Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Тенденция и особенности эпидемиологической ситуации по холере на современном этапе развития седьмой пандемии в мире и на территории Российской Федерации 16
1.2 Результаты микробиологических мониторинговых исследований объектов окружающей среды на наличие холерных вибрионов О1, О139 серогрупп, как основа разработки ГИС 20
1.3 Современное информационно-аналитическое обеспечение мониторинга инфекционных заболеваний, в том числе особо опасных инфекций, на территории Российской Федерации 24
1.4 ГИС-технология как инструмент информационного анализа в рамках проведения мониторинговых исследований за холерой на территории Российской Федерации 27
Глава 2. Материалы и методы 33
2.1. Бактериальные штаммы холерных вибрионов 33
2.2 Питательные среды для выделения и культивирования холерных вибрионов 34
2.3 Контроль качества питательных сред, используемых для проведения идентификации изучаемых штаммов холерных вибрионов 35
2.4 Методы идентификации выделенных культур холерных вибрионов с комплексным определением эпидзначимости. Фаготипирование изучаемых штаммов холерных вибрионов.. 35
2.5 Методы ПЦР-генотипирования штаммов холерных вибрионов 35
2.6 Метод VNTR-генотипирования штаммов холерных вибрионов 44
2.7 Статистическая обработка результатов 44
Глава 3. Ретроспективный информационный анализ результатов мониторинга холерных вибрионов О1, О139 в объектах окружающей среды на территориях федеральных округов Российской Федерации и их субъектов с 1989г. по 2016г 46
3.1 Федеральные округа Российской Федерации и их субъекты, на территории которых регистрировалось выделение из объектов окружающей среды холерных вибрионов различной эпидзначимсти 46
3.2 Анализ динамики выделения штаммов холерных вибрионов О1, О139 из объектов окружающей среды на территориях субъектов Российской Федерации с 1989г. по 2016г 47
3.3 Анализ результатов мониторинга холерных вибрионов в пространственном, временном и микробиологическом аспектах с привязкой к конкретным объектам окружающей среды на территории России . 54
Глава 4 Сравнительная характеристика фено- и гено типических свойств штаммов холерных вибрионов О1, О139, выделенных из объектов окружающей среды на различных территориях России с 1989г. по 2016г 70
4.1 Фенотипическая характеристика штаммов холерных вибрионов, изолированных из поверхностных водоёмов и стоков на территории Российской Федерации 70
4.2 Молекулярно-биологическая характеристика штаммов холерных вибрионов, изолированных из поверхностных водоёмов и стоков на территории Российской Федерации 79
Глава 5. Разработка пополняемой геоинформационной системы «Холера 1989-2014» и алгоритма работы с ней 82
5.1 Создание и характеристика базы данных ГИС «Холера 1989-2014» 82
5.1.1 Установка компьютерной программы; работа с базой данных и редактирование информации 83
5.1.2 Поиск идентичных и схожих штаммов 86
Глава 6 ПЦР-генотипирование нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор, выделенных из объектов окружающей среды на территории России 89
6.1 Установление ПЦР-генотипа нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, изолированных из поверхностных водоёмов и стоков на разных территориях Российской Федерации 89
6.2 Алгоритм расчета минимального числа генов-мишеней для детекции при ПЦР-генотипировании и определение генотипов репрезентативной выборки нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор 89
6.3 Анализ ПЦР-генотипов репрезентативной выборки неток-сигенных штаммов холерных вибрионов, изолированных из поверхностных водоёмов и стоков на территории Российской Федерации 95
Глава 7 Прикладное использование способа геноти пирования нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 El Tor по минимальному набору генов-мишеней, выделенных из объектов окружающей среды на различных административных территориях 101
7.1 Сравнительная ПЦР генотипическая характеристика не токсигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor ctxAcpA+ по минимальному набору детерминант факторов патогенности 101
7.2 Анализ данных генотипирования по 14 генам-мишеням факторов патогенности/персистенции V. cholerae О1 El Tor, изолированных из водных экосистем на территории Краснодарского края 109
