Введение к работе
Vv.АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ В "Основных напрааіениях экономического
~~~~' я социального развития СССР", принятых
на УХІІІ съезде КПСС, указывается на необходимость ускорения научно-технического прогресса и развития науки и в т.ч. физико-химической биологии и научных основ биотехнологии, поставлена задача увеличения выпуска продукпии микробиологической промышленности. В связи с этим крайне актуальна: стс .овится углубление наших представлений о наиболее существенных закономерностях различных сторон жизнедеятельности микроорганизмов. При этоы серьезное внимание должно быть уделено планомерному и всестороннему развитию фундаментальных исследований для решения тех задач, которые впоследствии могут быть использованы в практических целях.
К ї.'лсим проблемам, требующим детального изучения, относится и явленке анабиоза. Проблема анабиоза и.эет большое мировоззренческое и обцебиологическое значение. Ее решение приближгэт к пониманию сущности жизни, Еыявллег рол. воды и структурной организации клетки для жизнеспособности биологических систем. Прогресс в изучении анабиоза имеет ванное значение для развития учения о происхождении и распространении жизни на йемле и планетах солнечной системы, способствует выяснению вопроса о возможности миграции пизни между планетами.
Наряду с этим, проблема анабиоза имеет ис :лючительно большое практическое значение. Возможность консервирования органов, тканей и клеток открывает новые горизонты в медицине, иссушивание или замораживание сперш позволяет создать фонд генетического материала высокопродуктивных сельскохозяйственных животных, что крайне необходимо яри использовании метода искусственного осеменения. Б последние годы проблема консервации генетических ресурсов стала крайне актуальной и в связи с необходимостью сохранения в природе существующей, по крайней мере, в наши дни фяо^а и фауны из-за постоянного и доста^зчио быстрого полного исчезновения многих редких видов животных.
В микробиологической, медицинской, пгсцевой и мясомолочной промышленности производился ряд препаратов, представляющих собой жизнеспособные клетки микроорганизмов. Их качестзо, потребительские свойства, длительность хранения намного улучшаются
iipii их производстве в сухом виде. Дальнейшее же улучшение качества выпускаемых сухих биопрепаратов, повышение экономической рентабельности их производства, разработка новых технологий неразрывно связаны с необходимостью детального изучения анабиотического состояния живых организмов. I
К 1970 г. - времени начала проведения настоящей работы - бч-ди шясненн основ, je физиологические изменения, характеризующие процессы обезвоживания и последующей регидратации микроорганизмов. На первый план выдвинулась задача углубленного исследования основных внутриклеточных структурно-функциональных, биохимических, биофизических и ыодекулярно-биологических механизмов, о которыми связан переход дрожжевых клеток в состояние анабиоза и одновременного выяснения возможных причиг гибели части клеток в подобных условиях.
Ц ПЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящей работы являлось выяснение основных закономерностей . структурной и функциональной перестройки клетки при ее переходе в состояние анабиоза, достигаемого в результате обезвоживания организмов /ангидробиоза/, а также в процессе ее реактивации и выхода из этого состояния.
Чтобы достичь поставленной цели планировалось решать следующие основные задачи;
I/ разработать или модифицировать рід методических подходов, необхо^ііьшх для всестороннего исследования дрсгжевнх клеток, находящихся в состоянии анабиоза или реактивации и выхода из этого состояния;
2/ охарактеризовать структурные и функциональные перестройки основных органаля дрокжешх клеток при их переходе в состояние ангидробиоза и при последующем восстановлении активной жизнедеятельности организмов;
3/ изучить некоторые изменения структурно-функциоьального состояния мембран при' обезвоживании-регндратацни дрожжей;
4/ исследовать защитные реакции, реализующиеся в дроахевых клетках при их переходе в состояние ангидробиоза;
5/ исследовать возможность повышения устойчивости проЕиевых организмов к процессом обозвснивания, ре идратации и реактивации путем воздействия на них факторами шейной срепы»
б/ обобщить данные о роли основных факторов, определяющих сохранение жизнеспособности, дрожжей в экстремальных условиях обез-вокивания-регидратации.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ЗНАЧИМОСТЬ В проведенной работе сформировано
и развито новое научное направление - цитология ангидрсбиоза, понимаемое как раскрытие важнейших закономерностей биологии клетки, связанных с обратшш торможением ее метаболизма, последующей реактивацией и выходом иа этого состояния.
Показано, что ангидробиоз представляет собой эволюционно сформировавшийся процесс адаптации к условиям экстремально низких уровней влажностей, осуществляющийся путем комплексной. структурно-функциональной перестройки клетки и проявляющейся на всех уровнях организации - клеточном, субклеточном /органоидном/ г ио; кулярнсм.
