Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Азоспириллы – ризобактерии, стимулирующие рост высших растений 11
1.1.1 Экологическиe и физиологические особенности представителей рода Azospirillum 12
1.1.2 Стресс у азоспирилл и других бактерий 17
1.1.3 Биопленки у A. brasilense 28
1.2 Покой как особое физиологическое состояние у бактерий 32
1.2.1 Формирование и поддержание покоя 32
1.2.2 Индукция выхода бактерий из состояния покоя 37
1.3 Агглютинин зародышей пшеницы (АЗП): строение, свойства и функции в биологических системах. 40
1.3.1 Строение, свойства и локализация АЗП в растениях пшеницы 41
1.3.2 АЗП как БАВ в растениях и других эукариотических организмах 43
1.3.3 Влияние АЗП на A. brasilense 45
1.4 Ростстимулирующие ризобактерии – основа биопрепаратов для современного растениеводства 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 57
2.1 Бактерии и условия их культивирования 57
2.2 Оценка числа жизнеспособных клеток 59
2.3 Оптические параметры роста азоспирилл 59
2.4 Получение культур A.brasilense разной глубины покоя 59
2.5 Световая и электронная микроскопия 62
2.6 Рентгенодифракционный анализ биопленок и клеток A. brasilense Sp245 64
2.7 Приготовление образцов для ИК-фурье-спектроскопии 65
2.8 ИК-фурье-спектроскопия в режиме диффузного отражения.. 65
2.9 Получение экстрактов АЗП для реакции гемагглютинации (РГА) и иммуноферментного анализа (ИФА) 66
2.10 Оценка содержания АЗП в зерновках пшеницы методом РГА 67
2.11 Двойная радиальная иммунодиффузия 68
2.12 Определение содержания АЗП в семенах пшеницы методом непрямого конкурентного ИФА 69
2.13 Оценка качества зерна методом SDS-седиментации 70
2.14 Микробные обработки семян и растений пшеницы 71
2.15 Проведение полевых экспериментов 72
2.16 Статистическая обработка результатов 74
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 75
3.1 Принципы получения покоящихся культур A. brasilense двух типов 75
3.2 Получение покоящихся форм A. brasilense в естественном цикле старения 76
3.2.1 Культура длительного хранения, заложенная в оптималь ных условиях: получение и частичная характеристика 77
3.2.2 Особенности старения A. brasilense в неоптимальных условиях 81
3.3 Реакция A. brasilense на стрессовые факторы и индукция покоя под действием стресса 82
3.3.1 Влияние кобальта и меди на рост A. brasilense 82
3.3.2 Влияние различных форм меди на рост A. brasilense 83
3.3.3 Гексилрезорцин – адаптоген и ингибитор размножения азоспирилл 86
3.3.4 Реакция A. brasilense на жесткий трофический стресс 88
3.3.5 A. brasilense Sp245 в условиях комплексного стресса 90
3.4 Особенности персистенции азоспирилл 95
3.4.1 Биопленки в жидких культурах A. brasilense 95
3.4.1.1 Рентгенографический анализ флокулосодержащей биопленки 105
3.4.1.2 Исследование флокулосодержащей биопленки методом ИК-фурье-спектроскопии
3.4.2 Кристаллообразование в покоящихся культурах азоспи-риллы 114
3.4.3 Фенотипическая диссоциация у A. brasilense Sp245 и SR75
3.5 Стимуляция перехода A. brasilense от покоя к размножению под действием АЗП 123
3.6 Скрининг сортов пшеницы по признаку «содержание АЗП». 133
3.7 Агробиотехнологический потенциал A. brasilense в зоне рискованного земледелия
3.7.1 Увеличение урожайности и продуктивной кустистости у яровой мягкой пшеницы под влиянием бактерий A. brasilense 139
3.7.2 Влияние предпосевной обработки семян пшеницы азоспириллами на качество зерна нового урожая 145
Заключение 153
Выводы 161
Список сокращений и пояснений 163
Список использованной литературы
- Покой как особое физиологическое состояние у бактерий
- Получение культур A.brasilense разной глубины покоя
- Определение содержания АЗП в семенах пшеницы методом непрямого конкурентного ИФА
- Реакция A. brasilense на стрессовые факторы и индукция покоя под действием стресса
Введение к работе
Актуальность темы. Ризобактерии Azospirillum brasilense колонизируют корни сельскохозяйственных растений, образуя с ними ассоциативные симбиозы. Эти грамотрицательные бактерии улучшают рост и развитие растения-хозяина (Bashan et al., 2004; Игнатов, 2005; Fibach-Paldi et al., 2012; Pii et al., 2015; Cassn et al., 2015), в связи с чем их относят к функциональной группе PGPR (plant-growth promoting rhizobacteria, ростстимулирующие ризо-бактерии). На основе PGPR создают бактериальные препараты, использование которых позволяет снижать уровень внесения в почву агрохимикатов и получать экологически чистую продукцию растениеводства. Некоторые препараты на основе азоспирилл уже успешно используются. Несмотря на довольно большой объем фундаментальных знаний об A. brasilense и других ризобактериях, разработанных препаратов на их основе не так много, и они не нашли пока широкого применения. Одной из причин этого является недостаточная изученность биотехнологических аспектов данной проблемы.
