Введение к работе
Актуальность проблемы. Алкалоиды - это азотсодержащие гетероциклические соединения, биогенетически происходящие из аминокислот и обладающие биологической активностью [Лукнер, 1979]. Особый научный интерес эти метаболиты представляют ввиду разнообразия и уникальности их структуры и путей биосинтеза, а также в связи с исследованием их роли в азотном обмене продуцентов и взаимосвязи первичного и вторичного метаболизма. Интересным и перспективным аспектом исследования процессов алкалоидообразования микроскопическими грибами является возможность использования спектра некоторых метаболитов и в том числе алкалоидов для таксономической характеристики грибов. Этот подхпл успешно используется в пяле "»бср~сріій. [Fiiivad. Hitenrxvj, 19S5; Соловьева и rm , !U02; K.-wai et a!.. 199Л.
Некоторые микробные алкалоиды, а именно, эргоалкалоидьг, нашли применение » медицинской практике, поскольку обладают разнообразным и уникальным спектром биологической активности [Rutschman, Stadler, 1978]. Недавно выдан патен на использование маркфортина и его аналогов - алкалоидов РепкіШит roquefortii - в качестве инсектицидного препарата [патент Великобритании, 1992]. Установлено антибиотическое действие алкалоида рокефортина, .синтезируемого многими пенициллами [Корр, Rehm, 1979; Решетилова и др.,1991].
Ряд алкалоидов по своему биологическому действию относятся к микотоксинам, интерес к которым обусловлен их реальной опасностью для здоровья человека и существенными размерами наносимого ими экономического ущерба [Steyn, 1993]. Проблема микотохсинов находится в центре внимания таких международных организаций как Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООП (ФАО), Программа ООН по окружающей среде (ЮНЕП), Международный союз чистой и прикладной химии (ИЮПАК) и др.
Состояние вопроса. К моменту начала данной работы (1979 г.) были достигнуты значительные успехи в исследовании эргоалкалоидов как у паразитарных, так и сапрофитных форм спорыньи (грибов рода Claviceps) [Hofmann,1964; Floss,1976]. Кроме того, появились сведения о наличии алкалоидов у грибов родов Aspergillus и РепкіШит [Безбородое и др., 1972; Бекмаханова и др., 1975; Agurell, 1964; Barbena el al., 1969]. Однако, методики отбора продуцентов алкалоидов обладали рядом существенных недостатков и были мало информативны [Abe et al.,1967]; работы по изучению физиолого-биохимических особенностей продуцентов в связи с синтезом алкалоидов отсутствовали. Тем не менее, появление данных о способности микроскопических грибов, отличных от Claviceps, синтезировать такой тип соединений, как алкалоиды, специфические метаболиты растений, указывало на перспективность подобного рода исследований.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование алкалоидообразования у грибов рода Penicillium Link. Первоочередными задачами мы считали поиск неизвестных ранее продуцентов как новых, так и уже известных алкалоидов среди пенициллов, выделенных из различных объектов, включая продукты питания; выяснение особенностей и закономерностей биосинтеза и метаболизма алкалоидов; изучение связи процессов алкалоидообразования с физиолого-биохимическими характеристиками культур-продуцентов.
Для достижения этих целей необходимо было решить следующие задачи:
провести скрининг грибов, представителей рода Penicillium с целью выявления их способности к алхалоидообразованию;
исследовать состав и содержание синтезируемых алкалоидов, провести идентификацию и установить структуру новых соединений;
исследовать взаимосвязь образования алкалоидов с физиолого-биохимическими особенностями грибов; установить факторы, влияющие на интенсивность и направление процессов алкалоидообразования;
установить отдельные этапы биосинтеза и метаболизма наиболее характерных для исследованных пенициллов алкалоидов и способы их регуляции. В рамках решения этих задач предусматривалось исследование транспорта и экскреции синтезированных метаболитов;
установить наличие алкалоидов в продуктах питания, контаминированных грибами рода Penicillium; проанализировать возможность экстраполяции результатов исследований в модельных (лабораторных) условиях на естественную среду обитания грибов, в первую очередь, продукты питания.
Научная новизна работы.
Впервые проведено комплексное, многоплановое исследование процессов алкалоидообразования у грибных культур: распространение алкалоидов, связь с физиолого-биохимическими особенностями продуцентов, пути биосинтеза и метаболизма алкалоидов, способы их регуляции.
