Анализ структуры и экспрессии генов факторов адаптации у генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор Плеханов Никита Александрович

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 15

1.1. Биопленка холерного вибриона 16

1.1.1. Роль биопленки в выживании V. cholerae во внешней среде 16

1.1.2. Механизмы регуляции образования биопленки 22

1.2 Механизмы адаптации возбудителя холеры к условиям различной осмолярности 27

1.3 Адаптация V. cholerae к оксидативному стрессу 34

1.4. Адаптация V. cholerae к температурному стрессу 38

ГЛАВА 2. Материалы и методы 41

2.1. Бактериальные штаммы 41

2.2. Питательные среды и реактивы 43

2.3. Методы

2.3.1. Культивирование бактериальных штаммов 44

2.3.2. Определение продукции холерного токсина 44

2.3.3. Определение продукции маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии 45

2.3.4. Определение биосинтеза растворимой гемагглютинин/протеазы, фосфолипазы, гемолизина, а также подвижности 45

2.3.5. Способность штаммов V. cholerae формировать биопленку 46

2.3.6. Исследование выживаемости штаммов при недостатке питательных веществ и изменении температуры 46

2.3.7. Определение устойчивости штаммов к осмотическому и оксидативному стрессам 46

2.3.8. Белковый электрофорез и выявление экзополисахарида 47

2.3.9. Атомно-силовая микроскопия 48

2.3.10. ПЦР-анализ 48

2.3.11.Секвенирование 51

2.3.12. Статистическая обработка 51

ГЛАВА 3. Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов, необходимых для формирования биопленки, в штаммах геновариантов v. cholerae биовара ЭЛЬ ТОР 52

3.1. Сравнительный (in silico) анализ нуклеотидной последовательности генов, участвующих в процессе формирования биопленки, в штаммах геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенных в разные годы на территорию Российской Федерации 52

3.2. Сравнительный анализ способности штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор к формированию биопленки 55

ГЛАВА 4. Влияния стрессовых факторов на штаммы геновариантов v. cholerae биовара Эль Тор 60

4.1 Изучение экспрессии генов и анализ структуры генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор при нахождении в условиях недостатка питательных веществ 60

4.2. Влияние температурного стресса на экспрессию генов и структуру генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор 69

4.2.1 Сравнительная устойчивость штаммов V. cholerae биовара Эль Тор к действию высокой и низкой температур 69

4.2.2 Влияние температурного стресса на экспрессию генов и структуру генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор 71

4.3 Анализ экспрессии генов и структуры генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор после действияосмотического и оксидативного стрессов 76

4.3.1 Сравнительная устойчивость штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор к действию осмотического и оксидативного стрессов 76

4.3.2 Исследование экспрессии генов в штаммах геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, подвергшихся действию осмотического и оксидативного стрессов 79

4.3.3 Анализ стабильности структуры генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, подвергшихся действию осмотического и оксидативного стрессов 81

ГЛАВА 5. Разработка мультиплексной пцр для одновременной идентификации штаммов геновариантов v. cholerae о1 серогруппы биовара эль тор и определения их эпидемического потенциала 84

5.1. Создание мультиплексной ПЦР для идентификации геновариантов V. cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор и определении их эпидемического потенциала 84

5.2. Изучение эффективности и специфичности разработанного метода ЗАКЛЮЧЕНИЕ 95

Выводы 106

Список используемых источников 108

• Механизмы адаптации возбудителя холеры к условиям различной осмолярности
• Определение продукции маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии
• Сравнительный анализ способности штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор к формированию биопленки
• Влияние температурного стресса на экспрессию генов и структуру генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор

Введение к работе

Актуальность проблемы. Возбудителями текущей, 7-ой, пандемии холеры, начавшейся в 1961 году и продолжающейся до сих пор, являются токсигенные штаммы V. cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор. Вызывая легкие (часто бессимптомные) формы болезни, но отличаясь высокой выживаемостью во внешней среде, штаммы Эль Тор вибрионов быстро распространились по всему миру, полностью заменив на эндемичной территории возбудителя предыдущей, 6-ой, пандемии – V. cholerae О1 серогруппы классического биовара (Бароян, 1971; Тудор, Страти, 1981; Huq et al., 1983; Colwell et al., 1985; Islam et al., 1994; Schoolnik, Yildiz, 2000).

Однако в 90-х годах прошлого столетия было зарегистрировано появление генетически измененных штаммов (геновариантов) V. cholerae О1 биовара Эль Тор (Nair et al., 2002). Геноварианты содержат в опероне ctxАB, кодирующем биосинтез холерного токсина, ген ctxB классических вибрионов (ctxB^Class или ctxB1) и синтезируют повышенное количество холерного токсина, приближаясь по данному показателю к штаммам V. cholerae классического биовара. С появлением геновариан-тов, вызывающих тяжелую форму болезни с высокой летальностью, холера стала более значимой мировой проблемой для здоровья человека, чем несколько десятилетий назад (Nair et al., 2002; Cottingham et al., 2003; Satchell et al., 2016). В связи с интенсивным и широкомасштабным распространением холеры, вызванной штаммами геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, в странах Азии, Африки, Карибского бассейна, прогноз по холере остается неблагоприятным и существует возможность завоза инфекции в любую страну мира (Смирнова с соавт., 2014; Моск-витина с соавт., 2015; Титова с соавт. 2016; Reimer et al., 2011; Satchell et al., 2016). В Российской Федерации штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, занесенные с эндемичной территории, вызвали как вспышки (Дагестан, 1994, Татарстан, 2001), так и единичные случаи холеры (Ачинск, Иркутск, 1997; Башкортостан, 2004, 2008; Тверь, 2005; Мурманская область, 2006; Москва, 2010, 2012, 2014) (Смирнова с соавт., 2010; 2014; Савельев с соавт., 2010, Миронова с соавт., 2012, 2016; Москвитина с соавт., 2015; Титова с соавт., 2016; Kuleshov et al., 2016).