Азоспириллы имеют две фазы жизненного цикла: фазу активной жизнедеятельности, сопряженную с вегетацией растения-хозяина, и фазу покоя. Есть сведения, что покой бактерии A. brasilense переживают на семени (Волкогон и др., 1995). Учитывая то, что колонизация корней микробами происходит в первые дни после прорастания зерновки и в условиях жесткой конкуренции, очевидно, что преимущество имеют те бактерии, которые быстро выходят из состояния покоя.
Ранее было высказано предположение (Антонюк, 2005), что в случае симбиоза пшеница – A. brasilense фактором, ускоряющим выход этих бактерий из покоя, может быть лектин (агглютинин зародышей пшеницы, АЗП) – один из компонентов корневых экссудатов. Известно, что этот лектин проявляет себя как биологически активное вещество по отношению к вегетативным клеткам A. brasilense, стимулируя симбиотически значимые процессы: азотфиксацию, продукцию фитогормона ИУК, размножение бактерий и др. (Антонюк и Игнатов,
2001; Садовникова и др., 2003; Shelud’ko et al., 2009).
К началу нашей работы были уже описаны белки с «двойной» биологической активностью, которые не только стимулируют деление вегетативных клеток, но индуцируют выход бактерий из дормантного (покоящегося) состояния. Примерами таких белков являются Rpf-фактор и фактор некроза опухоли (Mukamolova et al., 1998; Бухарин и др., 2005).
Учитывая все вышесказанное, важно было проверить предположение о способности АЗП индуцировать выход из покоя A. brasilense, в частности, штаммов-симбионтов пшеницы. Прогресс в понимании закономерностей смены физиологического состояния (переходы покой – размножение) у A. brasilense осложняется недостаточной изученностью культур разной глубины покоя. В частности, для бактерий рода Azospirillum не предложены протоколы получения жизнеспособных, но некультивируемых клеток (ЖНК) – самой глубокой формы покоя у неспорообразующих бактерий.
Вопрос о длительной персистенции (переживании неблагоприятных условий) представляет в случае A. brasilense не только фундаментальный, но и практический интерес, что связано с необходимостью сохранения жизнеспособности бактерий при длительном хранении готовых биопрепаратов.
Целью данной работы являлся анализ биотехнологического потенциала штаммов A. brasilense – природных ассоциантов пшеницы, с учетом их взаимодействия с лектином растения-хозяина – АЗП.
Для реализации поставленной цели в ходе исследований решали следующие задачи:
-
Получить дормантные культуры A. brasilense двух типов – при их естественном старении, а также в результате индукции состояния покоя стрессом.
-
Охарактеризовать культуру A. brasilense Sp245 длительного хранения с использованием микробиологических и физико-химических методов.
-
Разработать протокол получения ЖНК A. brasilense и получить некультивируемые формы азоспирилл.
-
Проверить способность АЗП индуцировать выход из дормантного состояния ЖНК-содержащих и других покоящихся культур A. brasilense.
-
Провести скрининг перспективных сортов мягкой и твердой пшеницы по признаку «содержание АЗП».
-
Изучить влияние инокуляции ризобактериями A. brasilense на урожайность, продуктивную кустистость и качество зерна растений пшеницы в почвенно-климатических условиях Нижнего Поволжья. Научная новизна. Подобран комплекс стрессовых факторов для полной и
обратимой блокировки размножения A. brasilense Sp245. Впервые для представителей рода Azospirillum предложен протокол получения ЖНК и получены некультивируемые клетки. Впервые изучена чувствительность азоспирилл к двум различным хелатным соединениям меди. С использованием ЖНК впервые показано, что АЗП может служить фактором, индуцирующим выход азоспирилл из состояния покоя. Установлено, что данный лектин способен вызывать резкий скачок размножения бактерий в выходящей из покоя культуре A. brasilense, многократно увеличивая число жизнеспособных клеток (в максимуме на 2.5109 кл./мл относительно контроля). Впервые для азоспирилл описан новый тип биопленки, а также продемонстрировано образование в дормантных культурах двух ее типов – флокулосодержащей и простой. Впервые для бактериальных биопленок получены данные, свидетельствующие о присутствии в ней макромолекул с высокоупорядоченной структурой. Показано, что A. brasilense в жидких культурах сохраняет жизнеспособность на протяжении, по крайней мере, 7 лет. Получены данные о высокой внутривидовой вариабельности признака «содержание АЗП» у мягких и твердых пшениц. Продемонстрирован новый рост-стимулирующий эффект симбионта пшеницы A. brasilense Sp245 – способность увеличивать продуктивную кустистость растения-хозяина.