Выяснены основные закономерности перехода клетки в состояние ангидробиоза и ее последующей реактивации. Первый этап характеризуется перестройкой ядерного аппаїіта: конденсацией хроматина, переходом его структуры в транеярипционно неактивную форму с наднуклеосомной организацией, стабилизацией генома. Происходит также снижение количества рибосом и стабилизация пула FHK на уровне 60# от исходного содержания. Руществегаше изменения характерны для структурно-функциональных свойств мембран /в т.ч. изменяется их проницаемость/, что связано с перестройкой их молекулярной организации, при которой на отдельных участках мембран мояет осуществляться переход липидного бислея из ламелляр-ной фазы в гексагональную фазу П, Показано, что на этапе торможения метаболизма в дргаиах активируется ряд внутриклеточных процессов, среди которых возрастание активности вакуолярной системы и осуществление специальных защитных реакций - отграничение участков необратимо поврежденной цитоплазмы, Отделение нуклеолеммой хрсыатинсодерващей и резорбция остальной части ядра, синтез и накопление протекторных соединений /трегалозн, по-лиолов/.
Установлено, что существенной характеристикой этапа реактивация является возможность значительного снижения поврелдений в мембранах и увеличение в результате этого количества клеток,
- 4 -восстанавливающих активную жизнедеятельность, путем создания условий, способствующих нормализации молекулярной организации мембран. Обнаружена повышенная физиологическая активность дрожжевых организмов, выводимых из состояния ангидробиоза /увеличение накопления биомассы и синтеза гидролитических ферментов/.
Установлены основные факторы, определяющие максимальное сохранение жизнесп. аобности дрожжей в условиях перехода в состояние ангидробиоза, среди которых степень стабильности нуклеиновых кислот, определенная стадия клеточного цикла, способность к конденсации хроматина, степень сохранности структуры мембран, накопление клетками трегалозы или полиолов.
Показана возможность значительного повышения устойчивости дрожжей к обезвоживанию,, пере водящему их в состояние анп.. j?o-биоза, путем создания условий, имитирующих начальные этапы дегидратации организмов в природных условиях.
Значительная часть выявленных в работе структурно-функциональных изменений монет рассматриваться как защитные реакции клетки, направленные на сохр^ление жизнеспособности организмов в условиях обезвоживания. Полученные данные изменяют представления о потенциальных возможностях эукариотической клетки и о поведении микроорганизмов в природе при воздействии такого фактора как экстремально низкие уровни влажности.
ПРАКТИЧЕСІШї ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ На осноге полученных результатов
возникла возможность разработка в дальнейших исследованиях анабиоза нового направления, имеющего наряду с теоретическим и непосредственное практическое значение - направленного поиска условий, обеспечивающих значительное повышение устойчивости дрожжевых организмов к процес-. сам обезвоживания, регидратацш и реактиваций, и резкого повышения на этой основе качества сухих биопрепаратов микробного происхождения и экономической эффективности их промышленного производства.
Цитологические данные о строении микроорганизмов и реактивности их мембран и различных внутриклеточных органелл могут быть использованы при изучении механизмов действия различных экстремальных факторов в качества модельных систем.
Данные о строении ш.гактных дрожжевых клеток и об их струн- -
турно-функциональных переотройках при переходе в состояние анабиоза и о необратимых патологических повреждениях, возникающих при гибели клеток, могут быть использованы при оценкэ физиологического состояния культур и при индикации различных воздействий на клетку, при работах по оптимизации новых технологий культивирования микроорганизмов и по получешпо сухих биопрепаратов микробного происхождения, а таето при определении биологической активности микроорганизмов, что весьма существенно для микробиологической промышленности и биотехнологии. . Разработаны и описаны методы быстрого количественного определения степени ячзнеспособн сти дрожжевых организмов, подвергнутых экстремальным воздействиям и разработана градации различных состояний живых клеток.
Показана возможность использования нового сравнительного критерия оценки устойчивости дроижей к дегидратации, исходя из степени стабильности их нуклеиновых кислот.
