Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 14
1.1. Термофильные и гипертермофильные микроорганизмы. Общие положения 14
1.2. Местообитания термофильных и гипертермофильных микроорганизмов
1.2.1. Наземные биотопы. 18
1.2.2. Морские биотопы 1.3. Фенотипические особенности и разнообразие термофильных и гипертермофильных микроорганизмов. Представители домена Archaea 22
1.4. Влияние элементной серы и молекулярного водорода на рост органотрофных термофильных архей 28
1.5. Гидролиз и окисление трудноразлагаемых субстратов термофильными и гипертермофильными микроорганизмами
1.5.1. Гидролиз кератинов 30
1.5.2. Гидролиз хитина 33
1.5.3. Гидролиз липидов 38
1.5.4. Гидролиз ксилана 42
1.5.5. Гидролиз целлюлозы 45
1.5.6. Окисление углеводородов 47
1.6. Значение термостабильных и гипертермостабильных ферментов для биотехнологии 53
Экспериментальная часть
2. Материалы и методы 58
2.1.Объекты и методы исследования 58
2.1.1. Отбор проб 58
2.1.2. Получение накопительных культур 58
2.1.3. Получение чистых культур 60
2.1.4. Использованные в работе коллекционные штаммы
2.2. Культивирование 60
2.2.1. Приготовление сред для культивирования термофильных и гипертермофильных архей 60
2.2.2. Подготовка используемых в работе субстратов и акцепторов электронов 64
2.2.3. Подготовка перьев и птичьего пуха для культивирования 65
2.2.4. Приготовление эмульсий масел. 65
2.2.5. Приготовление стоковых растворов антибиотиков. 65
2.2.6. Очистка нефти от тяжелых фракций 66
2.3. Микроскопия 66
2.3.1. Световая микроскопия. 66
2.3.2. Трансмиссионная электронная микроскопия.
2.4. Оценка роста 67
2.5. Молекулярные методы
2.5.1. Выделение ДНК 68
2.5.2. Метод ПЦР 69
2.5.3. Электрофорез в агарозном геле 70
2.5.4. Секвенирование нуклеотидных последовательностей 70
2.5.5. Определение филогенетического положения полученных изолятов 71
2.6. Аналитические методы 71
2.6.1. Определение концентрации сероводорода. 71
2.6.2. Определение концентрации водорода 72
2.6.3. Определение Fe (II) с 2,2 дипиридилом 72
2.6.4. Определение относительного количества углеводородов 73
2.6.5. Определение липазной активности 74
2.6.6. Определение пептидазной активности 75
3. Результаты 77
3.1. Получение накопительных культур органотрофных термофильных и гипертермофильных архей, обитающих в наземных горячих источниках и использующих новые полимерные субстраты 77
3.2. Выделение чистых культур и их идентификация 82
3.3. Гипертермофильные археи рода Desulfurococcus 85
3.3.1 Систематика гипертермофильных архей рода Desulfurococcus 85
3.3.2. Способность гипертермофильных архей рода Desulfurococcus к использованию альфа- и бета-кератинов. 89
3.3.3. Влияние молекулярного водорода и элементной серы на рост органотрофных термофильных и гипертермофильных архей рода Desulfurococcus
3.4. Термофильные археи рода Fervidicoccus 96
3.5. Гипертермофильные археи рода Thermogladius 99
3.6. Термофильные археи рода Caldisphaera 102
4. Обсуждение результатов 112
Заключение 123
Выводы 125
Список литературы 126
- Местообитания термофильных и гипертермофильных микроорганизмов
- Использованные в работе коллекционные штаммы
- Определение филогенетического положения полученных изолятов
- Влияние молекулярного водорода и элементной серы на рост органотрофных термофильных и гипертермофильных архей рода Desulfurococcus
Введение к работе
Актуальность проблемы
Археи – прокариотные микроорганизмы, представленные на универсальном древе жизни глубокой обособленной ветвью наряду с Bacteria и Eukarya (Woese & Fox, 1977). Уникальность домена была всецело подтверждена геномными и биохимическими данными (Garrett & Klenk, 2007). Археи способны существовать при наиболее экстремальных условиях обитания, таких как высокие температуры, экстремальные значения pH, высокие концентрации солей, повышенное давление (Reed et al., 2013), что позволяет рассматривать их как модельные организмы – аналоги обитателей Земли в самые ранние этапы ее формирования.