Научно-практическая значимость. На примере штамма A. brasilense Sp245 получены доказательства перспективности использования азоспирилл в качестве основы биопрепаратов для регионов рискованного земледелия. Получены сведения о сохранении азоспириллами жизнеспособности не менее
семи лет, что позволяет рекомендовать создание препаратов на основе A. brasilense с пролонгированным сроком хранения. Обнаружение способности АЗП индуцировать резкий скачок размножения у азоспирилл показало перспективность создания комплексных препаратов на основе азоспирилл и лектина пшеницы. Полученные результаты об устойчивости A. brasilense к различным соединениям меди могут быть использованы при разработке биопрепаратов, в состав которых входят бактерии и микроэлементы. С использованием 9 сортов мягкой яровой пшеницы показано, что инокуляция азоспириллами, в целом, не снижает качества зерна нового урожая. Установлено, что в случае отсутствия прибавки по урожайности, инокуляция может улучшать качество зерна, что важно для товарного класса качества и, соответственно, стоимости продукции.
Методология и методы исследования. Методологической основой исследования явился анализ отечественной и зарубежной литературы по покоящимся формам бактерий, по использованию ростстимулирующих ризо-бактерий, по вопросу о роли лектина пшеницы в растительно-бактериальном симбиозе. В работе применялся комплексный анализ собственных и литературных данных. В ходе подготовки и выполнения исследования использовались различные методы: методологический анализ научных трудов, исследование в виде эксперимента, наблюдения, измерения, сравнительного анализа результатов и их описания. С помощью упомянутых подходов была обеспечена достоверность и объективность полученных результатов и выводов.
Положения, выносимые на защиту.
-
Лектин пшеницы индуцирует выход A. brasilense из состояния покоя.
-
Неспорообразующая ризобактерия A. brasilense сохраняет жизнеспособность в жидких культурах не менее 7 лет, что позволяет создавать биопрепараты на основе азоспирилл с длительным сроком хранения.
-
В жидких покоящихся культурах азоспириллы формируют флокуло-содержащую биопленку.
4. Под действием глубокого стресса бактерии A. brasilense переходят в состояние покоя и образуют жизнеспособные, но некультивируемые клетки.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения» (Саратов, 2009, 2010, 2011, 2014), 15-й и 16-й Международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2011, 2012), 4-й Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум» (2012), 20-й Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы» (Саратов, 2014), 2-й и 3-й Всероссийской школе-конференции молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), 6-й Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2012), 1-й и 2-й Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Казань, 2012; Саратов, 2014), Всероссийском симпозиуме с международным участием, посвященном 85-летию со дня рождения В.А. Кумакова «Физиолого-биохимические основы продукционного процесса у культивируемых растений» (Саратов, 2010), Региональной научно-практической конференции «Роль молодежи в инновационном развитии АПК Саратовской области» (Саратов, 2011), 5-й Региональной научной конференции «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2013), Выставке научно-технического творчества молодых ученых и специалистов Саратовской области (Саратов, 2012). Доклад «Биотехнологический потенциал ростстимулирующих бактерий Azospirillum brasilense в условиях Нижнего Поволжья: влияние инокуляции на продуктивность, урожайность и качество зерна пшеницы» на I Международном конкурсе научных работ среди студентов, бакалавров и магистрантов специальности/направления подготовки «Биотехнология», аспирантов и молодых ученых (Саратов, 2014) удостоен диплома I степени.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении полученных результатов и их интерпретации, формулировании выводов, подготовке публикаций. Отдельные эксперименты или их этапы проводились совместно с коллегами из ИБФРМ РАН или других научных учреждений.
Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в лаборатории биохимии в соответствии с плановой тематикой НИР.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка цитированной литературы и приложений. Список литературы включает в себя 354 источника, из них 140 на русском и 214 на английском языках. Работа изложена на 223 страницах машинописного текста и содержит 34 рисунка и 17 таблиц, не включая приложения.
Покой как особое физиологическое состояние у бактерий
Вегетативные клетки бактерий рода Аzospirillum обычно имеют форму слегка изогнутых или прямых палочек со «сглаженными» концами диаметром 0.8–1.0 мкм и длиной 2–5 мкм (Bashan et al., 2004; Xie & Yokota, 2005). В зависимости от условий существования клетки азоспирилл могут приобретать иную форму и быть округлыми, вибриоидными и палочковидными. Оценка размеров клеток по данным электронной микроскопии выявляет вариабельность этих бактерий также по размеру, который колеблется от 0.6–2.0 мкм в ширину и 0.9–30 мкм в длину (Лавриненко, 2011).