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время структура генома штаммов геновариантов, циркулирующих на эндемичной территории и завезенных в различные страны, изучена достаточно детально. Проведено полногеномное секвенирование значительного количества штаммов. Выявлено, что геном геновариантов подвержен дальнейшим эволюционным изменениям, что выражается в появлении как точковых мутаций, так и делеций протяженных участков. Показана вариабельность структуры генов вирулентности, кодирующих продукцию холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, пандемичности, некоторых регуляторных генов. В современный период глобальное распространение по-

лучили «гипервирулентные» штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, одной из генетических особенностей которых является наличие обширной делеции в острове пандемичности VSP-II (Смирнова с соавт., 2014; Taviani et al., 2010; Chin et al., 2011; Reimer et al., 2011; Son et al., 2011; Satchell et al., 2016; Kuleshov et al., 2016).

Однако механизмы адаптации штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор исследованы не достаточно. Как известно, V. cholerae относится к группе патогенов, которые могут существовать в двух разных экологических нишах (кишечник человека и открытые водоемы). При смене среды обитания возбудитель холеры попадает в условия, отличающиеся по температуре, наличию питательных веществ, осмолярности, поэтому в водных условиях начинают экспрессироваться гены факторов адаптации, способствующие выживанию V. cholerae в данной среде обитания. При этом большинство имеющихся сведений о выживаемости и адаптации возбудителя холеры во внешней среде получены на модели типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор (Бароян, 1971; Хайтович, Михайлова, 2002; Смирнова с соавт., 2007; Куликалова, 2010; Faruque, Nair, 2008; Lutz et al., 2013). Относительно штаммов геновариантов показано, что они способны продуцировать биопленку, но в отличие от типичных штаммов более подвижны (Шашкова, 2012, Титова, Кушнарева, 2015; Son et al., 2011; Rahman et al., 2014; Satchell et al., 2016). В то же время данные о выживаемости штаммов геновариантов после действия стрессовых факторов и их влиянии на структуру генов практически отсутствуют. Фрагментарно представлены сведения о структуре и экспрессии генов, необходимых для формирования биопленки и устойчивости к различным стрессовым воздействиям. Высказано предположение, что штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор обладают большей экологической устойчивостью и лучше приспосабливаются к изменениям окружающей среды (Grim et al., 2010; Reimer et al., 2011), но экспериментальные данные, подтверждающие это предположение, отсутствуют. Более детальное исследование процессов адаптации штаммов геновариантов к действию различных неблагоприятных факторов внешней среды позволит установить причины их широкого распространения в современный период.

Цель работы – выявление особенностей в структуре и экспрессии генов, кодирующих факторы адаптации к неблагоприятным воздействиям внешней среды, у штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенных в разные годы на территорию Российской Федерации, и анализ их устойчивости к действию стрессовых факторов.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей

структурных и регуляторных генов, необходимых для формирования биопленки и устойчивости к стрессовым факторам у штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенных на территорию Российской Федерации в 1993-2012 гг.

1. Выявить изменения в экспрессии генов, участвующих в формировании биопленки, у штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, занесенных в разные годы на территорию Российской Федерации и имеющих разную структуру острова пандемичности VSP-II.

2. Исследовать устойчивость штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с разной структурой острова пандемичности VSP-II к действию неблагоприятных факторов внешней среды (недостаток питательных веществ, высокая и низкая температура, осмотический и оксидативный стрессы).

3. Провести фенотипический анализ и установить присутствие генов, входящих в состав профагов СТХ и RS1, островов патогенности VPI-1 и VPI-2, островов пандемичности VSP-I и VSP-II, в штаммах геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, подвергшихся действию стрессовых факторов.

4. Сконструировать мультилокусную ПЦР для одновременного выявления токсигенных штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор и дифференциации их по эпидемическому потенциалу на основе анализа структуры острова пандемичности VSP-II.

Научная новизна работы.

Установлено, что штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенные на территорию Российской Федерации в 1993-2012 гг., имеют идентичную референс-штамму V. cholerae N16961 биовара Эль Тор структуру генов, обеспечивающих подвижность, биосинтез экзополисахарида, поддерживающих архитектуру биопленки, глобального стрессового регулятора rpoS и ключевых регуляторных генов системы Quorum Sensing – hapR, luxO.

Анализ нуклеотидной последовательности msh оперона выявил стабильное сохранение структуры гена mshA, кодирующего основную субъединицу маннозо-чувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии (MSHA) во всех исследованных штаммах V. cholerae биовара Эль Тор. При этом в штаммах геновариантов, изолированных в 1993-1994 гг., структура остальных генов msh оперона идентична типичным Эль Тор вибрионам. В то же время в штаммах геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, занесенных с 1997 года, в последовательности генов mshE и mshJ, участвующих в сборке и секреции MSHA пилей, выявлены однонуклеотидные замены (SNPs), которые не оказывают влияние на биосинтез данных пилей, но могут служит в качестве генетической метки изолятов, появившихся после 1997 года.

