного животного. Показано, что высокомолекулярный капсульный антиген обладал гемагглютинирую-щей активностью за счет способности специфически связываться с D-галактозамином-НСІ и глюкуроновой кислотой (Сердобинцев, 1989), что может объяснить гипотетическое участие капсульного антигена в образовании клейких скоплений микробов и образовании блока в преджелудке блохи (Kartman, 1964).
В подавляющем большинстве исследований бескапсульные варианты, в отличие от полноценных штаммов, обладали избирательной вирулентностью, что проявлялось в резком
снижении их вирулентности в отношении морских свинок, но не белых мышей (Burrows, 1957, 1958, 1963; Surgalla, 1960; Погасий, 1980; Сагимбеков, 1980, 1981; Топорков, 1987; Ку-тырев, 1989; Welkos, 1995). В Или-Картальском междуречье (Южное Прибалхашье) выделены Fra" штаммы, авирулентные для белых мышей и морских свинок, слабо вирулентные для краснохвостых и гребенщиковых, но высоко вирулентные для больших песчанок (Кудинова, 1968). В то же время описаны Fra" штаммы 358/12 (Акимович, Шанина, 1965) и И-2422 (Ку-тырев, 1992), обладающие универсальной вирулентностью для лабораторных животных. Таким образом, вопрос о корреляции Fra+ признака с вирулентностью Y. pestis требует дальнейшего изучения.
О.А. Проценко с соавт. (1983) показали, что гены, ответственные за синтез FI, локализованы на плазмиде pFra. Fra оперон, кодирующий капсульный антиген, был впервые клонирован из EcoRI банка "больших" плазмид Y. pestis А.В. Карлышевым, В.М. Красильнико-вой и П.А. Черепановым в 1984 г. (цитируется по П.А. Черепанову (1993)). Секвенирование и определение структурно-функциональной организации fra локуса, клонированного в составе этой плазмнды, независимо друг от друга проводилось группами А.В. Карлышева (1990-1992) и П.А. Черепанова (1991) и не дало однозначных результатов. До настоящего времени нет единого мнения о функциях отдельных генов fra оперона в секреции структурной субъединицы на поверхность клетки и образовании капсулы чумного микроба (Simpson, 1990; Черепанов, 1991; Karlyshev, 1994; Гончаров, 1995; Косее, 1997; Домарадский, 1998). Относительно недавно показано, что в рекомбинантных клетках Escherichia coli, дефектных по гену caflM оперона fra, происходит образование капсульного антигена, выявляемого с помощью коммерческих иммунодиагностикумов в реакции иммунодиффузии в геле по О. Ouchterlony и РНАт, но не в РИГА (Черепанов, 1991). Большинство исследователей считает, что в CaflM~ энтеробактериях происходит лишь нарушение секреции капсульного антигена и не происходит образования капсулы (Galyov, 1991; Protsenko, 1991; Кутырев, 1992; Karlyshev, 1994; Perry, 1997).