Бактерии рода Azospirillum имеют большой размер генома – от 4800 т.п.н. у A. irakense до 9700 т.п.н. у A. lipoferum (Martin-Didonet et al., 2000), что определяет их высокую адаптационную способность. В связи с этим азоспириллы занимают различные экологические ниши и могут обитать практически во всех климатических зонах. Температурные пределы развития бактерий рода Azospirillum варьируют от 5 до 42оС с оптимумом 30–32оС. Азоспириллы относятся к нейтрофилам, однако значения рН, при которых возможен их рост, шире нейтральных и колеблются в довольно широком диапазоне – от 4.0 до 8.8 (Baldani et al., 2005).
Азоспириллы подвижны в жидких и полужидких средах (Шелудько и Кацы, 2001; Шелудько, 2010). В жидкой среде они перемещаются с помощью одного полярного жгутика. На полужидких питательных средах, благодаря образованию латеральных жгутиков, клетки приобретают «роящийся» тип подвижности. При наличии полярного пучка пилей возможен еще один тип миграции – «тянущая» подвижность. Полужидкие среды хорошо моделируют муцигель, в связи с чем они используются для изучения типов подвижности, наиболее важных для успешной колонизации ризосферы растения-хозяина.
В природных условиях азоспириллы колонизируют корневую систему многих видов высших растений, в том числе злаков, кормовых трав и других небобовых растений (Bashan & Holguin, 1997). В отличие от ризобий, Azospirillum не образуют клубеньков и других морфологических структур на корнях растения-хозяина. Установлено, что различные штаммы A. brasilense отличаются друг от друга типом колонизации корневой системы растения-хозяина. В настоящее время принято выделять эпифитные и эндофитные штаммы, локализующиеся, соответственно, либо на поверхности, либо внутри корня.
В конце XX века удалось детально изучить локализацию нескольких штаммов A. brasilense, в том числе Sp245 и Sp7. При помощи электронной и конфокальной лазерной микроскопии удалось выяснить, что штамм Sp245 относится к эндофитам, т.к. обнаруживается в межклетниках корня, а также внутри корневых волосков (Schloter et al., 1994; Assmus et al., 1995; Schloter & Hartmann, 1998). Оба этих подхода выявляли штамм Sp7 лишь на поверхности корней. Выяснена локализация и некоторых других штаммов A. brasilense. Показано, что эпифитами являются также A. brasilense Cd и Wa3 (Assmus et al., 1995; Schloter & Hartmann, 1998; Dbereiner & Pedrosa, 1987). В настоящее время природная локализация многих штаммов азоспирилл остается не изученной. Некоторые штаммы относят к эндофитам по методу их выделения – из стерилизованных корней: A. brasilense Sp242, Sp107 и Sp108 (Baldani et al., 1983) и A. irakense KBC1 (Faure et al., 1999).
Следует отметить, что азоспириллы являются факультативными эндофитами, что предполагает возможность их существования и без растения-хозяина. Полагают, что их способность проникать внутрь корня приводит к более тесному взаимодействию бактерий с растением-хозяином и, соответственно, бльшему вкладу в его развитие (Baldani et al., 1983; Dbereiner & Pedrosa, 1987). В свзи с этим считается, что эндофитные штамммы являются более перспективными в практическом отношении.
Представители рода Azospirillum могут использовать широкий спектр органических соединений в качестве источников углерода: органические кислоты, спирты, сахароспирты, аминокислоты. В микроаэробных условиях азоспириллы могут фиксировать молекулярный азот, а в аэробных условиях они используют различные источники связанного азота (Bashan & Holguin, 1997). Первоначально ростстимулирующее действие азоспирилл объясняли их способностью к азотфиксации (Berg et al., 1980; Dbereiner & Pedrosa, 1987; Streeter, 1995). Имеются литературные данные, подтверждающие, что фиксированный азоспириллами азот обнаруживается затем в растении-хозяине (Ruppel & Merbach, 1997; Becker et al., 2002). Есть сведения о том, что инокуляция растений в полевых экспериментах позволяет снизить дозы азотных удобрений (Dbereiner & Pedrosa, 1987; Daz-Zorita & Fernndez-Canigia, 2009).