Данные, изложенные в диссертационной работе, использоваг! при чтении курсов лекций по микробиологии на кафедре физиологии ра ектений и микробиологии Латвийского Государственного университета им. П.Стучки, по цитологиимикроорганизмов на кафедре микробиологии Московского Государственного университета им. М.В.Ломоносова, по технической микробиологии на кафедре технологии консервирования Кишиневского политехнического института им. С.Лазо и по биотехнологии на кафедре органического синтеза к биотехнологии Рижского политехнического института км. А.Я.Пельше.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации доложены.и обсудцены на шести конференциях молодых ученых /Рига, ІУ72, 1975, ІУ76,1977, 1979; Ереван, 1977/, на симпозиуме "Анабиоз и предакабиоз микроорганизмов" /Рига, 1971/, П Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладном вопросам криобиологии /ларьков, 1984/ и на Медцународной конференции по криобиологии /Харьков, 1988/, на Всесоюзном симпозиуме "Ре-rj-лция биохимических процессов у микроорганизмов" /Пущино, 1972/, на Всесоюзном симпозиуме "Общие механизмы клеточных реакций на повреждающие воздействия" /Ленинград, 1976/, на Втором Всесоюзном сіг.гаози-~!Є "Структура и функции нуклеиновых кислот и биосинтез белка в растениях" /Таякент, 1977/, на сімпс-зиуке по биотехнологии /Рига, 1978/, на Всесоюзном еншозкуме
по онтогенезу микроорганизмов /Пущино, 1977/, на Втором Всесоюзной симпозиуме "Структура и функции лизосом" /Новосибирск, 1980/, на I Всесоюзной конференции "Автоматизированные система обработки изображений" /Москва, 1981/, на ІУ Всесоюзном симпозиума "Электронная микроскопия в ботанических исследованиях" /Рига, '978/, ка У Всесоюзном симпозиуме по ультраструктуро ре > тений /Кишинев, І9Ьо/, на Ш симпозиуме "Электронная ыикроскопия и вопросы диагностики" /Кишинев, ІУ86/, на 9, II, 12 Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии /Тбилиси, 1973; Таллия, 1979; Сумы ІУ82/, на 5, 6 и 7 съездах Всесоюзного микробиологического общества /Ереван, 1975; Рига, 1980; Алма-Ата, 1985/, на 15 Чехословацкой конференции по электронной микроскопии /Прага, 1977', на 4, 7, 8 и 9 Международных дрожжевых симпорчу-мах /Вена, 1974; Валенсия, І98І; Бомбей, 1983;. Смоленице, 1983/, ни 8 объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР /Рига, 1985/, на 13 Международном микробиологическом съезде /Т11А, ІУ82/, на Международном симпозиуме по регуляции микробного метаболизма /Дущино, 1983/, на всесоюзных рабочих совещаниях по консервации генома» по кинетике и по цитологии микроорганизмов /Пущино, 1982; Киев, 198а; Дущино, ІУ84/, на 3 Рияской школе "Поверхность клеток и биомембранн" /Рига, ІУ85/.
ПУБЛИКАЦИЙ Основные материалы диссертации опубликованы в
78 печатных работах и в а'.ч. монографии "Анабиоз микроорганизмов" /соавторы М.ЕЛЗеяер, Б.Э,Демберг/.и.научно-популярной книге "Анабиоз, приостановленная жизнь...".
ОСНОВНЫЕ сіАЛЖАМіБ ПОЛоМИЯ ДИССЕРТАЦИИ При переходе дроаже-
шх клеток в состояние ангидробиоза их оргааадли претерпеваю? ряд об; хташх' структурно-функциональных перестроек, большинство'из которых косит адаптивний характер.
При переходе дрсажзвых клеток в состояние ангидробиоза в них может осуществляться ряд специальных зартнах роакщй, направленных на сохранение зшзноспособности организмов. Среди них накопление клетками трегалозы и поляояов, конденсация хроматина в ядрах, отделение хроматнноодержащей части ядра, отграничение необратимо погревденных участков цитоплазмы и некоторые другие. ^
При переходе дрожжей в состояние ангидробиоза, по крайне 1
пере, на отдельных участках их цитоплазматических и вакуоляркых цембран может осуществляться переход липидного бислоя из ламел-лярной $аэы в гексагональную фазу II.
Одной из основных причин гибели части клеток при оОезвояива-нии дрожжей являются серьезные повреждения их мембран. Значительное снижение повреждений мембран может быть достигнуто путем создания условий, способствующих восстановлению их функционально нормальной молекулярной организации.
При экспериментальном переводе дрожжевых организмов в состояние ангидробиоза необходимо учитывать основные факторы, определяющие сохранение жизнеспособности организмов в экстремальных условиях обезвоживания и последунцей регидратации /степень стабильности нуклеиновых кислот, способность клетки к конденсации хроматина, стадии клеточного цикла, степень сохранения молекулярной организации мембран, способность к осуществлению других защитных реакций/.
Путем направленной искусственной инициации защитных внутриклеточных реакций можно значительно повысить устойчивость дроя-гей к обезвоживанию.
СТРУКТУРА И ШЬЕМ ДИССЕРТАЦИЙ Диссертация состоит из 15 разделов, которые включают: введение; 4 раздела, в которых обобщаются современные литературные данные по анабиозу микроорганизмов; 8 разделов, в которых излагаются результаты эксперименте"ьных исследований автора по ан-гидробиозу дрожжей; выводы и список цитированной литературы. Диссертация излагается на 299 страницах,учетного машинописного текста, содержит 2У таблиц и 122 рисунка. Список литературы включает 272 названий работ отечественных и 497 названий работ зарубежных авторов.