Показано, что исследованные штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенные на территорию Российской Федерации в 1993-2012 гг. и имеющие разную структуру острова пандемичности VSP-II (интактный, с небольшой делеци-ей, с протяженной делецией), не отличаются от типичных Эль Тор вибрионов по способности формировать биопленку in vitro.

Установлено, что исследованные штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор в отличие от типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор более устой-

чивы к температурному стрессу (42 ^оС и 5 ^оС). В результате адаптации к повышенной температуре (42 ^оС) в клетках геновариантов увеличивается биосинтез белков-поринов внешней мембраны OmpU/OmpT, а при ее понижении (5 ^оС) – экзополиса-харида. При этом штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенные на территорию Российской Федерации в 1993-2001 гг., также отличаются повышенной устойчивостью к осмотическому (3 моль раствор NaCl) и оксидативному (20 ммоль раствор перекиси водорода) стрессам. Один из выявленных механизмов их устойчивости к осмотическому стрессу обусловлен синтезом экзополисахарида в более ранние сроки, чем у типичных штаммов.

Показано, что после действия 20 ммоль перекиси водорода штаммы геновари-антов V. cholerae биовара Эль Тор могут утрачивать остров пандемичности VSP-I или профаг RS1. Частота образования VSP-I и RS1 клонов составляла соответственно 20 и 30 %.

Предложен способ одновременного определения серогруппы, биовара, токси-генности исследуемого штамма V. cholerae, идентификации штаммов геновариан-тов V. cholerae биовара Эль Тор и определении их эпидемического потенциала (высокий или низкий) на основе анализа структуры острова пандемичности VSP-II. Приоритетность разработанного способа подтверждена получением патента на изобретение (Патент РФ №2560280, приоритет от 23.09.2014 г.).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая значимость исследований заключается в получении знаний, расширяющих представления об экологии недавно появившихся штаммов генова-риантов V. cholerae биовара Эль Тор с повышенной вирулентностью. Приведены экспериментальные доказательства лучшей адаптации штаммов геновариантов по сравнению с типичными изолятами к действию ряда неблагоприятных факторов внешней среды. Выявлены стрессовые воздействия, приводящие к реорганизации генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор. На основе мультило-кусной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов разработан способ идентификации штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор и дифференциации их по эпидемическому потенциалу на основе анализа структуры острова панде-мичности VSP-II.

В GenBank депонированы нуклеотидные последовательности полных генов изогенных штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор М1275 (код доступа и М1275D (код доступа соответственно с ин-тактным и делетированным островом пандемичности VSP-I.

В Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» депонированы изогенные штаммы геновариантов V. cholerae М1275 и М1275 VSP-I с интактным и делетированным островом пандемичности VSP-I (КМ277 1-2). Полученные изогенные штаммы могут быть использованы для изуче-

ния влияния VSP-I на биологические свойства штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор.

Одобрены Ученым советом (протокол №5 от 24.06.2014 г.) и утверждены директором ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Способ идентификации токсигенных штаммов геновариантов возбудителя холеры Эль Тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу».

Полученные новые сведения о выживаемости штаммов геновариантов V. cholerae О1 биовара Эль Тор после действия неблагоприятных факторов внешней среды используются при чтении лекций «Микробиология и генетика возбудителя холеры» на курсах профессиональной переподготовки по особо опасным инфекциям при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Методология и методы исследования.

В работе использовано 53 штамма V. cholerae О1 и О139 серогрупп и 6 штаммов других бактерий. Применяли традиционные и современные микробиологические, биохимические и молекулярно-генетические методы. Продукцию холерного токсина (ХТ) изучали методом GM₁ ELISA (Svennerholm et al., 1983; Iwanaga M. et al., 1986). Биосинтез MSHA пилей устанавливали по методике L.F. Hanne и R.A. Finkelstein (1982). Наличие растворимой гемагглютинин протеазы (НАР), фосфолипазы, гемолизина определяли согласно ранее описанным способам (Tan, Tan, 1988; Finkelstein et al.,1992; Singh et al., 2001). Подвижность исследовали на полужидком (0,4 %) LB агаре. Способность штаммов V. cholerae формировать биопленку анализировали согласно методике J. Nesper с соавт. (2001). Выживаемость штаммов изучали в 0,14 моль растворе NaCl и фильтрованной автоклавированной речной воде (р. Волга), после действия высокой (42 ^оС) и низкой (5 ^оС) температуры, осмотического и оксидативного стрессов (Wai et al., 1998). Электрофорез в присутствии SDS осуществляли по известному методу (Laemmli, 1970), окрашивая белки после электрофореза раствором кумаси R-250, полисахариды – азотнокислым серебром (Hitchcock, Brown, 1983). Сравнительную оценку содержания экзо-полисахарида в образцах проводили методом денситометрии с помощью «Универсальной компьютерной программы для количественного учета биохимических реакций», разработанной в РосНИПЧИ «Микроб» (Бойко с соавт., 2015). Атомно-силовую микроскопию проводили на сканирующем зондовом микроскопе «Solver P47-PRO» (NT-MDT, Россия). ПЦР с использованием специфических праймеров выполняли на термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Полногеномное секвенирование штаммов V. cholerae осуществлялось по технологии ионного полупроводникового секвенирования Ion Torrent на приборе «Ion PGM» (Thermo Fisher Scientific, США). Нуклеотидные последовательности генов анализировали с помощью программного пакета Lasergene DNASTAR SeqMan pro, а также freeware-программы BioEdit. Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью программ Microsoft Excel (Microsoft Office 2003) и