Наряду с другими ризосферными бактериями азоспириллы способны к продукции фитогормонов, в частности индолил-3-уксусной кислоты – ИУК (Fibach-Paldi et al., 2012). Этот ауксин влияет на морфологию корневой системы растения, стимулируя ее рост, что способствует бльшему поглощению воды и минеральных соединений (Dobbelaere et al., 1999; El-Khawas & Adachi, 1999). Показано, что положительное влияние азоспирилл на растение проявляется при оптимальном уровне инокуляции 105–106 кл./мл. При этом возрастает общая масса корневой системы, увеличивается длина и количество боковых корней и корневых волосков. При повышении уровня инокуляции до 108–109 кл./мл происходит угнетение роста корней (Kapulnik et al., 1985; Steenhoudt & Vanderleyden, 2000; Bashan et al., 2004).
Кроме общепризнанных ведущих факторов – синтеза ИУК и вклада в азотное питание растений за счет фиксации молекулярного азота – существует и ряд других аспектов позитивного воздействия микропартнера ассоциативного симбиоза на жизнедеятельность макропартнера (Bashan & de-Bashan, 2010). Показано, что при инокуляции растения потребление питательных элементов может изменяться из-за их трансформации в ризосфере. Инокуляция азоспириллами активизирует транспорт протонов из клеток корней, что приводит к подкислению ризосферы; это в свою очередь повышает доступность питательных элементов, например фосфора.
Важную роль в повышении доступности питательных элементов способны играть бактериальные сидерофоры. Это низкомолекулярные вещества, которые хелатируют железо и другие металлы с образованием устойчивых комплексов. Сидерофоры наиболее изучены у Pseudomonas, хотя встречаются у других PGPR, в том числе и у Azospirillum (Белимов, 2012). Продукция сидерофоров ризобактериями связана с удовлетворением их потребностей в железе, а также ингибированием конкурентной микрофлоры за счет образования недоступных для нее Fe-сидерофорных комплексов. Важно, что такие комплексы могут усваиваться растениями, хотя и в меньшей степени, чем Fe-содержащие соединения некоторых синтетических хелаторов железа и фитосидерофоров (Bar-Ness et al, 1991).
Получение культур A.brasilense разной глубины покоя
Исследования были проведены с тремя штаммами A. brasilense – Sp245, SR75 и SR80, полученными из Коллекции ризосферных микроорганизмов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН, г. Саратов). A. brasilense Sp245 является факультативным эндофитом пшеницы, выделенным в Бразилии из поверхностно стерилизованных корней выращенного в поле растения (Baldani et al., 1983). Штаммы SR75 и SR80 являются представителями другого географического региона – Нижнего Поволжья (Саратовская область). Они были выделены из проростков, полученных при стерильном проращивании семян пшеницы сортов Саратовская 29 и Саратовская 49, соответственно (Позднякова и соавт, 1988).
В большинстве экспериментов азоспириллы культивировали в
синтетической малатной среде (СМС). При необходимости создания условий азотфиксации, а также для удлинения лаг-фазы состав среды модифицировали. Для создания условий трофического стресса, бактерии переносили в фосфатно-солевой буфер (ФСБ) или физиологический раствор. Бактерии выращивали при температуре 31оС в жидкой или на твердой СМС следующего состава (г/л): K2HPO43H2O – 3.0; KH2PO4 – 2.0; NaCl – 0.1; NaMoO42H2O – 0.002; NaOH – 2.24; яблочная кислота – 3.76; NH4Cl – 0.5; дрожжевой экстракт – 0.1; MgSO47H2O – 0.2; СaCl22H2O – 0.02; FeSO47H2O – 0.02 (вносили в виде хелата); pH среды 6.8. Среду автоклавировали при 1 атм. в течение 30 мин. Соли MgSO4 и СaCl2 были приготовлены в виде стоковых, 500-кратных стерильных растворов, которые добавлялись в среду после её автоклавирования.
Раствор хелатного железа содержал (г/л): FeSO47H2O – 2.0; нитрил-3-уксусная кислота – 5.6. Компоненты растворяли в 25 мл дистиллированной воды, добавляли по каплям 1 н NaOH до полного растворения компонентов и появления характерной темно-янтарной окраски. После этого смесь доводили водой до 1 л, автоклавировали при 0.5 атм. 30 мин. Готовый раствор хранили в холодильнике в темной стеклянной посуде.
В некоторых экспериментах использовали модифицированную среду для выращивания азоспирилл, основываясь на данных И.О. Итальянской и соавт. (1995). Глюкозо-триптофанная среда (ГТС) имела следующий состав (г/л): K2HPO43H2O – 0.1; KH2PO4 – 0.4; NaCl – 0.1; NaMoO42H2O – 0.002; триптофан – 0.14; глюкоза – 2.5, MgSO47H2O – 0.2; СaCl22H2O – 0.02; FeSO47H2O – 0.02; pH среды 6.8. Глюкозу готовили отдельно и автоклавировали при 0.5 атм. 30 мин после чего добавляли в стерильную среду. Режим стерилизации среды, способ внесения FeSO4, MgSO4 и CaCl2 были такими же, как в случае среды СМС.