Классическая иммунодиагностика чумы построена на выявлении капсульного антигена FI или анти-Р1-антител (Brubaker, 1972; Руководство по профилактике чумы, 1972, 1992; Bahmanyar, 1976; Наумов, 1992; Домарадский, 1993; Perry, 1997). Капсульный антиген К pestis является важнейшим составным компонентом подавляющего большинства современных коммерческих и экспериментальных чумных вакцин. Показана его ведущая роль в создании напряженного иммунитета у белых мышей, морских свинок, приматов и человека (Baker, 1952; Lawton, 1960; Филиппов, 1973; Meyer, 1974; Williams, 1980; Бывалов, 1984; Го-лубинский, 1984; Simpson, 1990, Дальвадянц, 1991; Andrews, 1996 и др.). В настоящее время для получения FI Y. pestis - основного компонента чумных диагностических и вакцинных препаратов, используют вакцинный штамм чумного микроба EV линии НИИЭГ. Этот штамм обладает повышенной субстратной специфичностью и при этом невысокой скоростью роста при оптимальной температуре для синтеза капсульного антигена - 37 С. Методами генной инженерии на основе подбора оптимальных рецштиентных штаммов получены продуценты капсульного антигена на модели Е. coli НВ101 (Карлышев, 1989; Гремякова, 1991), XL 1-blue (Simpson, 1990), К802 (Попов, 1991, Кириллина, 1992) и Salmonella minnesota R595 (Гремякова, 1991). Вышеперечисленные гибридные штаммы, хотя и продуцировали капсульный антиген в достаточных количествах, однако нестабильно наследовали плазмидные репликоны, несущие в своем составе/га оперон чумного микроба, что, в свою очередь, неблагоприятно влияло на протективность этих рекомбинантных штаммов и выявлялось при испытании их на биологических моделях. Все вышеперечисленное создает значительные ограничения для применения указанных штаммов в технологических процессах. Ряд исследователей столкнулся и с затруднением экспрессии fra оперона, клонированного в клетках Е. coli (Заренков, Лебедева, 1985; Шишкина, 1988; Дармов, 1992; Гончаров, 1995). Высказано предположение, что капсульный антиген может оказывать токсический эффект на клетки штамма-
продуцента, приводящий к накоплению в популяции микроорганизмов с дефектами fra оперона, вызванными встройками в его структуру IS-элементов (Дармов, 1992).
Исследование молекулярно-генетических механизмов образования капсулы возбудителя чумы с привлечением комплекса методов бактериологии, генной инженерии, биохимии, биофизики, иммунологии и электронной микроскопии позволит получить новые сведения о сборке бактериальных органелл, роли_/га оперона в целом и отдельных его генов в патогенезе и иммуногенезе чумы. Это создаст основу для разработки методологии получения стабильных (технологичных) штаммов-продуцентов с максимальным уровнем синтеза и секреции "классического" капсульного антигена, необходимую для конструирования экспериментальных вакцинных штаммов нового поколения и суперпродуцентов капсульного антигена, способных осуществлять температуронезависимый синтез и секрецию конечного продукта на "небогатых" питательных средах, что позволит значительно упростить и, соответственно, удешевить производство капсульного антигена.
Т^КЛЪ ИССЛЕДОВАНИЯ - получение новых сведений о молекулярно-генетических механизмах образования капсулы Y.pestis, ее функциональной значимости в патогенезе и иммуногенезе чумы, а также механизмах изменчивости антигенной специфичности капсулы возбудителя чумы; конструирование стабильных штаммов-суперпродуцентов капсульного антигена.
-
Разработать новые и усовершенствовать имеющиеся методы генетического анализа факторов патогенности и иммуногенности на модели fra оперона Y.pestis (методология направленного "выключения" определенных генов^а оперона, селекция рекомбинантных клонов и стабилизация генетической информации в клетках Y. pestis).
-
Создать коллекции изогенных штаммов энтеробактерий, отличающихся способностью к образованию капсулы, и на их основе получить эффективную систему для комплексной сравнительной оценки свойств полученных штаммов энтеробактерий.
-
Провести молекулярно-генетический анализ fra оперона и определить значение этого локуса для реализации патогенности Y. pestis, а также роль его отдельных генов в образовании и изменчивости антигенной специфичности капсулы.
-
Разработать, с учетом полученных данных о молекулярно-генетических механизмах образования капсулы Y. pestis, методологию получения стабильных штаммов-суперпродуцентов "классического" капсульного антигена и на ее основе сконструировать экспериментальные вакцинные штаммы.
-
Провести анализ и обобщение собственных экспериментальных исследований и литературных данных, относящихся к изучению факторов возбудителя чумы, обеспечивающих его персистенцию в природе.
Приоритет в конструировании рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей кап-сульный белок - антиген FI чумного микроба, и штамма бактерий К colt - продуцента белка -антигена FI чумного микроба защищен авторским свидетельством (А.с. № 327782).
