Актуальные проблемы сибирской язвы: биология и индикация возбудителя, клиника, патоморфология и диагностика заболевания Васильев, Петр Геннадьевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. В настоящее время сибирская язва имеет довольно широкое распространение в большинстве стран мира и не является редкостью на территориях бывшего СССР. По далеко не полным данным, в мире ежегодно регистрируется 20...100 тысяч случаев заболевания человека сибирской язвой /Dirckx J.M., 1981; Velmirovic В., J 984/. Однако, по мнению специального комитета ВОЗ, фактическое число заболеваний людей сибирской язвой в мире в 2...10 раз превышает официальные данные, так как во многих странах регистрация этой инфекции не является обязательной, а отдельные страны, в том числе СССР, не давали официальных сообщений об этом заболевании. Такая высокая заболеваемость людей сибирской язвой объясняется наличием огромного количества почвенных очагов возбудителя, неблагополучной эпизоотической обстановкой и отсутствием во многих странах надежных средств специфической профилактики сибирской язвы.

Несмотря на достаточную изученность проблемы сибирской язвы, до сих пор в мире наблюдаются масштабные эпидемии этой болезни среди люден и эпизоотии среди сельскохозяйственных животных /Turner М., 1980; Davies Г.С.А., 1982, 1983/. При этом сибирская язва продолжает характеризоваться высокой летальностью даже в условиях применения современных лекарственных препаратов, достаточно эффективных при других инфекциях.

Способность возбудителя сибирской язвы длительно сохраняться в почве (более 50 лет), размножаться и укореняться на многие годы привела к образованию стойких очагов почти на всей территории бывшего СССР (от нескольких десятков до сотен очагов в каждой области), что создает постоянную, реальную угрозу возникновения эпизоотии и эпидемий сибирской язвы /Черкасский Б.Л., 1983, 1997; Бургасов П.Н., Рожков Г.И., 1984; Гаврилов В.А., 1987; Ипатенко Н.Г. и др., 1987; Онищенко Ґ.Г. и др., 1999; Маринин Л.И. и др., 1999/.

После распада СССР и связанного с этим развала слаженной противоэпидемической системы нельзя считать стабильной на территориях СНГ эпизоотическую и эпидемическую ситуацию по сибирской язве, так как доказано, что в настоящее время продолжают происходить процессы трансформации активности существующих и формирование новых почвенных очагов сибирской язвы. Об этом свидетельствуют многочисленные вспышки сибирской язвы среди животных и людей, наблюдавшиеся в течение последних лет в ряде областей Российской Федерации, а также в Казахстане, Грузни и на других территориях бывшего СССР /Бакулов И.А. и др., 1998/.

Эпидемическую опасность в стране по сибирской язве в значительной степени определяют расширяющиеся в последние годы торговые контакты с зарубежными странами, так как установлено, что импортная продукция животного происхождения из многих стран Азии, Африки, Южной Америки и

-2-Южной Европы весьма часто загрязнена спорами возбудителя сибирской язвы, причем штаммов, отличающихся по кулътурально - морфологическим и биохимическим признакам от классических штаммов, выделяемых на территории России и бывших республик СССР/Богомолов Ф.И., 1967, 1968; Иппо-литова Л.А., 1968; Ипатеико Н.Г. и др., 1992/. В связи с этим нередки случаи заболевания сибирской язвой среди представителей отдельных профессиональных групп людей.

В комплексе эффективных профилактических мероприятий при сибирской язве значительное место занимают своевременная диагностика заболевания у животных и людей, а также специфическая индикация возбудителя в объектах внешней среды, предусматривающая этапы обнаружения, выделения и идентификации возбудителя. Вместе с тем, несмотря на многочисленные работы, до сих пор не определены критерии идентификации В. anthracis, и отсутствуют надежные средства и методы индикации возбудителя, а также диагностики заболевания сибирской язвой.

Для решения проблем эпизоотологии и эпидемиологии, диагностики, профилактики и лечения сибирской язвы, а также для разработки надежных средств и методов индикации ее возбудителя важное значение имеют знания о биологии сибиреязвенного микроба. К сожалению, в большинстве пз многих сотен работ по сибирской язве объектом изучения служили единичные штаммы сибиреязвенного микроба, а описание их обычно проводилось по ограниченному набору тестов, что создавало ошибочное представление о единообразии штаммов в пределах вида B.anthracis.