7.3 Анализ соотношения между обнаружением в ООС токси-генных и нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor на территории Российской Федерации с 2001г. по 2016г 114
7.4 Определение соотношения между обнаружением в ООС штаммов V. cholerae O1 El Tor и бактериофагов холерных вибрионов на территории Ростовской области с 2008г. по 2010г 117
Заключение 119
Выводы 126
Список использованной литературы 128
- Результаты микробиологических мониторинговых исследований объектов окружающей среды на наличие холерных вибрионов О1, О139 серогрупп, как основа разработки ГИС
- Анализ результатов мониторинга холерных вибрионов в пространственном, временном и микробиологическом аспектах с привязкой к конкретным объектам окружающей среды на территории России
- Анализ ПЦР-генотипов репрезентативной выборки неток-сигенных штаммов холерных вибрионов, изолированных из поверхностных водоёмов и стоков на территории Российской Федерации
- Анализ данных генотипирования по 14 генам-мишеням факторов патогенности/персистенции V. cholerae О1 El Tor, изолированных из водных экосистем на территории Краснодарского края
Результаты микробиологических мониторинговых исследований объектов окружающей среды на наличие холерных вибрионов О1, О139 серогрупп, как основа разработки ГИС
Мониторинговые исследования, направленные на своевременное обнаружение в ООС холерных вибрионов различных серогрупп и токсигенности являются неотъемлемой частью микробиологического звена безальтернативного и, своего рода, уникального эпидемиологического надзора за холерой в нашей стране [Приказ № 88 от 17 марта 2008 г. «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней»; Ежова М.И. с соавт., 2011; Кругликов В.Д. с соавт., 2012; Кузнецов А.А. с соавт., 2012; Васильева О.В. с соавт., 2013; Морозова Л.Ф., 2014; Москвитина Э.А. с соавт., 2013, 2015; Балахонов С.В. с соавт., 2014, 2015; Онищенко Г.Г. с соавт., 2015, 2016].
Данные исследования проводятся в соответствии с действующей нормативной документацией [МУК 4.2.2218-07; МУК 4.2.2870-11; СП 3.1.1.2521-09], в том числе и оперативно-информационными документами Руководителя Роспотребнадзора [Информационные письма «Об эпидемиологической ситуации по холере в 2014, 2015 и 2016гг. и прогнозе заболеваемости»], и имеют важное значение в системе эпидемиологического надзора для объективной оценки эпидемиологической ситуации по холере и её прогнозирования на территории России. Мониторинговые исследования вибриофлоры ООС проводятся на территории ФО Российской Федерации и входящих в них субъектов, образованных в соответствии с Указами Президента Российской Федерации №82 от 13 мая 2000г «О внесении изменений в перечень федеральных округов»; №168 от 21 марта 2014г. «Об образовании Крымского федерального округа»; №375 от 28 июля 2016г. «О Южном федеральном округе».
Российская Федерация не является эндемичной по холере территорией, в то же время ежегодное выделение нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor в течение летнего периода из водных экосистем подтверждает возможность вовлечения ООС в эпидемиологический процесс при заносе токсигенных штаммов с эндемичных по холере территорий, а также указывает на необходимость выявления потенциальных и реальных рисков контаминации холерными вибрионами О1, О139 водных объектов и их устранения [Балахонов С.В. с соавт., 2010, 2012-2014; Титова С.В. с соавт., 2016]. У холерных вибрионов Эль Тор выработались адаптивные механизмы, способствующие вариабельным срокам выживания популяции в различных климато-географических условиях [Кульшань Т.А. с соавт., 2006, 2014, 2015; Онищенко Г.Г. с соавт., 2016]. Сброс большого количества неочищенных хозяйственно-бытовых сточных вод в водоемы, интенсивное загрязнение ООС, включая образование придонного ила, обусловливают возможность сохранения холерных вибрионов продолжительное время, в том числе в зимний период. Отмечено, что на территории России (Краснодарский край, р. Агура, 2015г.) нетоксигенные штаммы холерных вибрионов постоянно выделялись на протяжении более одного месяца [Титова С.В. с соавт., 2016].