Statistica 6.0 (StatSoft), вычисляя среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической и доверительный интервал.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Нуклеотидные последовательности структурных и регуляторных генов, обеспечивающих подвижность, биосинтез экзополисахарида, формирование биопленки, устойчивость к стрессовым факторам консервативны у штаммов гено-вариантов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенных в разные годы на территорию Российской Федерации. В генах, участвующих в сборке и секреции MSHA пилей, присутствуют SNPs, которые могут служит генетической меткой штаммов генова-риантов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенных после 1997 года.

2. Штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор в отличие от типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор устойчивы к температурному (42 ^оС и 5 ^оС) стрессу. Геноварианты, выделенные в Российской Федерации в 1993– 2001 гг., также устойчивы к осмотическому (3 моль раствор NaCl) и оксидативному (20 ммоль раствор Н₂О₂) стрессам. Повышенная выживаемость штаммов геновари-антов в условиях низкой температуры (5 ^оС) и высокой осмолярности (3 моль раствор NaCl) обеспечивается продукцией экзополисахарида на поверхности клеток. Одним из факторов, оказывающих влияние на структуру генома штаммов генова-риантов V. cholerae биовара Эль Тор является 20 ммоль раствор перекиси водорода.

3. Созданная мультиплексная ПЦР с электрофоретическим учетом результатов позволяет определять серогруппу, биовар, токсигенность исследуемого штамма V. cholerae, выявлять штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор и дифференцировать их на основе анализа структуры острова пандемичности VSP-II на штаммы с низким и высоким эпидемическим потенциалом.

Степень достоверности и апробация результатов.

Работа выполнена на сертифицированном и прошедшем метрологическую поверку оборудовании. В серии экспериментов показана воспроизводимость результатов исследования. Сделанные выводы основываются на значительном объеме статистически обработанных экспериментальных данных.

Материалы диссертации представлены на Всероссийской научно-

практической конференции «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины» (Ставрополь, 2014), совещании специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемического надзора за холерой (Ростов-на-Дону, 2014), VII Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2015), 19-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2015), ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2014-2016).

Личный вклад автора

Автор непосредственно проводил анализ литературы, участвовал в обсуждении цели и задач исследования, планировании экспериментов, получении и обработке экспериментальных данных. Работа по определению устойчивости штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор к действию неблагоприятных факторов внешней среды проводилась совместно с вед. науч. сотр., к.м.н. И.М. Крепостно-вой. Подготовка основных публикаций осуществлена как лично автором, так и при его непосредственном участии.

Публикации и связь работы с научными программами.

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из которых 5 статей в рекомендованных ВАК изданиях и один патент.

Работа выполнена в отделе микробиологии ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Рос-потребнадзора в рамках плановой НИР 47-4-14 «Молекулярно-генетический анализ механизмов изменения патогенных и адаптивных свойств Vibrio cholerae биовара эльтор в современный период 7-ой пандемии холеры» (2014-2018 гг., № гос. регистрации №0120.0850501), а также Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации» 2009-2014 гг.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 195 работ, из них 44 отечественных и 151 зарубежных авторов. Общий объем диссертации составляет 130 страниц. Текст иллюстрирован 9 таблицами и 18 рисунками.

Механизмы адаптации возбудителя холеры к условиям различной осмолярности

В результате изучения экологии холерного вибриона установлен ряд физических, химических, биологических факторов (изменение температуры, рН, осмолярности, концентрации кислорода, питательных веществ, присутствие бактериофагов, простейших и т.д.), оказывающих влияние на численность популяции V. cholerae в водной среде. Среди них значительными признаны изменение температуры и осмолярности среды. (Colwell, Huq, 1994; McCarthy, 1996; Pascual et al., 2002; Collins, 2003; Huq et al., 2005; Lutz et al., 2013; Islam et al., 2015

Холерный вибрион является галлофилом и для нормального роста ему необходимо 2,0-2,5 % (или 5-15 мМ) содержание NaCl в среде выращивания (Miller et al., 1984; Odi et al., 2007). Однако при высокой температуре и присутствии в достаточном количестве питательных субстратов токсигенные штаммы V. cholerae могут размножаться в средах, как с низкой, так и с высокой концентрацией соли (Vimont, Berche, 2000). Так при температуре 4 оС и 1 % концентрации NaCl штаммы V. cholerae биовара Эль Тор выживали до 45 дней, а в воде с содержанием соли от 0,1 до 3 % при температуре 25 С сохранялись до 72 дней (Miller et al., 1984). При температуре 30 С (рН 8,5) и 15 % концентрации соли V. cholerae усиленно прикреплялись и размножались на копеподах (веслоногих ракообразных) (Colwell, 1996; Huq et al., 2005). Кроме того, дефицит, а также избыток солей натрия компенсируется увеличением концентрации органических веществ, присутствие которых способствует усиленному росту холерного вибриона. Так добавление в среду выращивания органических веществ способствовало выживанию V. cholerae и при концентрации соли 45 %, а также в пресной воде (Singleton et al., 1982; Huq et al., 1984; Miller et al., 1984).