Из-за недостаточно представительной выборки штаммов для их описания нередко разные авторы делают противоречивые выводы о наличии или отсутствии того или иного признака у вида B.anthracis. Подобного рода информация об этом биологическом виде вредна для принятия научно - обоснованного решения о направлениях работ по разработке и внедрению в практику средств и методов, необходимых для эффективного осуществления противо-сибиреязвенных мероприятий.

Чрезвычайно высокое эпизоотолого - эпидемиологическое значение имеет знание особенностей клиники и патоморфогенеза сибирской язвы в зависимости от входных ворот возбудителя инфекции, так как постановка правильного прижизненного диагноза этой инфекции у животных и людей затруднена нз-за полиморфизма клинической картины заболевания и отсутствия патогномоничных симптомов, а также гибели большинства больных вскоре после появления первых признаков болезни. Обычно не диагностируемые по клиническим данным единичные и групповые случаи заболеваний получают правильную оценку лишь после латологоанатомического исследования трупа, которое играет основную роль в посмертной диагностике сибирской язвы, особенно ее внутренней (висцеральной) формы. После выяснения этиологии патологоанатом решает вопрос о форме заболевания и путях заражения, которые обычно устанавливаются по локализации патологоанатомических измене -

-3-ний, что считается возможным при наличии демонстративных поражений какого - либо одного из внутренних органов. Сложнее обстоит дело в случаях, если одновременно поражено несколько органов или выявляемые изменения не отражены в клинико-анатомнческой классификации. В таких случаях без знания патогенеза и данных экспериментальных исследований почти невозможно правильное решение вопроса о форме заболевания сибирской язвой и путях заражения ее возбудителем. В связи с этим необходимо создать патогенетическую классификацию сибирской язвы, учитывающую последовательность возникновения основных патологоанатомических изменений, наблюдаемых во внутренних органах и тканях организма, в зависимости от входных ворот возбудителя инфекции.

Целью настоящей работы является теоретическое и экспериментальное изучение актуальных проблем таксономии, индикации и идентификации B.anthracis. клиники, патоморфогенеза и диагностики сибирской язвы для научно обоснованного выбора направлений дальнейших исследований по совершенствованию противосибиреязвенных мероприятий.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решить следующие задачи:

1. Изучить биологические свойства штаммов B.anthracis различного происхождения, оценить их таксономическую значимость для выбора критериев идентификации и внутривидового типирования штаммов данного возбудителя;

2. Разработать и апробировать схему и методы обнаружения и выделения B.anthracis из объектов внешней среды, а также его идентификации от близкородственных видов спорообразующих бацилл;

3. Изучить особенности клиники и патоморфологии сибирской язвы у животных и людей в зависимости от входных ворот возбудителя инфекции;

4. Обосновать перспективные направления теоретических и экспериментальных исследований по проблеме сибирской язвы для разработки жизненно важных иммунобиологических препаратов, необходимых для профилактики, лечения и диагностики заболевания и индикации его возбудителя.

Научная новизна работы заключается в том, что на основании новых данных о биологии возбудителя сибирской язвы разработана концепция о таксономии вида B.anthracis, предусматривающая подразделение его на 4 подвида (BAI, ВАН, ВАШ. BAIV), из них первый подвид (BAI) - на 4 типа (BAIa, ВАІб, ВАІв, ВАІг). С учетом новой классификации сибиреязвенного микроба разработаны схемы специфической индикации и идентификации B.anthracis с применением методов определения такономически значимых признаков, характерных для штаммов всех 4-х подвидов возбудителя сибирской язвы.

Впервые применительно к возбудителю сибирской язвы показана возможность изучения на желточно-полимиксиновой дифференциально-диагностической среде ленитиназной активности по трем типам яично-желточ-

-4-ной реакции - лецитиназной (ЛР), преципитации (РП) и опалесценции (РО) с учетом морфологического типа колоний.

Показано, что для значительного количества штаммов B.anthracis, вне зависимости от принадлежности к тому или иному подвиду, характерно наличие лизогении. Установлено, что при лнзогенизации культур штаммов подвида BAI вновь выделенными бактериофагами возникают варианты сибиреязвенного микроба, по таксономическим признакам соответствующие штаммам подвидов ВАЛ и ВАН!.

По результатам моноантигенного анализа с использованием моиорецеп-торных сывороток к 7 антигенам (Р, SD, ST, TL, VC, С и S) штаммы B.anthracis разделены на 50 антигенных типов.