Трактовка результатов микробиологического мониторинга может иметь двойственный характер: с одной стороны, в случае обнаружения в воде открытых водоёмов токсигенных штаммов V. cholerae О1 речь идёт об угрозе этих объектов как резервуара инфекции, а с другой – при повышении частоты выделения нетоксигенных культур можно косвенно судить о создавшихся благоприятных условиях для реализации водного пути распространения холеры в случае попадания возбудителя в водоёмы и стоки в результате заноса [Заднова С.П. с соавт., 2011, 2012, 2015; Кругли-ков В.Д. с соавт., 2012; Агафонов Д.А. с соавт., 2016].
В водной среде вибрионы Эль Тор обладают значительным диапазоном экологической толерантности. Вместе с тем, в окружающей среде, куда попадает большое количество разнообразных соединений, обладающих мутагенной активностью, с той или иной частотой отмечается изменение ряда свойств вибрионов: появляются клоны, не имеющие полного кластера коровой области CTX, но имеющие кластер VPI (tcpА и toxT), а также проявляется изменчивость по резистентности к фагам эль тор и классический [Онищенко Г.Г. с соавт., 2007; Горяев А.А. с соавт., 2011; Гриднева Л.Г. с соавт., 2014; Кульшань Т.А. с соавт., 2015; Куликалова Е.С. с соавт., 2015; Агафонов Д.А. с соавт., 2016; Титова С.В. с соавт., 2016; Soumen C. et al 2000; Reguera G. et al., 2005; Monakhova E.V., 2010 Kumar P. et al., 2011].
Оценка эпидемической значимости штаммов V. cholerae О1 в первую очередь требует определения наличия/отсутствия генетических детерминант основных факторов патогенности – гена ctxA холерного токсина (СТ) и гена tcpA – токсин-корегулирующих пилей адгезии (ТСР). Помимо основных факторов патогенности особое значение имеет ряд генетических детерминант дополнительных токсинов, количество и уровни экспрессии которых могут различаться от штамма к штамму [Водопьянов СО. с соавт, 2003; Смирнова Н.И. с соавт., 2011; Монахова Е.В., 2012; Титова СВ. с соавт., 2016]. К числу факторов патогенности холерных вибрионов относятся, в частности, токсины Zot, Асе и адгезин Сер, гены которых входят в состав полного и неполного профага СТХср; гемагглютинин/протеаза (НАР), способная нарушать барьерную функцию эпителия; цитотонический фактор Се/ (СНО cell elongating factor), который, аналогично холерному токсину, вызывает удлинение клеток СНО и способствует накоплению жидкости в кишечнике мышей-сосунков; цитотоксический кластер RTX (RtxA и его ACD-домен), продукт которого вызывает деполимеризацию и ковалентное связывание актина в клетках кишечника; RtxC -активатор RtxA; ACD-vgrG - «двойник» ACD-домена RtxA, обладающий такой же биологической активностью; второй остров патогенности VPI-2 с геном нейрамини-дазы; маннозочувствительные пили адгезии (mshA), шигаподобный (sltl) и термостабильный (stn/sto) токсины; система секреции III типа (TTSS, Vcs - V. cholerae secretion), которая родственна кластеру генов TTSS2, найденных у пандемического клона V. parahaemolyticus; система секреции шестого типа (T6SS), в состав которой входят гены vasA, vasK, vasF [Монахова Е.В. с соавт., 2005, 2006.; Boyd, E.F. et al, 2000; Dzeijman M. et al, 2005; Jermin, W.S. et al, 2002; Sears C.L. et al, 1996; Sheahan K.-L. et al, 2004; Wu Z. et al, 2000].
В связи с этим следует подчеркнуть, что важное место занимает детекция в расширенном диапазоне детерминант факторов патогенности нетоксигенных штаммов, что при разработке современных БД ГИС позволяет комплексно оценить изолированные в результате микробиологических мониторинговых исследований на территории России штаммы холерных вибрионов на основе изучения их биологических свойств, в том числе на молекулярном уровне [Ломов Ю.М. с соавт., 2010; Ежова М.И. с соавт., 2011; Васильева О.В. с соавт., 2013; Москвитина Э.А. с соавт., 2013, 2015; Гриднева Л.Г. с соавт., 2014; Балахонов СВ. с соавт., 2015].