обнаружена широкая способность микроскопических грибов синтезировать алкалоиды различных структурных типов; охарактеризован алкалоидный состав значительного числа грибов рода Penicillium. Установлена структура 8 не известных ранее алкалоидов. Обнаружен оригинальный тип стереохимии, характерный для эргоалкалоидов, синтезируемых пенициллами.
в результате проведенного исследования взаимосвязи процессов алкалоидообразования и физиолого-биохимических особенностей продуцентов впервые установлен циклический характер биосинтеза и деградации алкалоидов в процессе роста культур, обусловленный возможностью их использования і регуляторних процессах первичного метаболизма.
впервые изучен механизм транспорта алкалоидов в грибные клетки; ісследован транспорт и экскреция алкалоидов в связи с их биосинтезом и эегуляцией этого процесса.
получены новые данные о биосинтетической связи между алкалоидами >азличных структурных типов; установлен путь взаимопревращений некоторых шкетопиперазиновых алкалоидов группы рокефортина.
Практическая значимость. Показана правомочность экстраполяции >езулътатов анализа состава алкалоидов у культур, выращенных в лабораторных словиях (колбах) на условия роста в естественной среде обитания (в частности, іродуктах питания). Впервые установлено "*>"".гг-_ клйашшвых эптяпг.якг.'оъ а "Олікічі*. питание, ягтфптпіровашшх грибя"» ря.та PuudUium. Выявлен ряд 'тготсмю-югичеоких подходов, которые могут быть использованы при разработке іегламентов получения дикетопиперазиновых и клааиновых алкалоидов. Собрана :оллекция штаммов грибов рода Penicillium, перспективных для получения тандартных образцов алкалоидов и др. микотоксинов, используемых в различных іаучньїх лабораториях и учреждениях санитарно-эпидемиологического надзора. Іанньїе проведенного анализа различных штаммов P.roquefortii на способность к лкалоидо- и токсинообразованию использованы при выборе "технологических" ітаммов для производства сыра "рокфор" на Угличском биокомбинате.
Результаты, полученные в данной работе, могут быть рекомендованы для спользования в биотехнологической промышленности, при поиске новых иологически активных веществ и создании новых медицинских препаратов, а акже при решении задач, связанных с биотехнологией защиты окружающей среды; учреждениях Министерства здравоохранения, контролирующих загрязненность родуктов питания и кормов мнкотоксинами; полученные алкалоиды могут быть спользованы в различных биохимических лабораториях в качестве стандартных бразцов. Основные результаты использованы при составлении и чтении курса екций для студентов и магистрантов Пущинского Государственного университета.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ (из них 3 бзора литературы* w отечественных и зарубежных изданиях. Материалы осуждались на Международных симпозиумах фармацевтического общества ГДР Лейпциг, 1981, Гааль, 19S6), Международной конференции "Химия и иотехнология биологически активных природных соединений (Варна, 1981), ісесоюзной конференции "Мицелиальные грибы" (Пущино, 1983), V Всесоюзном иохимическом съезде (Киев, 1986), Всесоюзной конференции "Биосинтез торичных метаболитов" (Пущино, 1988), Международном симпозиуме "Новые неактивные метаболиты из микроорганизмов" (Гера, ГДР, 1988), Международном импозиуме "Сверхпродукция микробных соединений" (Чешске Будовице, [ехословакия, 1988), на заседании биохимического общества (Москва, 1989),
рабочем совещании по проблемам переработки и хранения сельскохозяйственных продуктов (Алма-Ата, 1990), Международном конгрессе "Бактериология и микология" (Осака, Япония, 1990), Европейском конгрессе по биотехнологии (Копенгаген, 1990), Международном симпозиуме "Азот-содержащие микотоксины" (Пущине, 1991), на конференции "Физиология и биохимия мицелнальных грибов в связи с проблемами биотехнологии" (Москва, 1994).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 403 страницах, содержит 66 рисунков и 59 таблиц. Список литературы включает 370 литературных источника. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Некоторые разделы экспериментальной части содержат в качестве введения небольшой обзор литературы, касающийся вопросов, рассматриваемых в данной части работы.
Автор выражает глубокую благодарность коллегам и соавторам работ, которые легли в основу данной диссертации, а также проф. А.М.Безбородову и чл.-корр РАН А.М.Боронину, инициаторам написания данной работы, за ценные советы и постоянное внимание и поддержку.