Впервые установлено, что в качестве критериев идентификации B.anthracis от близкородственных бацилл возможно рассматривать следующие особенности ультраструктурной организации спор: наличие однослойного экзоспориума, микроворсинок длиной 0,03 мкм, 3...5- слойнон споровой оболочки, а также свободного от осмиофильных гранул пространства между эк-зоспориумом и споровой оболочкой.

Установлено, что высоковирулентные и вирулентные штаммы трех типов подвида BAI (типы ВАІа, ВАІб, ВАІв) однородны по токсино- и капсуло-образованию, плазмидному спектру и имеют феноплазмидотип Сар'0₂ Сар^С0₂7ок⁺/рХОҐрХ02*, а слабовирулентные штаммы этого подвида (тип ВАІг), имеющие аналогичный феноплазмидотип, являются гетерогенными по составу микробной популяции (признак Сар⁺ выявлен у 10% и менее бактерий популяции, рХ02⁴ - у 60...85%). Штаммы подвидов ВАИ, ВАШ и BAIV подразделены по феноплазмидотипу соответственно на 3,4 и 2 группы.

На основании сравнительного изучения у человека и разных видов животных особенностей клиники и патоморфолопш сибирской язвы разработана патогенетическая классификация этой сапрозоонозной особо опасной инфекции, учитывающая способ заражения и локализацию возбудителя инфекции, лишенная недостатков клинико-анатомпческой классификации, позволяющая определить место любому патоморфологическому изменению или сочетанно-му поражению нескольких внутренних органов и установить форму заболевания.

Новизна работы подтверждена одним изобретением (№165544 от 8.10.1981г.) и двумя патентами (№ 2115433 от 20.07.1988г., № 2161985 от 20.01.2001г.).

Теоретическая значимость работы заключается в том, что результаты проведенных исследований явились основанием для определения новых направлений НИОКР по проблеме сибирской язвы.

Практическая значимость работы заключается в том, что новые данные о биологии и таксономии B.anthracis позволили разработать и внедрить в практику' военно-медицинской службы, а также рекомендовать для практического использования в микробиологических лабораториях схем специфике-

-5-ской индикации и идентификации сибиреязвенного микроба с применением методов определения основных таксономически значимых признаков, характерных для штаммов всех 4-х подвидов возбудителя сибирской язвы.

Аргументированность обоснования новых направлений НИОКР по проблеме сибирской язвы подтверждена практическими результатами при разработке и внедрении комбинированной сибиреязвенной вакцины (ВФС 42-3297-96) и противосибиреязвенного глобулина для медицинских целей (ВФС 42-3770-99), а также в организации производства сибиреязвенных вакцин, глобулина противосибиреязвенного для обеспечения потребностей военно-медицинской службы и здравоохранения России.

Теоретические и экспериментальные данные, которые обобщены в диссертации, получены в период с 1974 по 2001 гг. при выполнении плановых и инициативных тем НИР.

Результаты исследований представлены в 41 научной работе (научные отчеты, сборники докладов, монографии).

На защиту выносятся следующие основные научные положения и результаты:

1. По сочетанию основных признаков - кулыгурально-морфоло-гических, вирулентности для лабораторных животных и способности в разных условиях образовывать капсулу, вид Bacillus anthracis подразделен на 4 таксономических подвида (ВА1, ВАН, ВАШ, BAIV), из них первый подвид (BAI) -на 4 типа (ВАІа, ВАІб, ВАІв, ВАІг):

а) в соответствии с предложенной классификацией первый подвид (ВАІ)
В.anthracis состоит из высоковирулентных (типы ВАГа, ВАГв), вирулентных
(тип ВАІб) и слабовирулентных (тип ВАІг) штаммов, образующих капсулу в
макроорганизме и на бикарбонатном (сывороточном) агаре в атмосфере угле
кислого газа, формирующих на МПА в атмосфере воздуха шероховатые коло
нии (R, RO, RR, RRO), а на бикарбонатном агаре в атмосфере С0₂ - колонии
слизистой (S-форма) и/или полуслизнстой (OS-форма) консистенции;