Физиологический раствор содержал 8.5 г/л NaCl. ФСБ имел следующий состав (г/л): NaCl – 8.5; Na2HPO4 – 1.34; NaH2PO4 – 0.39; pH 7.4. Оба раствора автоклавировали при 1 атм. 30 мин. Затем в них стерильно вносили соли (г/л): MgSO47H2O – 0.2; СaCl22H2O – 0.02.
В экспериментах по влиянию стрессовых факторов на рост A. brasilense, тестируемые вещества (CuSO4, CoCl2, Cu-ЭДТА, Cu(Asp)2Na2SO4 и 4-н-гексилрезорцин) вносили из стерильных стоковых растворов в жидкую среду СМС после ee автоклавирования. 4-н-гексилрезорцин («Sigma», США) готовили в виде 1 М раствора, используя в качестве растворителя этиловый спирт.
В качестве инокулята во всех экспериментах использовали культуру ранней стационарной фазы роста, которую вносили в жидкую среду в таком количестве, чтобы расчетная стартовая плотность суспензии была равна 108 кл./мл (за исключением случаев, оговоренных отдельно). Плотность бактерий в инокуляте определяли по стандарту мутности. В экспериментах с АЗП лектин вносили в среду одновременно с инокулятом. В случае появления на агаризованной среде колоний азоспириллы минорных фенотипов для исключения возможной контаминации использовали известный подход проведения бактерий с нетипичными колониями через серию пассажей в оптимальных условиях роста. Для этого каждую отдельную колонию, отличающуюся по внешнему виду от доминантного морфотипа, пересевали в жидкую оптимальную среду. Полная реверсия минорного фенотипа к доминантному являлась доказательством отсутствия контаминации.
Анализ числа жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ) проводили по общепринятой методике: после окончания культивирования стерильно готовили последовательные десятикратные разведения суспензии бактерий в физиологическом растворе, которые высевали на чашки с плотной агаризованной (2%) средой СМС. Подсчет числа образовавшихся колоний, если не оговорено особо, проводили после двухсуточной инкубации при 31C. В случаях, когда необходимо было выявить субпопуляцию медленно растущих клеток A. brasilense, наличие колоний оценивали несколько раз: на 2-е сутки и позже (до двух недель роста).
Состояние покоя у азоспирилл изучали с использованием двух подходов: в естественном цикле старения (культуры ЕС-1 и ЕС-2; см. Таблицу 3 в разделе 3.1) и с индукцией перехода к покою под действием комбинации стрессовых факторов (культуры КС-1, КС-2, КС-3, КС-4; см. Таблицу 3 в разделе 3.1). Для создания условий комплексного стресса и получения культур разной глубины покоя, предварительно анализировали отдельные факторы, способствующие ингибированию роста бактерий или резкому снижению их жизнеспособности.
Культура ЕС-1. Бактерии А. brasilense Sp245 пересевали в темные 1-литровые бутыли с жидкой средой СМС, из которой был исключен источник связанного азота NH4Cl. Бутыли укупоривали двумя пластиковыми крышками и хранили течение месяца при 31оС, далее – при комнатной температуре. За состоянием культуры наблюдали более 8 лет.
Определение содержания АЗП в семенах пшеницы методом непрямого конкурентного ИФА
Химическая природа обнаруженных нами кристаллов остается неизвестной. Можно с уверенностью говорить о том, что по химическому составу они отличны от струвита, обнаруженного ранее в вегетативной культуре A. brasilense Sp245 при росте в жидкой среде СМС (Kamnev et al., 1999). Cтрувит имеет формулу MgNH4PO4 H2O; в культуре азоспириллы он содержал ряд ионов (Na+, K+, Ca2+, Mn2+, Fe2+/3+, Cl–, HPO42–, H2PO4–, SO42–) в виде аморфных примесей.
В наших экспериментах одна из культур – КС-1, персистировала в физиологическом растворе с несколькими добавками (см. раздел 2.1.5); в числе ионов среда содержала только Mg2+, Сu2+, Na+, Са2+, Cl–, SO42–. Таким образом, отсутствовала часть компонентов, необходимых для образования струвита. Кроме того, для его образования, как известно, важна щелочная реакция среды. В случае культуры КС-1 исходное значение рН было равным 6.0, а через 2.5 месяца (на момент обнаружения кристаллов) оно сдвигалось в кислую сторону, достигая 3.6. Что касается культуры ЕС-1, то к моменту обнаружения в ней кристаллов (через 5.5 лет) рН был равен 9.6. Тем не менее, наблюдаемые в этой культуре кристаллы ничем не отличались от таковых в культуре КС-1, что дает нам основания полагать, что это не струвит, а другой минерал. Важно отметить, что с течением времени в культуре ЕС-1 кристаллы увеличивались в размере и становились различимы невооруженным глазом (в возрасте 8 лет и 3 мес.).