В современных исследованиях биогеохимических процессов и экологии Земли археи занимают центральное место. За этими микроорганизмами признана важная роль в глобальных биогеохимических циклах, что связывают с метаболическим разнообразием и широким распространением архей в биосфере (Offre et al., 2013). Однако, до сих пор нет полного представления о вкладе отдельных групп архей в биогеохимические процессы, протекающие на Земле, что подразумевает в перспективе широкий фронт исследований в этом направлении.
В настоящее время большинство культивируемых архей представлено двумя основными филумами Euryarchaeota и Crenarchaeota. В филум Euryarchaeota входит восемь классов (Methanopyri, Methanococci, Methanobacteria, Methanomicrobia, Archaeoglobi, Halobacteria, Thermococci и Thermoplasmata), которые встречаются в самых разнообразных экотопах, включая все типы экстремальных местообитаний. Филум Crenarchaeota содержит только один класс Thermoprotei, включающий пять порядков (Acidilobales, Desulfurococcales, Fervidicoccales, Sulfolobales и Thermoproteales). Культивируемые представители филума Crenarchaeota встречаются в термальных местообитаниях (Kletzin, 2007).
Способность архей развиваться в экстремальных условиях и, в частности, при экстремально высоких температурах (Canganella & Wiegel, 2014), обуславливает особый интерес к этим микроорганизмам. Она связана с наличием у архей уникальных механизмов адаптации, являющихся предметом пристального внимания исследователей на протяжении уже более сорока лет. В частности, термофильные и гипертермофильные археи способны синтезировать стабильные биокатализаторы, функционирующие в экстремальных условиях, сравнимых с условиями индустриальных процессов. С этим свойством связана и другая причина повышенного интереса к этой группе микроорганизмов – возможность использования сверхстабильных ферментов в различных областях биотехнологии.
Одной из основных проблем промышленных технологий, подразумевающих использование биологических и ферментативных препаратов, является достижение компромисса между жесткими условиями протекания процесса и стабильностью используемого препарата (Bouzas et al., 2006). Для высокотемпературных процессов использование термофильных и гипертермофильных архей и/или их ферментов, могло быть потенциальным решением ряда технологических задач (Canganella & Wiegel, 2014).
В последние годы наиболее актуальными становятся исследования, направленные на изучение гидролитических свойств экстремофильных микроорганизмов, способных разлагать сложные полимерные субстраты. Термостабильные гидролазы и продукты их активности могут найти применение в различных областях промышленности, в том числе целлюлозной, животноводческой, пищевой и др. (Taylor et al., 2012; Bouzas et al., 2006).
Таким образом, основной интерес к термофильным и гипертермофильным
микроорганизмам, в частности археям, обусловлен двумя основными направлениями
исследований, имеющими, соответственно, фундаментальное и прикладное значение:
исследование филогенетического и метаболического разнообразия прокариот и изучение
биотехнологического потенциала термофильных и гипертермофильных
микроорганизмов - продуцентов термостабильных биокатализаторов.
Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось исследование филогенетического и метаболического разнообразия и физиолого-биохимических свойств термофильных и гипертермофильных архей, обитающих в наземных горячих источниках и способных разлагать полимерные органические соединения.
Основные задачи работы заключаются в следующем.
-
Выделение из наземных горячих источников термофильных и гипертермофильных архей, использующих полимерные субстраты, и определение их таксономического положения.
-
Уточнение систематического положения коллекционных штаммов и новых изолятов рода Desulfurococcus.
-
Определение фенотипических характеристик новых изолятов.
-
Определение способности к разложению полимерных субстратов новыми термофильными и гипертермофильными археями.
Научная новизна и практическая значимость работы
Выделено и/или охарактеризовано 12 штаммов гипертермофильных архей, использующих в процессе роста органические субстраты разной степени сложности.
Установлено, что выделенные организмы относятся к филуму Crenarchaeota, родам Desulfurococcus, Caldisphaera, Thermogladius и Fervidicoccus.
Предложена реклассификация архей рода Desulfurococcus, объединяющая существующие пять видов рода в два вида – Desulfurococcus mucosus (штаммом которого является бывший Desulfurococcus mobilis) и Desulfurococcus amylolyticus (штаммами которого являются Desulfurococcus kamchatkensis и Desulfurococcus fermentans). Выявлена значительная фенотипическая неоднородность этих видов.
Установлена способность архей родов Desulfurococcus и Thermogladius к разложению трудноразлагаемых белков – - и -кератинов. Дана первичная характеристика эндопептидаз, способствующих разложению кератинов представителями этих родов.