Pflughoeft K.J. с соавт. экспериментально доказали, что штаммы V. cholerae, выращенные в условиях повышенного содержания соли, хорошо растут как в условиях низкого (5 мМ), так и высокого (500 мМ) содержания хлорида натрия и в смешанной популяции вытесняют клоны, которые росли на средах с низким содержанием соли. Данные авторы высказали предположение, что попадание таких адаптированных штаммов V. cholerae в кишечник, имеющего высокую осмолярность, способствует их быстрому росту и размножению, в отличие от штаммов, обитавших в пресных водоемах, у которых в данных условиях может быть осмотический шок и задержка роста. Кроме того, небольшое повышение концентрации соли (например, в результате заброса морской воды в пресноводный водоем) может вызвать резкий рост патогена и как следствие повышение вероятности заражения человека (Pflughoeft et al., 2003).

Молекулярные механизмы устойчивости к осмотическому стрессу (активация систем транспорта, биосинтез осмопротекторов) являются общими для многих видов, в том числе и для возбудителя холеры (Ленгелер с соавт., 2005; Селиванова, 2012; Wood et al., 2001; Sleator, Hill, 2002; He et al., 2010; Altendorf et al., 2013). В модельных экспериментах N.J. Shikuma и F.H. Yildiz установили, что даже небольшое увеличение концентрации NaCl (с 0 до 0,5 М) приводит к изменению экспрессии 333 генов V. cholerae, большинство из которых вовлечены в метаболизм клеток, в процесс формирования клеточной оболочки, патогенез. Однако значительное количество генов (42,9 %) кодируют биосинтез белков с неустановленной функцией (Shikuma, Yildiz, 2009). При этом авторы выявили три группы генов – транскрипция первой группы активировалась в условиях повышенной концентрации NaCl (0,5 М), второй – при средней (0,1-0,2 М), третьей – при низкой.

При низком содержании NaCl в среде выращивания увеличивается транскрипция генов, ответственных за биосинтез компонентов клеточной стенки (мембраносвязанных олигосахаридов MdoG, MdoH), а также полиаминов (SpeA, SpeB), необходимых для роста клеток (Shikuma, Yildiz, 2009).

При повышении концентрации хлорида натрия увеличивается продукция пигмента меланина, который также защищает клетки от повреждающего действия ультрафиолетовых лучей (солнечный свет) (Сoyne, al-Harthi, 1992), происходит активация структурных и регуляторных генов, необходимых для формирования биопленки (участвующих в биосинтезе MSHA, вовлеченных в биосинтез экзополисахарида и регулирующих архитектуру биопленки), продукции осмопротектора эктоина, Na+/H+ антипортера, белков-поринов внешней мембраны – OmpU/OmpТ (Shikuma, Yildiz, 2009). В зависимости от осмолярности среды содержание белка OmpU, выполняющего адгезивную функцию и защищающего клетки от действия желчи и органических кислот, может составлять от 30 до 60 % от количества всех белков внешней мембраны (Chakrabarti et al., 1996).

Увеличение экспрессии генов в ответ на повышение концентрации NaCl у возбудителя холеры связано с усилением биосинтеза альтернативных сигма-субъединиц РНК-полимеразы – rpoS (38), rpoH (32) и rpoN (54) (Fu X. et al., 2014). Это закономерный процесс, так как накопление альтернативных сигма-субъединиц обеспечивает своевременную транскрипцию генов, необходимых для выживания в условиях стресса и является общим механизмом, позволяющим адаптироваться к стрессовым воздействиям различным бактериям (Hengge-Aronis, 2002; Hosseinkhan et al., 2015).

Важная роль в регуляции концентрации соли в цитоплазме бактерий принадлежит различным транспортным системам (помпам), пронизывающим клеточную мембрану и связанным с внешней средой. Так в удалении токсичных для клетки ионов Na+ при их значительной концентрации в обмен на Н+ участвует антипортерная система (Shikuma, Yildiz, 2009). Антипортер холерного вибриона состоит из двух мембранных белков – NhaA и NhaB (Vimont, Berche, 2000; Hse, Barquera, 2001).

Еще одним механизмом поддержания осмотического равновесия является транспорт ионов К+, при этом важную роль играет не концентрация данного иона в клетке, а соотношение Na+/К+. У бактерий описаны три транспортные системы (Kup, Trk и Kdp), активно выводящие ионы Na+ из клетки в обмен на поступление ионов К+ (Schlosser et al., 1995; Sleator, Hill, 2002; Fu et al., 2014). У возбудителя холеры важная роль при солевом стрессе принадлежит транспортной системе Trk (Fu et al., 2014).

Определение продукции маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии

При анализе выживаемости исследуемых штаммов в автоклавированной речной воде были выявлены некоторые отличия от их выживаемости в 0,14 моль растворе NaCl. Показано, что штаммы геновариантов лучше адаптировались в данных условиях, в отличие от типичных штаммов. Так на 21 день инкубации количество высеваемых бактерий геновариантов в 3,5-4,0 раза превышало КОЕ типичных штаммов. Исключение составил только типичный штамм V. cholerae С402, выживаемость которого была сопоставима со штаммами геновариантов (рис. 10).