Впервые показано, что на модели белых мышей рекомбинантный капсульный антиген, синтезируемый в клетках Е. coli, обладает выраженной протективной активностью в отношении вирулентных штаммов Y. pestis "дикого" типа.
Впервые с помощью комплекса иммунохимических, биофизических методов и световой микроскопии получены экспериментальные доказательства образования капсулы, сформированной из серологически атипичного капсульного антигена, в клетках энтеробактерий, несущих оперон fra дефектный по генам caflR или caflM. Выявлено, что перемещение субъединиц капсульного антигена Cafi на поверхность микробной клетки может проходить и без участия шаперона CaflM. Впервые показано, что "серологический" вариант капсульного антигена в CaflM" бактериях определяется особенностями клеточной поверхности штамма-продуцента и, в первую очередь, формой его ЛПС. Определены минимальные размеры
фрагментов плазмиды pFra, необходимые для полноценной экспрессии локуса fra в составе гибридных плазмид в клетках К coli, Y. pestis, Y enterocolilica и Salmonella spp.
Впервые доказано, что направленное "выключение" генов, ответственных за синтез капсульного антигена FI, не приводит к снижению вирулентности для белых мышей и морских свинок высоковирулентных штаммов "дикого" типа независимо от их происхождения. Установлено, что Fra" клетки Y. pestis обладают селективными преимуществами не только в организмах белых мышей, предварительно иммунизированных штаммами "дикого" типа или "классическим" капсульным антигеном, но и в организмах морских свинок, переболевших экспериментальной чумой, вызванной штаммами "дикого" типа, но не в организмах морских свинок, однократно вакцинированных живой чумной вакциной.
Приоритетные данные получены в результате изучения вирулентных штаммов К pestis, образующих атипичные капсулы. На модели белых мышей показано, что указанные атипичные штаммы преодолевают иммунитет, индуцированный вакцинным штаммом EV. Препараты капсульных белков или "убитая" вакцина, приготовленные на основе этих штаммов, практически не защищают иммунизированных животных от последующего заражения штаммом, на основе которого были приготовлены эти препараты. У интактных и иммунных белых мышей, павших от экспериментальной чумы, вызванной штаммами с атипичными капсулами, патоморфологические изменения внутренних органов принципиально не отличались от таковых у животных, погибших в результате их заражения исходным штаммом "дикого" типа.
Впервые показано влияние экспрессии интактного или дефектного по гену caflMone-роиа fra возбудителя чумы на электрокинетический потенциал клеток чумного микроба и других энтеробактерий. Выявлено что в клетках cafJM бактерий изменение величины ^-потенциала связано с формой ЛПС штамма-продуцента.
Впервые сконструированы продуценты капсульного антигена на основе Yersinia spp., обладающие по данным РИГА в 10 -104 раз большей серологической активностью, чем природные штаммы Y. pestis. Установлено, что в регуляции синтеза капсульного антигена принимают участие неидентифицированные пока хромосомные гены иерсиний, отсутствующие у Е. coli. Увеличение копийности/ra оперона в клетках Yersinia spp., но не Е. coli, приводит к температуронезависимому синтезу капсульного антигена.
Достоверно показана принципиальная возможность повышения протективности живых чумных вакцин за счет суперпродукции основного иммуногена Y. pestis - FI.
Сформулирована гипотеза, объясняющая механизмы устойчивости Fra" штаммов Y. pestis к ряду антибиотиков in vivo. Учитывая, что возбудитель чумы является факультативным внутриклеточным паразитом, а капсульный антиген способен встраиваться в двухслойные фосфолипидные мембраны, образуя в шгх поры, проницаемые для воды, a priori высказано предположение, что in vivo индуцированные капсульным антигеном "водяные" поры могут быть основной причиной проникновения антибиотиков в макрофаг и его фаголизосо-мы, обеспечивающей чувствительность к антибиотикам клеток Y. pestis "дикого" типа.
На основании анализа доступных литературных сведений и данных собственных экспериментов предложена классификация факторов Y. pestis, обеспечивающих его персистен-цию в природе.