Анализ результатов мониторинга холерных вибрионов в пространственном, временном и микробиологическом аспектах с привязкой к конкретным объектам окружающей среды на территории России
По данным выделяемости V. cholerae О1, О139 и R-варианта из ООС по ФО нами было установлено (табл. 8), что за исследуемый период на территории ЦФО было изолировано 55 штаммов холерных вибрионов (4,7% от общего количества изолированных культур на территории Российской Федерации), из них 48 относится к О1 серогруппе, пять – к О139 серогруппе и два – к R-варианту. В разные годы наблюдались единичные случаи выделения данных штаммов из ООС из таких объектов, как: реки (р) Сухая, Дон, Воронеж, Старая Ряса, Воронец, Сасовка; пруд Кириевский, Которосль, пруд в районе Капотни; из стоков – г. Жуковский; г. Рыбное, ниже крахмало-паточного завода, а также из воды Курьяновской станции аэрации. Стоит особо отметить, что из р. Москва в 1995г. были выделены два токсигенных штамма холерных вибрионов О1 Эль Тор серовара Огава. Наибольшее количество нетоксигенных штаммов холерных вибрионов было изолировано в Московской области из р. Москва (18 штаммов), что составило 43,7%.
Р. Ока – крупнейший из правых притоков Волги, протекает на территориях пяти областей: Орловской, Тульской, Калужской, Московской, Рязанской. Из этого водоема наибольшее количество нетоксигенных штам-55 мов V. cholerae O1 El Tor было выделено на территории Рязанской области с разной временной периодичностью: в 1989г. (пять штаммов) и в 1997г. (три штамма) с последующей изоляцией единичных штаммов. С 2015г. изоляты холерных вибрионов О1 серогруппы и R-варианта на данной территории не обнаруживались.
На территории субъектов ЮФО было выделено наибольшее количество как токсигенных, так и нетоксигенных культур холерных вибрионов – 656, что составило 56,6% от общего количества изолированных культур на территории Российской Федерации, а именно 652 – V. cholerae O1 El Tor, четыре –R-варианта (табл. 9).
Из ООС одного субъекта (Республика Калмыкия) было выделено 332 (50,6%) нетоксигенных штамма холерных вибрионов, из них 330 относились к О1 серогруппе Эль Тор, два – к R-варианту. Наибольшее количество выделенных культур V. сholerae О1 El Tor отмечалось из проб воды следующих водоемов: р. Элистинка (112 штаммов – 34,0% от общего количества культур, выделенных на изучаемой территории); пруды Заячий (100 штаммов – 30,0%), Колонский (57 штаммов – 17,0%), Сайгаченок (11 штаммов – 3,0%) (рис. 3). По данным ФКУЗ «Элистинская ПЧС» Роспотребнадзора обнаружение V. cholerae О1 El Tor связано с природно-климатическими условиями: с высокими показателями температуры воздуха и воды в летние месяцы в период с 2009г. по 2013г., что коррелирует с наибольшим количественным их выделением именно в эти годы, с наличием не глубоких пресноводных водоемов, расположенных в черте г. Элисты, [Бембеева Е.С. с соавт, 2013] и, по-видимому, с уровнем подготовки специалистов, то есть с качеством проводимых исследований. Однако, по данным паспортов на штаммы, пришедшие на идентификацию имело место дублирование отборов проб из одной и той же точки двумя учреждениями (ФБУЗ «ЦГ и Э» и «ФКУЗ Элистинская ПЧС»).На территории Краснодарского края нетоксигенные штаммы холерных вибрионов О1 Эль Тор были выделены из Черного и Азовского морей, а также из р.: Ея, Бзугу, Мацеста и Агура, из которой в 2015г. на протяжении трех месяцев было выделено 98 штаммов, идентифицированных в референс-центре как относящиеся к одному клону. В 2016г. на территории вышеуказанного субъекта штаммов V. сholerae O1 El Tor обнаружено не было.