б) второй подвид (ВАН) B.anthracis представлен вирулентными и слабо
вирулентными штаммами, образующими капсулу в макроорганизме и на пита
тельных средах вне зависимости от наличия в них бикарбоната натрия (сыво
ротки) и концентрации углекислого газа в атмосфере, формирующими коло
нии слизистой (S) и/или полуслизистой (OS) консистенции как на МПА в ат
мосфере воздуха, так и на бикарбонатном (сывороточном) агаре в атмосфере
С0₂. Отдельные штаммы подвида ВАН характеризуются высокой вирулентно
стью в отношении интактных и иммунизированных вакциной СТИ-1 лабора
торных животных:

в) штаммы третьего подвида (ВАШ) B.anthracis являются слабовиру
лентными и невирулентными, образуют капсулу в макроорганизме и на МПА
в атмосфере воздуха, формируют на обычном питательном агаре в атмосфере
воздуха колонии слизистой (S) и/или полуслизистой (OS) консистенции, не
способны размножаться на бикарбонатном (сывороточном) агаре в атмосфере

С0₂ или дают на этой среде скудный рост (менее 10 % микробной популяции) культуры в виде колоний шероховатой (R, RO) и гладкой (О) формы;

г) штаммы четвертого подвида (BAIV) B.anthracis являются невирулентными, не образуют капсулу ни при каких условиях, формируют на питательных средах, вне зависимости от наличия в них бикарбоната натрия, в атмосфере воздуха и СО? шероховатые колонии (R, RR, RO, RRO);

2. Разработанные схемы индикации и идентификации B.anthracis пригодны для обнаружения, выделения и идентификации штаммов всех 4-х подвидов возбудителя сибирской язвы;

3. Патоморфология внутренней (висцеральной) формы сибирской язвы у человека и различных видов высоко восприимчивых животных в основном сходна: независимо от способа заражения возбудителем и локализации входных ворот инфекции, обнаруживаемые на вскрытии во внутренних органах патологоанатомические изменения являются следствием генерализованной инфекции, однотипны и встречаются с одинаковой частотой. Исключение составляют специфические поражения тонкой кишки, наблюдаемые только при алиментарном заражении. При разных способах заражения наиболее демонстративные изменения выявляются в органах грудной клетки, тогда как патология органов брюшной полости менее представительна даже при энтеральном заражении;

4. Патологоанатомическая картина экспериментальной сибирской язвы у животных, обусловленная действием вирулентных и слабовирулентных штаммов подвида BAII B.anthracis, по характеру морфологических изменений однотипна с таковой у животных, погибших после заражения культурами высоковирулентного штамма подвида ВА1. Однако выраженность патологоана-томической картины у животных, погибших в одинаковые сроки наблюдения после зараження культурами штаммов подвидов ВА1 и ВАН, была разной: более вирулентным штаммам соответствовала более выраженная патологоанатомическая картина заболевания;

5. Разработанная патогенетическая классификация сибирской язвы, учитывающая способ заражения и локализацию возбудителя инфекции, лишена недостатков клинико-анатомической классификации (невозможность определения формы заболевания ігри поражении нескольких органов), позволяет определить место любому патоморфологическому изменению или сочетанному поражению нескольких внутренних органов и установить форму заболевания;

6. Основными направлениями дальнейших исследований по проблеме сибирской язвы являются:

а) изучение биологии и генетики вновь выделяемых из разных источников (животных, людей, почвы и т.п.) штаммов B.anthracis. оценка эпидемической и эпизоотической опасности штаммов, относящихся к разным подвидам возбудителя;

б) разработка новых и совершенствование существующих средств и
методов специфической индикации B.anthracis, лабораторной диагностики
сибирской язвы, прежде всего внутренней (висцеральной) ее формы:

в) разработка и совершенствование технологий и организация произ
водства сибиреязвенных диагностикумов, вакцинных препаратов, глобулина
противосибнреязвенного, высокоактивного видоспецифического диагностиче
ского сибиреязвенного бактериофага;

г) изучение лечебно - профилактической эффективности современных
антибиотиков в комбинации со средствами иммунопрофилактики (вакцинами
и глобулинами) и нммуномодуляторами при внутренней форме сибирской яз
вы;

д) совершенствование противосибиреязвенных мероприятий с учетом
данных районирования территорий страны по степении опасности возникно
вения эпизоотических и эпидемических вспышек сибирской язвы.

Решение задач по указанным направлениям позволит проводить проти-восибиреязвенные мероприятия своевременно и эффективно, что чрезвычайно важно в экстремальных условиях.