При этом отличий по выживаемости между штаммами геновариантов в зависимости от структуры VSP-II выявлено не было. Рисунок 10. Выживаемость штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на 21 день нахождения в автоклавированной речной воде. М713, М818, М738, М1261, С402 – типичные штаммы. М1270, М1266, М1293, М1298 – штаммы геновариантов с интактным VSP-II. М1429, М1430, Р18899, L3226, L4150, 301 – штаммы геновариантов, содержащие VSP-II с протяженной делецией. Учитывая отсутствие данных, о влиянии голодания на изменение фенотипических свойств штаммов геновариантов, имеющих разную структуру VSP-II, на следующем этапе работы был проведен сравнительный анализ влияния дефицита питательных веществ на изменение продукции ХТ, НАР, гемолизина, биосинтез белков-поринов внешней мембраны OmpU и OmpТ, экзополисахарида, способности формировать биопленку, а также подвижность. Исследовали штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, находившиеся в течение пяти месяцев в автоклавированной речной воде. В результате выявлено, что у всех изученных штаммов снизился биосинтез ХТ (в среднем в 10 раз) (табл. 5). У большинства штаммов (70 %) уменьшилась продукция гемолизина (в 1,5-2,0 раза), а также подвижность. В то же время у 50 % изолятов выявлено увеличение протеазной активности (в среднем в 1,5 раза). Снижение продукции ХТ и повышение биосинтеза НАР, возможно, связано с тем, что в условиях дефицита питательных веществ увеличивается экспрессия регуляторного белка HapR, положительно регулирующего продукцию данного фермента, но угнетающего биосинтез ХТ (Joelsson et al., 2007). Необходимо отметить, что по данным M.S. Islam с соавт. (2002) повышенная продукция в водных биоценозах растворимой гемагглютинин-протеазы обеспечивает продолжительное выживание клеток холерного вибриона в ассоциациях с цианобактериями. HАР, обладая муциназной активностью, разрушает слизистую оболочку цианобактерий, предоставляя клеткам холерного вибриона дополнительный источник питательных веществ.

Инкубирование в автоклавированной речной воде не оказало значительного влияния на способность большинства изученных штаммов геновариантов V. cholerae формировать биопленку (табл. 5).

Не было выявлено изменений и в экспрессии белков-поринов внешней мембраны OmpU и OmpT (табл. 5). Исключение составил только штамм V. cholerae Р18899, который перестал продуцировать белок OmpU. Возможно, отсутствие OmpU, было связано с формированием в популяции только данного штамма нетосигенных клонов, утративших профаг СТХ. Согласно ранее полученным данным у штамма V. cholerae Р18899 присутствует одна копия профага СТХ (Заднова с соав., 2012), которую он утрачивает, находясь в неблагоприятных в условиях. Возможно, с потерей профага изменяются регуляторные механизмы, которые отражаются на биосинтезе белков внешней мембраны.

Необходимо отметить, что остальные изученные штаммы геновариантов стабильно сохраняли профаги СТХ и RS1, острова патогенности VPI-1 и VPI-2, острова пандемичности VSP-I и VSP-II. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что изученные штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор способны длительное время выживать в условиях дефицита питательных вешеств (0,14 моль раствор NaCl, автоклавированная речная вода). При этом различий между штаммами геновариантов, имеющими разную структуру острова пандемичности VSP-II, а также в сравнении с типичными изолятами при инкубировании в 0,14 моль растворе NaC выявлено не было. В то же время штаммы геновариантов, не зависимо от структуры VSP-II, лучше, чем типичные штаммы, выживали в автоклавированной речной воде. При сравнительном изучении экспрессии генов адаптации у штаммов геновариантов, помещенных в автоклавированную речную воду, выявлено снижение продукции ХТ, у 70 % исследованных штаммов уменьшение биосинтеза гемолизина, а также подвижности. В то же время у половины изученных штаммов (50 %) увеличилась продукция НАР. Изменения в экспрессии экзополисахарида, белков-поринов OmpT/OmpU, а также в способности к формированию биопленки не выявлены. При нахождении в автоклавированной речной воде все изученные штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор стабильно сохраняли мобильные генетические элементы с генами вирулентности и пандемичности. Исключение составил штамм V. cholerae Р18899 в популяции которого выявлены атоксигенные клоны, утратившие профаг СТХ.

Сравнительный анализ способности штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор к формированию биопленки

У выживших после инкубации в солевом растворе и перекиси водорода штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор была изучена продукция ферментов патогенности (НАР, фосфолипазы), гемолизина, биосинтез экзополисахарида, белков внешней мембраны, а также подвижность. В результате различий в продукции ферментов патогенности и гемолизина выявлено не было. Не установлены изменения и в биосинтезе белков внешней мембраны – OmpU/OmpT.

В то же время у всех исследуемых штаммов было отмечено снижение в 2-3 раза подвижности. Уменьшение подвижности может быть связано со снижением активности Na+-транспортирующей NADH-убихинон редуктазы – фермента, регулирующего работу жгутика холерного вибриона. Повышение концентрации ионов натрия в окружающей среде приводит к снижению активности этого фермента, и, как следствие, уменьшению подвижности (Hse, Mekalanos, 1999; Kojima et al., 1999).

При последующем культивировании штаммов геновариантов на обычных питательных средах их подвижность возвращалась к исходному уровню, в отличие от типичных штаммов, которые оставались малоподвижными. Как известно, неподвижные (или малоподвижные) вибрионы не способны преодолевать слизистый слой кишечника и прикрепляться к эпителиоцитам, а при обитании в водоемах не формируют биопленку и уничтожаются простейшими. (Gardel et al., 1996; Lauriano et al., 2004). Учитывая полученные данные, можно предположить, что восстановление подвижности у штаммов геновариантов после прекращения действия стресса указывает на их способность лучше адаптироваться, по сравнению с типичными штаммами, к изменениям условий окружающей среды.