К водоемам риска, по-видимому, можно отнести р. Волга, которая протекает по территории 15 субъектов Российской Федерации, впадая в Каспийское море (от истока к устью): Тверской, Московской, Ярославской, Костромской, Ивановской, Нижегородской областей, Республик Марий Эл, Чувашии, Татарстана, а также Ульяновской, Самарской, Саратовской, Волгоградской, Астраханской областей и Республики Калмыкия.
В Астраханской области из проб воды р. Волги было выделено десять нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор. Помимо этого, на территории данного субъекта нетоксигенные культуры V. cholerae O1 El Tor были изолированы из 14 водоемов: из р. Кизань, Ашулук, Кумылочовка, Прямая Болда, Каньга, Енотаевка, Бузан, Старая Волга, Ахтуба, Царев, Кутум; из озера у птицефабрики; канала с. Яндыки; воды в районе ремонтной базы.
На территории Волгоградской области из р. Волга за изучаемый период было выделено шесть нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор. Кроме того, на территории данного субъекта было установлено выделение нетоксигенных изолятов V. cholerae O1 El Tor из шести водоемов: р. Ахтуба, Петровка, Сухона, Човка; прудов Зеленый и № 2,
Определенный интерес представляет Ростовская область, которая относится к территории I типа по эпидпроявлениям холеры и занимает условно второе место по выделяемости штаммов вибрионов О1 Эль Тор из ООС на территории Российской Федерации. Так, из водных ООС за исследуемый период было выделено 152 штамма V. cholerae различной серологической принадлежности и токсигенности (табл. 9), в том числе семь ток-сигенных, а также четыре нетоксигенных штамма холерных вибрионов R-варианта.
На территории С-ЗФО за изучаемый период было изолировано 53 штамма холерных вибрионов, что составило 4,6% от общего количества изолированных культур на территории РФ , из них 51 культура V. cholerae O1 El Tor и две – R-варианта (табл. 10). Следует отметить, что в 2005г. из р. Нева был выделен один токсигенный штамм холерного вибриона О1 Эль Тор Ога-ва.
Р. Нева протекает по территории Ленинградской области и г. Санкт-Петербурга, соединяя Ладожское озеро с Невской губой Финского залива Балтийского моря. Наибольшее количество штаммов V. cholerae O1 El Tor и R-варианта было изолировано на территории Ленинградской области и составило 41,5% (22 штамма), которое было обнаружено в р.Нева и воде Финского залива Балтийского моря. В то же время, на данной территории были выявлены случаи обнаружения нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор из следующих водоемов: р. Стрелка и Великая; пруда Орловский; водоема Ивановского карьера; Обводного канала; пляжа Александрия. Обращают на себя внимание однократные случаи выделения нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор из следующих ООС: р. Човью, Северная Двина, Веряжа, Вишера, Тарасовец; из воды Ивановского карьера, из воды пляжа Александрия, из озер Окулево и Ильмень; а также из пробы воды Выборгского морского порта.
Р. Волхов протекает на двух территориях РФ: Новгородской и Ленинградской областей. Исток реки начинается на территории Новгородской области из озера Ильмень, устье – Ладожское озеро. Что касается территории Новгородской области, то за анализируемый период было изолировано 20 нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор, наибольшее количество из которых (восемь) – из р. Волхов. Из других водоемов данной области были установлены единичные случаи выделения нетоксигенных штаммов V. сholerae О1 El Tor.
На территории ДФО за изучаемый период из ООС было изолировано 156 культур холерных вибрионов, что составило 13,5% от общего количества выделенных штаммов на территории России (табл. 11).