Вопрос о возможном физиологическом значении кристаллообразования в вегетативных и персистирующих культурах азоспирилл можно обсуждать пока лишь на уровне предположений. Возможно, кристаллы важны для удаления определенных ионов из зоны активного обмена между микробными клетками и средой. Нельзя также исключить и варианта запасания неорганических веществ для последующего их использования при наступлении благоприятных условий. Интересно отметить, что в литературе имеются данные о биотехнологическом аспекте использования минералов. Американские ученые предложили извлекать фосфор из струвита для дальнейшего применения этого элемента в качестве удобрения (Ning et al., 2014).
Таким образом, в жидких покоящихся культурах А. brasilense Sp245 независимо от их возраста и стрессовой нагрузки, образуются кристаллы, отличные от минерала струвита, описанного ранее для этого же штамма. Из литературных данных известно, что кристаллообразование у азоспирилл происходит не только в жидкой, но и в твердой питательной среде, в толще агара (Погорелова и соавт., 2009).
Фенотипическая диссоциация у A. brasilense Sp245 и SR75 Как уже упоминалось, стресс индуцирует у бактерий явление фенотипической диссоциации, которая отражает их внутрипопуляционную изменчивость и выявляется при высеве бактерий на твердые среды. В случае появления в бактериальной популяции клеток нескольких типов (диссоциантов), на плотных средах помимо доминантного, появляются колонии иных, минорных фенотипов. Несколько последовательных пассажей таких колоний через оптимальные среды приводят к восстановлению доминантного фенотипа.
Фенотипическая диссоциация уже описана у A. brasilense Sp7 и Sp245 (Матвеев и соавт., 1992; Погорелова и соавт., 2009); для штамма SR75, насколько нам известно, таких данных нет. С целью расширения представлений о внутрипопуляционной изменчивости у A. brasilense, при работе с покоящимися и стрессированными культурами мы анализировали появление колоний различного типа у A. brasilense Sp245 и SR75.
Для A. brasilense Sp245, как уже упоминалось, описано 3 диссоцианта: один доминантный – S (единственный фенотип, встречающийся в оптимальных условиях) и два минорных – Sm и M. В наших экспериментах при культивировании бактерий этого штамма в условиях глубокого стресса был выявлен более широкий спектр морфотипов. Каждый из минорных диссоциантов после пассажей через оптимальные среды восставливал обычный для A. brasilense вид колоний. Помимо уже известных вариантов S, Sm и M, нами были обнаружены колонии трех минорных диссоциантов – Pg, R и Sg. Эти же фенотипические варианты выявлялись и у A. brasilense SR75 при высоких стрессовых нагрузках.
Таким образом, для A. brasilense Sp245 и SR75 нами описано шесть морфотипов (Таблица 7): S – доминантный тип; Sm – тип, образующий мелкие колонии; Pg – тип, образующий сильно пигментированные колонии среднего размера, M – мукоидный тип; R – тип, образующий шероховатые колонии; Sg – тип, вызывающий сегментообразный рост.
В большинстве случаев колонии различных фенотипических вариантов появлялись на чашках через двое суток. В некоторых случаях их формирование происходило лишь к 7–12 суткам. Этот факт позволяет предположить наличие в культурах A. brasilense клеток с очень низкой скоростью деления, характерной для клеток-персистеров.
Реакция A. brasilense на стрессовые факторы и индукция покоя под действием стресса
Особенностью длительно хранящихся культур A. brasilense являлось наличие донного осадка, при исследовании которого нами была обнаружена флокулосодержащая биопленка (впервые для бактерий рода Azospirillum). Изучение этой биопленки методом малоугловой рентгеновской дифракции выявляло присутствие в ней макромолекул высокой структурной упорядоченности. Полученная дифракционная картина была аналогична таковой для протеогликанов млекопитающих (Вазина, 2013), упорядоченность которых обусловлена регулярным прикреплением цепей гликозаминогликанов к белковому кору с характерным периодом 4.65 нм. Несмотря на внешнее сходство рентгенограмм, периодичность, характерная для изучаемого нами образца, была несколько иной. В силу того, что изучение биохимического состава биопленки А. brasilense только началось (Евстигнеева и соавт., 2014), химическая природа упорядоченных макромолекул флокулосодержащей биопленки остается пока неизвестной.