Подтверждена способность архей рода Thermogladius к росту на целлюлозе.
Выделен и охарактеризован штамм Caldisphaera sp. 1V, предположительно представляющий новый вид. Впервые для Crenarchaeota показана стимуляция роста этого организма алканами и сопряженное с этим процессом восстановление элементной серы.
Исследовано влияние молекулярного водорода на рост органотрофных гипертермофильных архей из наземных горячих источников и выявлены различия в отношении к этому фактору, имеющие штаммовую специфичность, а также зависящие от используемого субстрата.
На основании полученных результатов уточнены диагнозы родов Desulfurococcus, Caldisphaera, Thermogladius, Fervidicoccus.
Таким образом, выявлено значительное фенотипическое разнообразие
органотрофных термофильных и гипертермофильных архей, обитающих в наземных горячих источниках, проявляющееся на штаммовом уровне. Обнаружен значительный потенциал исследуемой группы организмов в отношении разложения полимерных субстратов, в том числе таких труднодоступных, как кератины и целлюлоза.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международной конференции “BioMicroWorld 2011” в Торремалинос (Испания), на Молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии - 2011” в Москве, на конференции “Thermophiles 2013” в Регенсбурге (Германия), а также на VIII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в Москве (2015 г).
Публикации
Материалы диссертации содержатся в 11 печатных работах: 6 экспериментальных статьях и 5 тезисах конференций.
Место проведения работы
Основная работа была выполнена в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ (ИНМИ РАН).
Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК чистых культур выполнялось в Центре «Биоинженерия» РАН к.б.н. Т.В. Колгановой. Электронная микроскопия чистых культур была выполнена к.б.н. Н.А. Кострикиной. Результаты анализа полных геномов гипертермофильных архей предоставлены к.б.н. А.В. Лебединским.
Автор приносит искреннюю благодарность принимавшим участие в данной работе к.б.н. Переваловой А.А., к.б.н. Кубланову И.В., к.б.н. Колгановой Т.В., к.б.н. Кострикиной Н.А., асп. Дербиковой К.С, к.б.н. Ковалевой О.Л., к.б.н. Кочетковой Т.В., к.б.н. Черных Н.А., а также к.б.н. Подосокорской О.А.
Автор выражает искреннюю признательность к.б.н. Борзенкову И.А. за содействие в работе, ценные практические советы и поддержку.
Особую благодарность автор выражает д.б.н. Бонч-Осмоловской Е.А., к.б.н. Лебединскому А.В., д.б.н. Сорокину Д.Ю. за постоянное внимание, интересные идеи, практическую помощь и ценные советы на всех этапах работы.
Финансовая поддержка
Работа была поддержана грантом Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», а также грантом 7 Рамочной Программы Европейского Союза (проект “HotZyme – Systematic screening for novel hydrolases”).
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы,
экспериментальной части, содержащей материалы, методы и результаты исследования и обсуждение, а также заключения, выводов и списка литературы, который включает 328 наименований работ. Материалы диссертации изложены на 176 страницах машинописного текста и включают 28 рисунков и 14 таблиц.
Местообитания термофильных и гипертермофильных микроорганизмов
Наземные биотопы гипертермофилов - это в основном серосодержащие сольфатарные поля, названные в честь Сольфатара Кратер Поццуоли (район Неаполя). Сольфатарные поля состоят из почвы, грязевых выходов, а также грунтовых и поверхностных вод, прогреваемых вулканическими эксгаляциями из магматических бассейнов (Рис. 2). Очень часто сольфатарные поля расположены в непосредственном соседстве с активными вулканами, и активность сольфатар значительно увеличивается во время фаз извержения. Сольфатарные поля встречаются в разных уголках нашей планеты, например: Флегрейские поля (берег залива Поццуоли, Италия), горы вулканической системы Керлинга (Исландия), Йеллоустоунский национальный парк (США), кальдера вулкана Узон (Камчатка, Россия), Ноборибэцу (о. Хоккайдо, Япония), вулкан Танкубан-Праху (о. Ява, Индонезия), долина Роторуа (Новая Зеландия). В зависимости от высоты над уровнем моря, максимальная температура воды достигает 100С (Табл. 1). Сольфатары обычно характеризуются низкой соленостью, исключением являются сольфатарные поля, расположенные на побережье (прибрежные скалы Фараглиони и пляж Маронти с гидротермальным парком на острове Искья, Италия) (Stetter, 2010).