Результаты исследований реализованы составлением следующих документов:

а) руководства "Схемы и методы бактериологической диагностики и
экстренной профилактики опасных инфекционных заболеваний (чумы, сибир
ской язвы, сапа, мелпоидоза, бруцеллеза, туляремии, холеры)" (Утверждено
начальников НИИМ МО РФ 28.12.1995г., Киров, Арх. НТВ НИИМ МО РФ,
инв.№ 564 бр., 1995,435 с);

б) "Сборника методик для работы с возбудителем сибирской язвы" (Ут
верждено начальником НИИМ МО РФ, Арх. НТБ НИИМ МО РФ, инв.№
30249, 1988);

в) "Сборника методик для работы с возбудителем сибирской язвы" (Ут
верждено начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ и директором ВНИВИ Мин
сельхозпрода РФ, апрель 2001г., Екатеринбург - Казань, Арх. ЦВТП БЗ НИ
ИМ МО РФ, 2001);

г) предложений по совершенствованию средств и методов медицинской
защиты от сибирской язвы в "Перспективные планы НИР" НИИ микробиоло
гии МО РФ и ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ на 1981 ... 1985 гг., 1986 ... 1995 гг.,
1966...2000 гг., 2001...2005 гг.;

д) учебно-методического пособия для проведения занятий по военной
эпидемиологии н микробиологии для слушателей офицерских курсов и прак
тических врачей "Лабораторная диагностика сибирской язвы у людей" (Ут
верждено начальником СВМИ 19.10.1999 г., Самара. 1999, 34 е.);

е) "Инструкции по приготовлению и поддержанию рабочей культуры
тест- штамма 71/12 второй вакцины Ценковского" (Утверждена начальником
ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ 21. 08.2000 г., Екатеринбург, Арх. ЦВТП БЗ НИИМ
МО РФ. инв. № 416 ДСП, 2000,28 с);

ж) "Методики ускоренной оценки эффективности антибактериальных
препаратов на белых мышах, зараженных внутрибрюшннно споровой культу
рой сибиреязвенного тест - штамма 71/12 второй вакцины Ценковского" (Ут
верждена начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, 21.08. 2000 г., г. Екатерин
бург, Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, шт. № 417 ДСП, 2000, 8 с);

з) регламентов производства РП № 739 - 98 "Глобулин противосибире-
язвенный лошадиный жидкий" и изменений № 1 к регламенту производства
РП№740-98;

и) фармакопейной статьи ФС 42-3770-99 "Глобулин противосибиреяз-венный лошадиный жидкий" и "Инструкции по применению глобулина проти-восибиреязвенного лошадиного жидкого" (Утверждена в 1999 г);

к) предложений по специфической индикации B.anthracis в проект "Руководства по военной микробиологии" (М., 2000, 360 с, ДСП);

л) временной фармакопейной статьи ВФС 42-199ВС-92 и фармакопейной статьи ФС 42-3297-96 на "Вакцину сибиреязвенную комбинированную жидкую для подкожного применения";

м) экспериментально - производственного регламента ЭПР № 365-92 для получения вакцины сибиреязвенной комбинированной жидкой для подкожного применения и регламента производства РП № 980-00 для получения вакцины сибиреязвенной живой для подкожного и скарификационного применения сухой.

Материалы исследований использованы при составлении технических заданий на 37 тем НИР для НИИ микробиологии МО РФ, ЦВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ и ВНИВИ Мннсельхоза РФ.

Все исследования, результаты которых представлены в диссертации, выполнены лично автором, под его научным руководством или в соавторстве. Результаты теоретических и экспериментальных исследований, проведенных совместно с другими исполнителями, приводятся с согласия соавторов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 598 страницах машинописного текста н состоит из введения, аналитического обзора (2 главы), материалов и методов исследований (1 глава), результатов теоретических и экспериментальных исследований (5 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников (376 отечественных и 198 иностранных). Работа иллюстрирована 106 таблицами и 138 рисунками.

Автор выражает свою признательность руководству ВНИВИ Мннсельхоза РФ за предоставленную возможность обобщения результатов теоретических и экспериментальных исследований в виде докторской диссертации.

Искреннюю благодарность автор выражает научным консультантам работы доктору ветеринарных наук Садыкову Нариману Султановичу и доктору медицинских наук Литусову Николаю Васильевичу, оказавшим большую консультативную и практическую помощь при оформлении настоящей работы.