Анализ ПЦР-генотипов репрезентативной выборки неток-сигенных штаммов холерных вибрионов, изолированных из поверхностных водоёмов и стоков на территории Российской Федерации
Прикладной характер разработанного подхода к определению значимости нетоксигенных штаммов V. cholerae демонстрировали следующие результаты. Так, при анализе данных ПЦР-типирования по детекции 14 генов-мишеней штаммов V. cholerae O1 El Tor, выделенных из ООС на административных территориях, было установлено, что наибольшее количество не-токсигенных культур холерных вибрионов О1 вошло в кластер D – 121 штамм (29,7%), состоящий из 11 генотипов (табл. 22). Данный кластер встречался на территории шести субъектов Российской Федерации, а именно: Ростовская область, Краснодарский край, Республика Калмыкия; Иркутская область; Ставропольский край; Челябинская область, входящих в четыре ФО (ЮФО, СФО, С-КФО, УФО) (рис. 13).
В таблице 22 показано, что кластер Е включал в себя 99 (24,3%) неток-сигенных изолята холерных вибрионов, образующих 20 генотипов, встречался на территории 15 субъектов Российской Федерации, (входящих в семь ФО – ДФО, СФО, ЮФО, С-ЗФО, ЦФО, ПФО, С-КФО). На рисунке 13 проиллюстрировано, что самым распространенным оказался кластер В (73 штамма – 17,9%), генотипы (15) которого были выявлены на территории 28 субъектов, во всех ФО России. Стоит отметить, что на территориях Ростовской области и Республики Калмыкия (ЮФО) были выделены штаммы с уникальными генотипами – C1 (2015г.) и J1 (2013г.), соответственно, ранее не встречающиеся ни на одной из административных территорий России. Остальные кластеры состояли из различного количества генотипов. Так, кластер А включал восемь генотипов (47 штаммов – 11,5%), G – десять генотипов (26 штаммов – 6,4%), H – пять генотипов (17 штаммов – 4,2%), F – два генотипа (13 штаммов – 3,2%), I – восемь генотипов (десять штаммов – 2,5%).
При помощи кластерного анализа была построена дендрограмма распределения ПЦР-генотипов нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор ctxAcpA+ и ctxAcpA-, представленная на рисунке 14. Чем ближе друг к другу штаммы расположены на дендрограмме, тем они генетически более сходны.
Что касается холерных вибрионов О1 серогруппы ctxAcpA+, то не исключена возможность их заноса на административные территории России.
Как видно на дендрограмме, нетоксигенные штаммы холерных вибрионов О1 Эль Тор (ctxAcpA+) разделились на две группы. Первую группу составляли штаммы с характеристикой ctxAcpA+, которые вошли в один кластер с изолятами ctxAcpA- (D, B, G, I). Вторая группа культур V. cholerae О1 El Tor была выделена в отдельные кластеры (H и J) и содержала только штаммы ctxAcpA+. Несмотря на то, что изоляты холерных вибрионов ctxAcpA+ делятся на две группы и образуют как общие кластеры с культурами ctxAcpA-, так и отдельные, полученные данные явились осно ванием для проведения дальнейших исследований по генотипированию нетоксигенных штаммов холерных вибрионов с генетической характеристикой ctxAcpA+. Обращают на себя внимание обнаружение нетоксигенных штаммов холерных вибрионов ctxAcpA-, образующих отдельные кластеры (A, C, E, F), которые не имеют общих генотипов с изолятами ctxAcpA+.
На основании вышеизложенного, можно судить об общности происхождения штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор с генетическими характеристиками ctxAcpA+ и ctxAcpA-.
С нашей точки зрения особый интерес представляет динамика распределения ПЦР-генотипов нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 серогруппы с 1989г. по 2016г. (рис. 15).
Было отмечено, что культуры V. cholerae, вошедшие в кластер В встречались наиболее часто. Установлена циркуляция таких изолятов в ООС от одного года до шести лет (с 2001г. по 2006г.). В последнее время обращают на себя внимание штаммы холерных вибрионов, вошедшие в кластер Е, которые встречаются на протяжении последних пяти лет (20122016гг.).