Химический состав воды и газов сольфатарных полей чрезвычайно вариабелен. Фумаролы выделяют пар с температурой 150 – 450С. Часто в нем содержатся H2S, CO2, H2, CO и другие газы, а также восстановленное железо и марганец в различных формах. Сероводород при контакте с кислородом воздуха окисляется, в результате чего осаждается молекулярная сера, которая может образовывать желтые отложения, особенно обильные вокруг фумарол. Эти соединения и элементы могут служить основными источниками питания гипертермофилов, которые развиваются в подобных условиях (Stetter, 2010). Важным газообразным источником энергии для гипертермофилов является молекулярный водород. Часто сольфатарные поля богаты минералами железа, такими как гидроксиды железа, пирит и пр. Другими распространенными химическими компонентами сольфатар являются магнетиты и минералы мышьяка, такие как аурипигмент и реальгар (Stetter et al.,1993).
Не является редкостью на сольфатарных полях наличие горячих источников, обогащенных силикатами и характеризующихся реакцией среды от нейтральной до слабощелочной. Содержание серы в таких источниках обычно очень низкое.
Активные вулканы могут питать горячие кратерные озера, которые прогреваются фумаролами (например, вулкан Аскья в Исландии и вулкан Карымский на Камчатке, Россия). Обычно такие озера изобилуют серой, имеют очень кислую реакцию среды, и представляют собой яркий пример биотопа гипертермофилов (Stetter et al.,1993).
Очень часто сольфатарные поля и горячие источники располагаются по соседству или даже непосредственно на территории болот, лугов и лесов. В таких гидротермах, помимо неорганических питательных веществ, изначально присутствующих в источнике, появляются листья, ветки, насекомые, останки мелких животных, которые представляют собой сложный органический материал, как альтернативный источник энергии для микроорганизмов, населяющих подобные биотопы.
В России зона наиболее активной субдукции в настоящее время приходится на территорию полуострова Камчатка и Курильских островов. Современная Курило-Камчатская дуга субдукции простирается на 1900 км с юга на север от вулкана Головнина на о. Кунашир до вулкана Шивелуч на Камчатке. В основе формирования данной зоны лежит ортогональное столкновение Тихоокеанской и Североамериканской плит (Bailey, 1996). Принято считать, что в пределах Курило-Камчатской дуги есть 72 активных вулкана и сотни вулканических сооружений (Volynets, 1994). Курилы представляют собой цепь вулканических островов с четкой фронтальной кромкой и большим количеством подводных вулканических построек (Ishikawa & Tera, 1997). Распределение вулканов на Камчатке имеет более сложную схему (Bryant et al., 2007).
Фронтальный вулканический пояс Камчатки перекрывает нефтегазоносный осадочный бассейн на западе полуострова, что является причиной формирования экзотических гидротерм, богатых углеводородами (горячие источники Голыгина и геотермальные районы Кошелевского) (Taran, 2009). Большинство горячих источников обогощены N2-содержащими газами. Однако, есть несколько провинций, расположенных недалеко от действующих вулканов (источники Корякский, Карымский, Налачевский геотермальный район, Дзендзурские горячие источники и др.) с CO2-богатыми водами (Taran, 2009). Также на Камчатке широко распространены гидротермы богатые метаном, среди которых особое место занимают термальные воды Кеткино-Пиначево у подножия вулканов Корякский и Авачинский (Сережников и Спиченкова,1978).
Более 40 активных вулканов на Курильских островах имеют высокотемпературные фумарольные поля и почти каждый остров имеет гидротермы на суше и на подводных склонах их вулканов. Основными видами термальных проявлений являются кратерные фумаролы и горячие или теплые источники на склонах вулканических островов, несущие как кислые, так и нейтральные воды. Минеральные составы гидротерм Курильских островов подробно описаны в работах Тарана и соавторов (Taran et al., 1993), Челнокова (Chelnokov, 2004), и др. Данные по химическому составу газов курильских вулканов опубликованы в работах Меняйлова (Menyailov et al., 1985а, Menyailov et al., 1985б), Тарана и соавторов (Taran et al., 1995а, б; Taran et al., 1996) и др.