С целью изучения механизма повышенной выживаемости штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенных в 1993-2001 гг., в условиях осмотического стресса было исследовано наличие экзополисахарида на поверхности их клеток. В результате установлено, что у всех штаммов геновариантов, а также типичных изолятов, подвергшихся действию осмотического стресса, ЭПС присутствует. Однако нами установлено, что ЭПС в клетках геновариантов, выделенных в 1993-2001 гг., начинает синтезироваться в более ранние сроки. Так, на поверхности клеток геновариантов, подвергшихся действию осмотического стресса, ЭПС появляется уже через 40 мин инкубации, в то же время у типичных штаммов он отсутствовал и был выявлен только спустя 90 мин инкубации (рис. 17). Необходимо отметить, что через 90 мин нахождения в солевом растворе популяция типичных штаммов практически погибала и жизнеспособными оставались единичные клетки.

Изображение клеток типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор М1261 (А) и геноварианта М1293 (Б) (40 мин инкубации в 3 моль растворе NaCl). ЭПС – экзополисахарид. После действия оксидативного стресса на клетки типичных Эль Тор вибрионов и штаммов геновариантов различий в продукции НАР, фосфолипазы, гемолизина, а также подвижности обнаружено не было. Возможно, изменения в биосинтезе изученных факторов не происходили в результате кратковременного (10-15 мин) влияния данного стрессового фактора.

Таким образом, один из выявленных механизмов повышенной устойчивости штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенных в 1993-2001 гг. и имеющих интактный (или с незначительной делецией) VSP-II, к высоким концентрациям соли связан с продукцией на поверхности клеток экзополисахарида в более ранние сроки, чем у типичных штаммов. Механизм устойчивости штаммов геновариантов, выделенных в 1993-2001 гг., к оксидативному стрессу пока не установлен и будет задачей наших дальнейших исследований.

Заключительный этап работы был посвящен исследованию структуры генома штаммов геновариантов, подвергшихся действию оксидативного и осмотического стрессов. Для анализа были взяты все выросшие на последних минутах эксперимента (8-10 мин при действии перекиси водорода и 90-120 мин после инкубации в растворе соли) единичные колонии. Полученные клоны были проверены на наличие структурных и регуляторных генов, входящих в состав 6 мобильных генетических элементов: профагов CTX (ctxA, cep, zot, ace) и RS1 (rstC), островов патогенности VPI-1 (tcpA, toxT) и VPI-2 (nanH), островов пандемичности VSP-I (vc0180, vc0181) и VSP-II (vc0492, vc0496, vc0502, vc0514). В итоге в популяции штаммов геновариантов V. cholerae М1264 и M1275, полученных после действия перекиси водорода, было выявлено три вида клонов: сохранившие все тестируемые МГЭ, утратившие профаг RS1 (штамм M1264) или лишенные острова пандемичности VSP-I (штамм M1275). При этом частота образования VSP-I клонов в популяции штамма V. сholerae М1275 составляла 20 %. В то же время частота появления RS1 клонов в попуции штамма V. сholerae М1264 была выше и составляла 30 %.

Таким образом, после действия 20 ммоль раствора перекиси водорода в популяции штаммов геновариантов могут появляться клоны, утратившие некоторые МГЭ.

Далее у полученных изогенных клонов было проведено исследование экспрессии генов. В результате установлено, что утрата профага RS1 в штамме V. сholerae М1264 RS1 приводит к уменьшению продукции гемолизина (в 1,8 раз), но повышению биосинтеза НАР (в 4,5 раз), фосфолипазы (в 2,3 раза), а также подвижности (в 3,8 раз) (табл. 6). В то же время потеря острова пандемичности VSP-I в штамме V. сholerae М1275 VSP-I не оказывает влияние на биосинтез холерного токсина, но приводит к снижению в два раза гемолитической и в 1,6-2,1 ферментативной активности, а также подвижности (1,8 раз) (табл. 6).

Полученные изогенные клоны штамма геноварианта V. сholerae биовара Эль Тор М1275 с интактным и делетированным островом пандемичности VSP-I депонированы в Государственную коллекцию патогенных бактерий института "Микроб" под номером КМ277 (1-2). Нуклеотидные последовательности полных геномов данных штаммов импортированы в международную базу данных GenBank (М1275 – код доступа LRAF00000000; М1275D – код доступа LRAG00000000) . Таблица 6. Сравнительный анализ фенотипических свойств у изогенных штаммов V. сholerae биовара Эль Тор с интактными и делетированными МГЭ.

Штамм V. сholerae Токсино-продукция, мкг/мл Продукциягемолизина,мм Биосинтез НАР, мм Продукцияфосфолипазы,мм Подвижность, мм M1264 исходный 0,6±0,15 2,2±0,42 0,64±0,1 0,75±0,17 1,06±0,34 M1264ARS1 н.и. 1,19±0,1 2,65±0,21 1,83±0,18 4,21±0,35 M1275 исходный 0,4±0,2 1,0 2,55±0,38 2,04±0,05 5,67±0,54 M1275AVSP-I 0,38±0,2 0,5 1,63±0,3 0 3,2±0,63 Примечания: – при определении продукции гемолизина, НАР, фосфолипазы измеряли зону просветления на агаре с добавлением соответственно эритроцитов барана, обезжиренного молока, эмульсии яичного желтка; – учитывали зону роения колонии на полужидком агаре. Приведены средние значения трех опытов.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что в популяции штаммов геновариантов V. сholerae биовара Эль Тор после действия оксидативного стресса появляются клоны, утратившие профаг вирулентности RS1 или остров пандемичности VSP-I. Полученные изогенные штаммы могут быть использованы при проведении модельных экспериментов по исследованию влияния профага RS1 и острова пандемичности VSP-I на биологические свойства штаммов геновариантов.

