Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Биологическая роль аэробных спорообразующих бактерий в почве и ризосфере растений 12
1.2. Аэробные спорообразующие бактерии как антагонисты фитопатогенных грибов 13
1.3. Особенности колонизации ризосферы растений аэробными спорообразующими бактериями 23
1.4. Механизм и природа антагонистического действия бацилл на фитопатогенные грибы 30
1.5. Миколитическая активность бактерий рода Bacillus и роль хитиназ в проялении антагонизма 34
1.6. Цитокинины - растительные гормоны и их синтез некоторыми микроорганизмами в ризосфере 42
2. Объекты и методы исследований 49
2.1 .Бактериальные культуры 49
2.2. Культуры грибов 52
2.3. Растительные объекты 54
2.4. Методика проведения вегетационных опытов 55
2.5. Методика проведения опытов в теплице 56
2.6. Методика проведения полевых опытов 56
2.7. Производственные испытания 57
2.8. Характеристика вегетационных периодов 57
2.9. Методики определение микробиологической активности почвы в прикорневой зоне 61
2.10. Микроскопия 62
2.11. Методы определения растительных гормонов 63
2.11.1. Твердофазный иммуноферментный анализ 63
2.11.2. Определение цитокининов 64
2.11.3. Определение индолилуксусной (ИУК) и абсцизовой (АБК) кислот 65
2.11.4. Определение неспецифического ингибитора иммунологической реакции антиген-антитело (НИ) в культуральной жидкости 65
2.12. Методы очистки, выделения и идентификации бактериальных цитокининов 66
2.12.1. Экстракционная очистка цитокининов 66
2.12.2. Тонкослойная хроматография (ТСХ). 66
2.12.3. Ультрафильтрация 67
2.12.4. Приготовление аффинного носителя 67
2.12.5. Иммуноаффинная хроматография 67
2.12.6. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрией 67
2.12.7. Разделение свободных и связанных форм цитокининов 68
2.12.8. Биотест на цитокинины 68
2.13. Методы изучения ферментативной и миколитической активностей 69
2.13.1. Получение коллоидного хитина 69
2.13.2. По лучение коллоидного хитозана 70
2.13.3. Получение грибных хитинсодержащих материалов 70
2.13.4. Измерение хитиназной активности 70
2.13.5 Определение N-ацетилглюкозаминидазной активности 71
2.13.6. Измерение хитозаназной активности 72
2.13.7. Измерение р-1,3-глюканазной активности 72
2.13.8. Методы изучения антигрибной и миколитической активности хитиназы 73
2.13.9. Определение концентрации белка 75
2.14. Методы исследования физико-химических свойств ферментов 75
2.14.1. Основные этапы выделения и очистки хитиназы 75
2.14.2. Определение рН-профиля и рН-стабильности хитиназы 76
2.14.3. Определение температурного оптимума и термостабильности препаратов хитиназы 77
2.14.4. Методика определения влияния рН на термостабильность хитиназы 77
2.14.5. Гель-электрофорез в денатурирующих условиях 77
2.15. Статистическая обработка результатов 78
3. Скрининг природных бактерий-антагонистов рода Bacillus cohn и определение спектра их антагонистической активности в отношении почвенных микромицетов 79
3.1. Выделение бацилл-антагонистов из почв, анализ их видового состава и спектра антагонистического действия. 79
3.2. Взаимодействие бацилл-антагонистов с некоторыми микромицетами 86
4. Приживаемость и распространение интродуцированных штаммов бацилл в корневой системе проростков яровой пшеницы 106
4.1 Колонизация зерновки и корневой системы проростков пшеницы при бактеризации семян 107
4.1.1. Электронно-микроскопическое исследование взаимодействия бацилл-антагонистов с поверхностными структурами и тканями семени пшеницы 107
4.2. Особенности заселения и колонизации ризосферы пшеницы при интродукции бацилл-антагонистов 119
4.3. Влияние водного и температурного режимов почвы на динамику численности бацилл в ризосфере пшеницы 125
4.3.1. Влияние температуры почвы на динамику численности бацилл-антагонистов в ризосфере пшеницы 126
4.3.2. Влияние влажности почвы на динамику численности бацилл антагонистов в ризосфере пшеницы 130
5. Влияние интродукции бацилл-антагонистов в ризосферу пшеницы на микробиологические процессы в прикорневой зоне 134
5.1 Влияние интродукции бацилл-антагонистов на микробиологическую активность в прикорневой зоне пшеницы 134
5.2 Влияние интродукции бацилл-антагонистов на почвенные бактерии рода Pseudomonas в ризосфере пшеницы 142
5.3. Влияние инфекционного фона на численность интродуцированных бацилл-антагонистов 147
6. Полевая эффективность применения бацилл антагонистов 152
6.1. Эффективность применения "Бациспецина БМ" на озимой пшенице против аэрогенных инфекций 152
6.2. Эффективность подавления аэрогенных инфекций на посевах яровой пшеницы 157
6.3. Эффективность бацилл-антагонистов в отношении твердой головни пшеницы 160
6.4. Эффективность подавления развития корневых гнилей на посевах яровой пшеницы 162
6.5. Производственные испытания опытно-промышленной партии препарата "Бациспецин БМ" 176
7. Продукция бациллами-антагонистами веществ фитогормональной природы 178