Использованные в работе коллекционные штаммы
Методика детекции липазной активности на агарозной среде. В базовую анаэробную среду вносили 3% агара под током 100%-го N2, затем добавляли предварительно нагретую стерильную 20%-ную эмульсию оливкового масла до конечной концентрации 0.4% (v/v). После среду под током того же газа разливали в плоские завинчивающиеся флаконы до достижения слоя среды 3 мм. Производили глубинный засев. Наличие липазной активности в данном случае проявляется в виде зон просветления. Определение активности липазы в реакции гидролиза пара-нитрофенил бутирата
В качестве субстрата использовали 200 мM раствор пара-нитрофенил бутирата (p-nitrophenyl-butyrate, p-NPB) в 100%-ном ацетонитриле. Исходя из условий стабильности субстрата при повышенных температурах, в качестве буфера был выбран 50 мМ HEPES, pH 7.5. При pH выше 9 субстрат нестабилен. Состав реакционной смеси (без добавления фермента) включал 100 мM указанного буфера, 5 мМ CaCI2, 1.25 мM p-NPB. Выявление липазной активности проводили при 80С в течение 1, 5 и 10 мин. Реакцию останавливали добавлением 0.5 V этанола. Измерения проводили на спектрофотометре (Beckman, модель 35) при длине волны 405 нм, против воды в качестве контроля. Субстрат в данном случае готовили следующим образом: p-NPB растворяли при комнатной температуре в 100% ацетонитриле. Конечная концентрация субстрата составляла 100 мМ.
Состав реакционной смеси (1 мл): 930 мкл 50 мМ HEPES, pH 7.5; 62.5 мкл 80 мМ CaCI2; 6.25 мкл 100 мМ раствора p-NPB; 1-20 мкл раствора с ферментом.
Реакция проводится при той же температуре в течение 1 10 мин. После этого добавляется 0.5 мл этанола (для остановки реакции, образец дополнительно помещали в лед для полной остановки реакции). 7 мл пятидневных культур штаммов 2425 и 2412Fs, выросших на -кератине, центрифугировали 10 мин при 12100 g. Супернатант культур исследуемых микроорганизмов сохраняли, осадок промывали 1.5 мл буфера 0.05 М MOPS рН 7.3 и ресуспендировали в 100 мкл того же буфера.
Клетки разрушали методом замораживания/оттаивания, поочередно помещая пробирку с осадком в жидкий азот и на водяную баню (49 – 50С). Разрушенные клетки центрифугировали 10 мин при 12100 g, осадок (фракция клеточных стенок со связанными с ней внеклеточными белками, включая эндопептидазы) дважды промывали 500 мкл 0.05 М MOPS рН 7.3, затем ресуспендировали в 500 мкл того же буфера. Далее, для отделения заякоренных ферментов от клеточных стенок, к полученной смеси добавляли 1% Triton100, инкубировали 1 ч при 25С и добавляли 1 объем 0.05 М MOPS рН 7.3. Получившуюся смесь центрифугировали 10 мин при 12100 g и отбирали супернатант, содержащий смытые с клеточных стенок ферменты.
Таким образом, для зимографии (см. ниже) были получены следующие образцы: 1) супернатант, содержащий ферменты, смытые со стенок разрушенных клеток штамма 2425; 2) внутриклеточная жидкость штамма 2425; 3) супернатант культуральной жидкости штамма 2425; 4) супернатант, содержащий ферменты, смытые со стенок разрушенных клеток штамма 2412Fs; 5 внутриклеточная жидкость штамма 2412Fs; 6) супернатант культуральной жидкости штамма 2412Fs.)
Для оценки активности, количества и молекулярной массы эндопептидаз применяли метод зимографии (Tsiroulnikov et al., 2004). В качестве субстрата использовали желатин («Sigma», США), который добавляли при приготовлении гелей. К 20 мкл образца добавляли 7 мкл 4-кратного лизирующего буфера (200 Мм Tris-HCl, pH 6.8; 4% ДСН, 0.01% бромфенола синего, 40% глицерола). Полученную смесь наносили на 4% концентрирующий полиакриламидный гель (акриламид 4%; 0.122 М Tris-HCl рН 6.8; 3 М мочевина; ДСН 0.075%; желатин 0.1%). Концентрация разделяющего геля составляла 7.5% (акриламид 7.5%; 0.4 М Tris-HCl рН 8.8; 3 М мочевина; ДСН 0.1%; желатин 0.1%). Электрофорез проводили в трис-глицин-ДСН буфере при силе тока 20 40 мА до выхода лидирующего красителя бромфенолового синего из разделяющего геля.