Важно отметить, что биопленки формировались не только в культурах естественного цикла старения, но также и при выходе бактерий из состояния покоя при их пересеве в свежую среду. В этом случае биопленки образовывались независимо от типа пересеваемых в новую среду культур (культуры серий КС и ЕС).
Как уже упоминалось, контактирующие с жидкостью биопленки образуют с ней единую динамичную систему (Николаев и Плакунов, 2007) и выделяют в водную среду жизнеспособные клетки – как отдельные, так и в кластерах. Возможно, что в случае культуры азоспириллы, хранящейся в течение 7 лет, легкое возобновление роста при пересеве в свежую среду связано с выделением биопленкой A. brasilense не только клеток, но и экстраклеточного материала, содержащего собственные факторы роста. Это предположение хорошо согласуется с данными по влиянию АЗП на возобновление роста дормантных культур естественного старения, в случае которых действие лектина было не таким выраженным как у ЖНК-содержащих культур. Можно предположить, что одним из факторов роста, освобождающимся биопленкой, является собственный лектин азоспириллы.
При работе с покоящимися и стрессированными культурами A. brasilense наблюдали фенотипическую диссоциацию – явление, уже описанное для A. brasilense Sp7 и Sp245 (Матвеев и соавт., 1992; Погорелова и соавт., 2009). В ходе исследований у штамма Sp245 выявлен более широкий спектр диссоциантов, чем было известно, что связано с глубоким стрессом, которому подвергались бактерии в ходе экспериментов. Кроме того, нами впервые получены данные о фенотипической диссоциации у A. brasilense SR75. Наиболее выраженная диссоциация наблюдалась в культурах при одновременном действии гексилрезорцина и CuSO4.
Ранее для A. brasilense Sp245 было известно лишь три морфотипа (Погорелова и соавт., 2009), тогда как нам удалось выявить шесть. Такой же набор фенотипических диссоциантов наблюдался и в случае A. brasilensе SR75, что хорошо согласуется с литературными данными о свойствах клеточной поверхности упомянутых штаммов. В частности известно, что ЛПС A. brasilense Sp245 и SR75 имеет одинаковую структуру О-специфического полисахарида (Федоненко и соавт., 2005), который вносит решающий вклад в морфологию колоний.
Еще одной особенностью покоящихся и стрессированных культур А. brasilense, независимо от их возраста и стрессовой нагрузки, было образование кристаллов, отличных от минерала струвита, описанного ранее для вегетативных культур азоспириллы (Kamnev et al., 1999). Химическая природа и физиологическое значение обнаруженных нами кристаллов остаются пока неизвестными.
С использованием эндофитного симбионта пшеницы A. brasilense Sp245 были проведены полевые эксперименты, которые подтвердили агробиотехнологический потенциал данного штамма, продемонстрированный ранее в районе его природного обитания (Dobereiner & Pedrosa, 1987). Максимальные прибавки по зерну в условиях Нижнего Поволжья были даже более высокими, чем полученные прежде (90 и 79%, соответственно). Интересно отметить, что в наших исследованиях эффект инокуляции суспензией A. brasilense Sp245 не уступал действию коммерческого препарата Экстрасол, основой которого являются спорообразующие бациллы. Обращает на себя внимание тот факт, что высокие прибавки урожая были получены в острозасушливом сезоне. Это позволяет думать, что A. brasilense Sp245 смягчает стресс растения-хозяина, предположительно за счет снижения синтеза стрессового гормона этилена (наличие фермента АЦК-дезаминазы для A. brasilense Sp245 уже описано; Белимов, 2012).
Хорошо известно, что стимулирующее влияние азоспирилл на урожайность растения-хозяина реализуется за счет многих составляющих, в числе которых можно назвать такие эффекты как продукция бактериями фитогормона ИУК, стимуляция азотфиксации, улучшение минерального питания. В экспериментах по инокуляции пшеницы A. brasilense Sp245 нами был продемонстрирован новый ростстимулирующий эффект – способность азоспирилл увеличивать продуктивную кустистость растения-хозяина.
Нами также установлено, что предпосевная обработка семян пшеницы азоспириллами в целом не снижает качества зерна нового урожая. Выявлена и другая важная закономерность: в случае отсутствии прибавки урожая наблюдалось улучшение качества зерна. Подобный положительный эффект инокуляции можно назвать «скрытым», т.к. исследователи, изучающие влияние микробных обработок на агрономически значимые растения, обычно не анализируют качественные показатели урожая. Тем не менее, подобный эффект важен при определении товарного класса зерна и, соответственно, стоимости продукции.
В целом, экспериментальные данные, полученные в ходе нашего исследования, подтверждают высокий агробиотехнологий потенциал симбиотических штаммов A. brasilense и говорят о перспективности использования азоспирилл в качестве основы биопрепаратов для растениеводства.