Определены перспективные направления изучения факторов, определяющих вирулентность, блокообразующую активность и эшщемиологическую значимость различных экотипов возбудителя чумы на основе разработанных методических подходов и созданных коллекций изогенных штаммов.
Впервые разработана простая и надежная методология направленного конструирования неревертирующих Fra", cafЇМ или pFra" мутантов Y. pestis, сочетающая локализованный мутагенез in vitro, гомологичную рекомбинацию in vivo, селекцию рекомбинантных клеток в
организме иммунного животного и позволяющая получать достоверные данные о роли признака капсулообразования в проявлении патогенных и иммуногенных свойств возбудителя чумы. Разработанный способ локализованного мутагенеза Y. pestis, позволяющий направленно "выключать" гены факторов патогенное, защищен двумя авторскими свидетельствами (Ах. № 293939 и Ах. № 1754779).
Оптимизированы способы стабилизации наследования и экспрессии генетической информации в клетках Y. pestis и подобраны векторы, обеспечивающие стабильную суперпродукцию капсульного антигена в клетках энтеробактерий. Разработана методика прямой электрофоретической селекции трансформантов, содержащих последовательности ДНК, кодирующие поверхностные структуры бактерий. На основе атгенуированных штаммов иерси-ний сконструированы суперпродуценты, обеспечивающие эффективную секрецию капсульного антигена в культуральную среду при температурах (25+3) С, соответствующих минимальным питательным потребностям Y. pestis. Штаммы Y. pestis КМ277 (EV1 lMpFSK3) и Y. enterocolitica KM33pFSK3 способны продуцировать капсульный антиген на голодных средах в количествах, равных или превышающих уровень продукции вакцинного штамма EV, выращиваемого на богатых питательных средах.
Сконструированный штамм Y. pestis КМ276 (KM217pFSK3) с синтезом основного протективного антигена возбудителя чумы - фракции I, повышенным относительно уровня продукции других - "балластных" антигенов, может служить основой для разработки новой вакцины живой чумной.
В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонирована коллекция, состоящая из 2 охраноспособных и 11 авторских штаммов - эффективных продуцентов белковых продуктов ^а оперона и производных природных изолятов Y. pestis, представляемых как авторские в связи с их способностью образовывать атипичные варианты капсулы.
Сконструированные высоковирулентные Fra~ и cqflM штаммы Y. pestis рекомендуются для оценки эффективности коммерческих и экспериментальных чумных вакцин в отношении атипичных вариантов возбудителя чумы.
Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов:
Методика лабораторная "Стерилизаг"ч F и I антигенов, выделяемых из вакцинных штаммов чумного микроба". Оболенск, 1990 (учрежденческий уровень внедрения).
Методика лабораторная "Криотрансформация вакцинных штаммов чумного микроба плазмидными ДНК". Оболенск, 1990 (учрежденческий уровень внедрения).
Пособие для научных сотрудников "Применение электрофореза в свободном потоке для отбора рекомбинантных бактериальных клеток, содержащих последовательности ДНК плазмиды pFra Y. pestis, экспрессирующие генетические детерминанты поверхностных биополимеров". Саратов, 1998 (учрежденческий уровень внедрения).
Инструкция по изготовлению и контролю тест-заражающих культур вирулентных штаммов возбудителя чумы сухих. (Инструкция). - Москва, Саратов, Киров, 1999 (федеральный уровень внедрения).
Методические указания "Основные критерии оценки вакцинных штаммов чумного микроба". Москва, Саратов, Киров, 1999 (федеральный уровень внедрения).
Разработанные методические приемы, сконструированные плазмиды и штаммы в настоящее время применяются в микробиологических, генетических, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ГНЦ прикладной микробиологии (Оболенск, Московская обл.), АООТ "Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат" (Любучаны, Московская обл.), РосНИПЧИ "Микроб", ГИСК им. Л.А. Тарасевича и НИИ микробиологии МО РФ (Киров). Список документов по внедрению научных достижений в практику приведен в конце автореферата.