После электрофореза гели многократно отмывали от ДСН дистиллированной водой. Для зимографии гели инкубировали в течение 60 мин при 85С в буфере 0.05 М МOPS рН 7.3. Гели окрашивали раствором Кумасси (Coomassie Brilliant Blue G250, SERVA, Германия) следующего состава: 30% этанол, 5% уксусная кислота и 0.2% Кумасси. Отмывали краску с помощью раствора того же состава, но без Кумасси. 3. Результаты
Получение накопительных культур органотрофных термофильных и гипертермофильных архей, обитающих в наземных горячих источниках и использующих новые полимерные субстраты. Пробы из горячих источников Камчатки и Кунашира с температурой от 50 до 97С и рН от 3.0 до 6.8 были использованы для засева анаэробных сред со сложными органическими субстратами (- и -кератины, казеин, ксантановая камедь, пчелиный воск, эмульсия оливкового и рапсового масел, хитин, пектин, ксилан, березовые опилки). Всего было произведено 86 пассажей, культивирование которых проводили при температурах 50 – 92С и значениях pH 3.0 – 6.5. Условия культивирования были максимально приближенны к естественым условиям в источнике. (Табл. 7). После 3 – 7 дней инкубации в ряде культур был отмечен рост микроорганизмов – до 108 клеток в мл. Кроме того, в культурах, растущих в присутствии элементной серы, было отмечено образование до 4 – 5 мкмоль/мл сероводорода. Накопительные культуры, полученные при наиболее высоких температурах, характеризовались более скудным разнообразием морфотипов (кокки, палочки, редко – нитевидные формы).
Определение филогенетического положения полученных изолятов
Полученные нами новые изоляты были представлены культурами, устойчиво растущими на средах с биополимерными субстратами. Не во всех случаях удалось убедительно продемонстрировать трансформацию внесенного субстрата. При этом слабая, но стабильная разница в росте культур по сравнению с контролем косвенно указывает на их использование микроорганизмами в качестве энергетических субстратов.
Нам удалось выделить в чистые культуры штаммы термофильных и гипертермофильных архей, способных к разложению полимеров различной природы. Так впервые показана способность представителей рода Desulfurococcus к разложению труднодоступного -кератина. Кератинолитические свойства впервые были показаны для представителей рода Thermogladius. Впервые показана стимуляция роста представителей рода Caldisphaera высокомолекулярными алканами.
На данном этапе исследования трудно оценить вклад этих микроорганизмов в утилизацию упомянутых соединений в природных условиях. Комплексный подход с применением молекулярных и микробиологических методов к исследованию филогенетических особенностей и физиолого-биохимических свойств представителей рода Desulfurococcus позволил пересмотреть таксономическое положение видов данного рода. В результате проведенных исследований предложено объединить филогенетически и физиологически наиболее близкие виды между собой, вследствие чего род Desulfurococcus представлен двумя видами: D. mucosus и D. amylolyticus.
Полученные нами характеристики ферментов соответствуют характеристикам ферментов других гипертермофильных кератинолитиков, поскольку кератиназы и пептидазы с возможной кератинолитической активностью из термофильных микроорганизмов в большинстве случаев – высокомолекулярные белки с оптимумом активности при 80 100С и pH 8 10 (Табл. 13).
Единственным представителем филума Euryarchaeota, для которого была показана гидролитическая активность в отношении кератинов, является штамм Thermococcus VC13, способный при 80С гидролизовать -кератин. В результате роста на среде с кератином данный микроорганизм синтезирует несколько внеклеточных эндопептидаз с молекулярной массой от 45 до 100 кДа (Tsiroulnikov et al., 2004). Эндопептидазы, обнаруженные в супернатанте культуральной жидкости штамма Thermococcus VC13, были способны гидролизовать как -, так и -кератины, что свидетельствует о том, что одна или несколько из этих внеклеточных эндопептидаз являются кератиназами, при этом гидролиз -кератина идет на порядок эффективнее по сравнению с -кератином. Однако не сообщалось о полном разложении бета-кератина этим штаммом в процессе роста.
В статье Кубланова и соавторов (2009) приведены данные о накопительных (1523a-ker, 1510b-ker1 и 1510b-ker2) и чистых культурах (1507-2), полученных на кератинах при температурах от 70 до 77С и рН 6.4 7.0, в которых были обнаружены протеиназы, предположительно, участвующие в гидролизе кератинов. В упомянутых кератинразлагающих культурах было зафиксировано присутствие архей, близкородственных к родам Thermofilum и Fervidicoccus. Способность представителя рода Fervidicoccus к использованию кератина была продемонстрирована в настоящем исследовании.