Влияние температурного стресса на экспрессию генов и структуру генома штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор

Учитывая отсутствие данных, о влиянии голодания на изменение фенотипических свойств штаммов геновариантов далее был проведен сравнительный анализ влияния дефицита питательных веществ на изменение продукции ХТ, НАР, гемолизина, биосинтез белков-поринов внешней мембраны OmpU и OmpТ, экзополисахарида, способности формировать биопленку, а также подвижность. Исследования проводили на штаммах геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, культивируемых в автоклавированной речной воде. У всех штаммов геновариантов, не зависимо от структуры VSP-II, установлено снижение продукции ХТ (в среднем в 10 раз), у 70 % уменьшение биосинтеза гемолизина, а также подвижности. В то же время у 54 % штаммов возросла протеазная активность. При этом инкубирование в автоклавированной речной воде не оказывало влияние на биосинтез белков-поринов OmpU/OmpT и продукцию экзоплисахарида, а также способсность штаммов формировать биопленку.

При нахождении в условиях недостатка питательных веществ штаммы геновариантов стабильно сохраняли профаги СТХ и RS1, острова патогенности VPI-1 и VPI-2, острова пандемичности VSP-I и VSP-II, что согласуется с данными других авторов (Миронова с соавт., 2016; Титова с соавт., 2016а).

Исключение составил штамм V. cholerae Р18899, у которого при нахождении в автоклавированной речной воде были обнаружены атоксигенные клоны.

Особый интерес представляют полученные нами данные о лучшей адаптации штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с разной структурой VSP-II к повышенной (42 оС) и пониженной (5 оС) температуре по сравнению с типичными Эль Тор вибрионами. Так на 10 сут нахождения при температуре 5 оС количество бактерий геновариантов превышало КОЕ типичных штаммов в 11,3-13,5 раза. Через 21 день инкубации при температуре 42 оС количество выживших бактерий геновариантов в 6,7-15,0 раз превышало КОЕ типичных штаммов, через три месяца все штаммы геновариантов сохраняли жизнеспособность, в то время как типичные штаммы уже не высевались. Один из выявленных механизмов устойчивости штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор к высокой температуре связан с увеличением биосинтеза белков-поринов внешней мембраны OmpT/OmpU, а при низкой температуре – с продукцией клетками экзополисахарида.

ПЦР-анализ изолятов, полученных после действия температурного стресса, показал стабильное сохранение всех тестируемых мобильных генетических элементов. Следует отметить, что у энтеробактерий ответ на тепловой шок связан с реакциями на другие стрессы. Например, у кишечной палочки при тепловом шоке наблюдается повышение синтеза каталазы – белка окислительного шока, который при высокой температуре способствует выживанию бактерий благодаря удалению пероксидов, образование которых усиливается с повышением температуры (Ленгелер с соавт., 2005). Учитывая полученные нами данные о лучшей выживаемости штаммов геновариантов в условиях теплового шока было высказано предположение, что они могут быть устойчивы и к действию других стрессовых факторов. Действительно, дальнейшие эксперименты показали, что штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, в отличие от типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, более устойчивы к осмотическому (3 моль раствор NaCl) и оксидативному (20 ммоль раствор перекиси водорода) стрессам. При этом повышенной выживаемостью отличались только штаммы геновариантов, содержащие интактный VSP-II и завезенные в Российскую Федерацию в ранние годы (1993-2001 гг.). В то же время выживаемость штаммов геновариантов, изолированных в современный период (2004-2011 гг.) и содержащих VSP-II с протяженной делецией, была ниже и сопоставима с типичными штаммами. Возможно, появившиеся в 90-х годах штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, в результате повышенной устойчивости к неблагоприятным факторам, получили селективное преимущество и вытеснили типичные изоляты. В то же время причины глобального распространения в современное время штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, отличительной генетической особенностью которых является наличие VSP-II с протяженной делецией, пока не выявлены. Мы предполагаем, что данные штаммы лучше адаптируются in vivo, но для проверки данного предположения необходимы дальнейшие исследования.

При изучении экспрессии генов после действия осмотического стресса не выявлены различия в продукции ферментов патогенности, гемолизина, а также белков внешней мембраны OmpU/OmpT. В то же время у всех исследуемых штаммов отмечено снижение в 2-3 раза подвижности. При этом показано, что один из механизмов повышенной устойчивости штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, содержащих интактный (или с небольшой делецией) VSP-II, к осмотическому стрессу связан с продукцией экзополисахарида в более ранние сроки, чем у типичных штаммов. После действия оксидативного стресса изменения в продукции ферментов патогенности, гемолизина, белков внешней мембраны и экзополисахарида у изученных штаммов геновариантов не выявлены. При этом механизм повышенной устойчивости штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, содержащих интактный VSP-II, к оксидативному стрессу, нами пока не установлен и будет задачей дальнейших исследований.