Таким образом, полученные данные являлись свидетельством того, что нетоксигенные штаммы холерных вибрионов могут переживать в пресноводных водоемах от одного года до нескольких лет. Несмотря на установление того факта, что изоляты V. cholerae O1 El Tor ctxAcpA+ делятся на две группы и образуют как общие кластеры с ctxAcpA-, так и отдельные, полученные данные явились основанием для проведения дальнейших исследований по генотипированию нетоксигенных штаммов холерных вибрионов с генетической характеристикой ctxAcpA+.
Анализ данных генотипирования по 14 генам-мишеням факторов патогенности/персистенции V. cholerae О1 El Tor, изолированных из водных экосистем на территории Краснодарского края
На территории Краснодарского края из ООС в период с 1989г. по 2016г. было выделено и проведено определение родовой и видовой принадлежности как музейных, так и вновь выделеных штаммов холерных вибрионов 113 нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 (рис. 21).
Все изоляты V. сholerae О1 были типичны по культурально-морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам, из них к серовару Огава принадлежали 8 штаммов (7,1% – от общего количества), к серовару Инаба – 105 (92,9%).
Штаммы холерных вибрионов О1 серогруппы были изолированы из речной воды: р. Бзугу (1996г.), Ея (2002г.), Мацеста (2001, 2007гг.), Агура (1993, 1999, 2007, 2015гг.), а также морской воды: Черное море, пляж санатория «Фрунзе» (1996г.); Черное море, пляж санатория им. Кирова (1991г.); Черное море, пляж санатория «Сочи» (1990, 1996гг.); Азовское море, Ейский лиман (2001г.); Азовское море, лиман на Суджукской косе (2013г.), в 2016г. штаммов выделено не было (табл. 26).
По результатам ПЦР-генотипирования по 14 структурным генам-мишеням культуры V. сholerae О1 El Tor, выделенные из ООС на территории Краснодарского края принадлежали к различным генотипам (A4, B14, D4, D7, D10, D11, E1, G10), различающимся между собой по наличию/отсутствию от двух до шести генов. Наибольшее количество штаммов относилось к генотипу D4 (98 штаммов). Установлено, что штаммы с генотипом D4 не содержали генов RS1, RS2 – элементов, а также генов острова па-тогенности VPI, T3SS, T6SS, термостабильного токсина stn/sto, vce, но имели не полный набор генов острова патогенности VPI-2 (int, nanH), а также ген маннозочувствительных пилей адгезии – mshA.
При анализе пространственной и временной динамики выделения штаммов холерных вибрионов с определенным генотипом на территории Краснодарского края установлено, что изоляты принадлежащие к генотипу D7 выделялись из воды Черного моря в 1990, 1991 и 1996 гг., из воды Азовского моря – к генотипу B14 (2001, 2013гг.), обнаруженные в р. Мацеста – генотип A4 (2001 и 2007гг.). Культуры V. cholerae O1 El Tor, изолированные из р. Агура относились к генотипу G10 (1993, 1999 и 2007гг.), что свидетельствовало об их персистентном потенциале. Однако, в 2015г. выявился новый генотип D4, ранее не встречающийся на данной территории и составил 89 штаммов. Отличие между генотипами составил факт утраты генов шестой транспортной системы (T6SS) изолятов, выделенных из р. Агура в 2015г., принадлежащих к генотипу D4 по сравнению со штаммами, выделенными ранее из этого же водоема (с 1993г. по 2007г.), что позволило судить о заносе.
Сравнительный анализ данных ПЦР-генотипирования по 14-ти генам показал аналогичный результат. Представляет интерес тот факт, что штамм № 19787 был одним из 89 (выборочно взятых) идентичных (по результатам ПЦР-генотипирования) штаммов, выделенных в Сочи в течение 2015г. (рис. 22).
Таким образом, исходя из вышеуказанного, можно судить о возможности переживания штаммов холерных вибрионов О1 серогруппы на протяжении нескольких лет в водоемах южных широт. Полученные данные расширяют представление о персистентном потенциале нетоксигенных штаммов V. сholerae в поверхностных водоемах на изучаемой территории. Следующий этап работы состоял в анализе соотношения между обнаружением в ООС нетоксигенных штаммов V. cholerae с различающимися генетическими характеристиками.