Таким образом, нами было установлено, что гипертермофильным археям различного филогенетического происхождения, обитающим в наземных горячих источниках, свойственна способность к росту на трудно гидролизуемых белках - кератинах. Возможно, в природном термофильном сообществе субстратами кератиназ являются не только кератины, но и другие белки аутохтонного и аллохтонного происхождения.
Характеристика эндопептидаз гипертермофильных микроорганизмов, растущих на кератинах Продуцент, Ссылка Локализация фермента Молекулярная масса, кДа T C и pH Используемый субстрат Ссылки Fervidobactenum Pennivorans Связанная с клеткой 130 50/80/100 6/10/10.5 -кератин Friedrich & Antranikian, 1996 Fervidobactenum islandwum Мембрано-Связанная 97,110, 200 60/100/1107/9/10 -кератин Nam et al.,2002 Thermoanaerobacter keratinophilus Внеклеточное пространство 135 40/85/110 6/8/12 -кератин -кератин Riessen & Antranikian, 2001 Thermococcus VC13 Внеклеточное пространство 45-100 80, 7.2 -кератин -кератин Tsirulnikov et al., 2004
Исследование кератинолитических свойств новых и коллекционных штаммов архей выявило их избирательность в отношении - и -кератинов. Подобное свойство отмечалось и у ранее описанных микроорганизмов, обладающих кератинолитической активностью. Так, для Doratomyces microsporus и Paecilomyces marquandii показано, что микроорганизмы образуют ферменты, гидролизующие -кератины кожи и ее производные, но не способные гидролизовать -кератины перьев (Gradisar et al., 2005). Пептидаза штамма Bacillus pseudofirmus FA30-01 гидролизует -кератин, но не способна гидролизовать -кератин (Kojima et al., 2006).
Избирательный гидролиз кератинов может быть обусловлен особенностями структурной организации - и -кератина. Структура белка – кератина представляет собой полипептидные цепи, тесно связанные парами -спиралей; кроме того, молекула -кератина богата остатками цистеина, который ответственен за образование дисульфидных связей. Дисульфидные связи, как известно, дополнительно стабилизируют структуру белков и предотвращают доступ протеаз к пептидным связям, поэтому для гидролиза -кератина в некоторых случаях, помимо кератиназ, необходимы дисульфид редуктазы, например, белок:дисульфид редуктаза (EC 1.8.1.8), и др. белки, участвующие в разложении дисульфидных связей (Brandelli et al., 2010). В свою очередь, структура -кератина характеризуется высоким содержанием -слоев, делающим его более ригидным, но с меньшим количеством дисульфидных связей. Способность гидролизовать - и/или -кератин объясняется также особенностями ферментативного аппарата каждого отдельного микроорганизма. Возможно, D. amylolyticus Z-533T и D. mucosus DSM 2161T не способны синтезировать дисульфид редуктазы или иные ферменты, необходимые для восстановления дисульфидных связей, чем объясняется неспособность этих микроорганизмов расти на -кератине. Напротив, использующий в качестве субстрата роста -кератин штамм D. amylolyticus 2425, по-видимому, способен синтезировать необходимый для этого набор ферментов.
Влияние молекулярного водорода и элементной серы на рост органотрофных термофильных и гипертермофильных архей рода Desulfurococcus
Исследование кератинолитических свойств новых и коллекционных штаммов архей выявило их избирательность в отношении - и -кератинов. Подобное свойство отмечалось и у ранее описанных микроорганизмов, обладающих кератинолитической активностью. Так, для Doratomyces microsporus и Paecilomyces marquandii показано, что микроорганизмы образуют ферменты, гидролизующие -кератины кожи и ее производные, но не способные гидролизовать -кератины перьев (Gradisar et al., 2005). Пептидаза штамма Bacillus pseudofirmus FA30-01 гидролизует -кератин, но не способна гидролизовать -кератин (Kojima et al., 2006).
Избирательный гидролиз кератинов может быть обусловлен особенностями структурной организации - и -кератина. Структура белка – кератина представляет собой полипептидные цепи, тесно связанные парами -спиралей; кроме того, молекула -кератина богата остатками цистеина, который ответственен за образование дисульфидных связей. Дисульфидные связи, как известно, дополнительно стабилизируют структуру белков и предотвращают доступ протеаз к пептидным связям, поэтому для гидролиза -кератина в некоторых случаях, помимо кератиназ, необходимы дисульфид редуктазы, например, белок:дисульфид редуктаза (EC 1.8.1.8), и др. белки, участвующие в разложении дисульфидных связей (Brandelli et al., 2010). В свою очередь, структура -кератина характеризуется высоким содержанием -слоев, делающим его более ригидным, но с меньшим количеством дисульфидных связей. Способность гидролизовать - и/или -кератин объясняется также особенностями ферментативного аппарата каждого отдельного микроорганизма. Возможно, D. amylolyticus Z-533T и D. mucosus DSM 2161T не способны синтезировать дисульфид редуктазы или иные ферменты, необходимые для восстановления дисульфидных связей, чем объясняется неспособность этих микроорганизмов расти на -кератине. Напротив, использующий в качестве субстрата роста -кератин штамм D. amylolyticus 2425, по-видимому, способен синтезировать необходимый для этого набор ферментов.
Уровень сходства протеомов пары D. amylolyticus Z-533T D. amylolyticus 1221n довольно высок и составляет 98.9%, чем и объясняется наибольшее фенотипическое сходство этих штаммов. Степень идентичности протеомов штаммов D. amylolyticus Z-533T и D. amylolyticus Z-1312 составлял 96%. Штамм D. amylolyticus Z-1312 содержал до 14% белков, не имевших ортологов в протеомах близкородственных D. amylolyticus Z-533T и D. amylolyticus 1221n. Возможно, эти 14% белков способствуют расширению метаболических свойств D. amylolyticus Z-1312 и делают его уникальным среди ближайших родственников.
Как известно, для кератиназ характерна широкая субстратная специфичность, т.е. эндопептидаза, гидролизующая кератин, способна гидролизовать как нерастворимые белковые субстраты (кератины), так и растворимые (азо-казеин, казеин и др.) (Gupta et al., 2013). Исходя из этого, мы предполагаем, что фермент, выявленный нами на зимограмме с желатином, может участвовать и в разложении кератинов, в присутствии которых был выращен микроорганизм.
Более подробное исследование метаболических процессов некоторых микроорганизмов, фигурировавших в работе, с привлечением молекулярных и микробиологических методов, позволило обрисовать в деталях реакции энергетического метаболизма и выявить сходства и различия с ранее описанными механизмами трансформации энергии в клетке.
Результаты ростовых опытов в совокупности с данными анализа полного генома D. amylolyticus 1221n (Ravin et al., 2009) позволили предположить механизм реакций терминального окисления и окислительного фосфорилирования. Так, в геноме штамма D. amylolyticus 1221n найден комплекс генов, кодирующих ферменты, предположительно участвующие в конвертации энергии (Рис. 26) (Ravin et al., 2009). 117 Рисунок 26. Ферментативный комплекс D. amylolyticus 1221n, участвующий в реакциях терминального окисления. ECH1 и ECH2 (energy converting hydrogenases) - [NiFe]-гидрогеназы, NSR (NADH:polysulfide oxidoreductase, NSR) - растворимая НАДН:полисульфид оксидоредуктаза, MBX (membrane bound oxidoreductase) – мембраносвязанная НАДФ+:ферредоксин оксидоредуктаза.
Возможно, большие концентрации молекулярного водорода ингибируют активность ECH 1 и ECH 2, что может явиться причиной ослабления трансмембранного электрохимического потенциала и, как следствие этого, нарушение синтеза АТФ. Кроме того, в клетке может накапливаться НАД(Ф)Н, который образуется в результате активности ферментного комплекса MBX и, в связи с отсутствием акцептора электронов, не окисляется растворимой оксидоредуктазой NSR. Чрезмерное количество восстановленного НАД(Ф)Н, предположительно, инактивирует MBX-комплекс, который перестает генерировать окисленный ферредоксин. Вероятно, подобная инактивация целого ряда ферментов, участвующих в реакциях терминального окисления продуктов метаболизма, и приводит к торможению метаболических процессов в клетке и, как следствие, к ингибированию роста культуры.
Таким образом, чувствительность гипертермофильных архей к высоким концентрациям H2 объясняется ингибирующим действием, оказываемым им на связанную с мембраной ферредоксин-зависимую КЭГ (Bridger et al., 2011) (конвертирующую энергию гидрогеназу), ген которой присутствует в геномах всех архей рода Desulfurococcus.