7.1. Влияние бактерий-антагонистов рода Bacillus на фитогормональный статус растений пшеницы. 178
7.2. Образование цитокининов бациллами антагонистами 182
7.3 Исследование природы цитокининов, продуцируемых аэробными споробразующими бактериями рода Bacillus 185
8. Гидролитические ферменты бацилл-антагонистов 199
8.1. Хитинолитическая активность коллекционных штаммов бацилл-антагонистов 199
8.2. Характеристика гидролазного комплекса хитинолитических бацилл 203
8.3. Влияние компонентов питательных сред на продукцию ферментов гидролитического комплекса 204
8.4. Выделение, очистка и характеристика хитиназы Bacillus sp.739 211
8.5. Субстратная специфичность и механизм действия хитиназы Bacillus sp.739 218
8.6. Проявление антигрибной активности препаратами хитназы Bacillus sp. 739 220
Выводы 233
Список литературы 236
Приложения
- Особенности колонизации ризосферы растений аэробными спорообразующими бактериями
- Взаимодействие бацилл-антагонистов с некоторыми микромицетами
- Эффективность применения "Бациспецина БМ" на озимой пшенице против аэрогенных инфекций
- Влияние компонентов питательных сред на продукцию ферментов гидролитического комплекса
Введение к работе
Актуальность темы. Аэробные спорообразующне бактерии рода Bacillus Cohn. широко используются в микробиологической и медицинской промышленности как продуценты ферментных препаратов, антибиотиков и пробнотиков. В сельскохозяйственном производстве их применение ограничивалось лишь в качестве основы инсектицидных препаратов. В последнее время, в связи с насущной проблемой перехода к биологическому земледелию, интенсивно разрабатываются методы биологической защиты растений от болезней и соответствующие биопрепараты, призванные минимизировать применение химических пестицидов. Бактерии рода Bacillus рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней растении в силу их широко распространенного природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам. В последнее десятилетие во многих ведущих агропромышленных странах были созданы и испытаны некоторые препараты на основе бацилл-антагонистов. Однако, зачастую применение таких биопрепаратов оказывалась мало- или абсолютно неэффективным. Причина неудач в этих случаях кроется в недостаточной изученности жизнедеятельности почвенных бацилл при их взаимодействии с растениями и фитопатогенной микрофлорой. Бактерии рода Bacillus не относятся к типично ризосферным. Вместе с тем, при искусственной инокуляции посевного материала они способны длительное время развиваться и доминировать в прикорневой зоне растений, выдерживая конкуренцию со стороны аборигенной и фитопатогенной микрофлоры. На способность бактерий приживаться в ризосфере и осуществлять жизнедеятельность оказывают влияние как биогенные факторы так и условия внешней среды. Для успешного практического применения необходимо учитывать видовую специфичность используемого микроорганизма и влияние внешних факторов. Продукты жизнедеятельности бацилл могут оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на растения. Состав, как продуцируемых метаболитов, так и секретируемых ферментов, определяющих взаимоотношения интродуцированных бацилл с растениями и патогенной :.::::фофлорой, исследован крайне недостаточно. В частности, до сих пор отсутствуют какие либо сведения о способности бактерий рода Bacillus синтезировать вещества фитогормональной природы. Недостаточно исследованы воздействия антибиотических веществ, продуцируемых бациллами различной видовой принадлежности, на фитопатогенныё грибы. Не установлена роль миколитических ферментов в проявлении антагонизма бацилл к мицелиальным грибам. Решение этих проблем позволит ускорить внедрение, в практику биологических методов защиты растений от болезней и создание высокоэффективных биопрепаратов на основе бацилл-антагонистов.
Цель н задачи исследований. Настоящая работа посвящена детальному изучению процессов взаимодействия с растениями и микрофлорой
ингродунированных бацилл в ризосфере, влиянию внешних условий на процессы приживаемости и жизнедеятельпости, исследованию природы ростстнмулирующих веществ, продуцируемых отдельными штаммами рода Bacillus и исследованию роли экстрацеллголярных миколитнческих ферментов бацилл в проявлении их антагонизма к микромицетам. В соответствии с этим были определены следующие задачи:
выделить из почвенных образцов, описать и идентифицировать изоляты бацилл-антагонистов, определить спектр и особенности антигрибного действия;
изучить особенности колонизации зерновки и корешков прорастающих семян пшеницы бациллами-антагонистами и их влияния на ультраструктуру растительных клеток;
иследовать динамику и распространение интродуцированных бацилл в ризосфере пшеницы в лабораторных ,и полевых условиях;
исследовать влияние интродукции бацилл-антагонистов на микробиологические процессы в прикорневой зоне растений пшеницы;
оценить полевую эффективность применения бацилл-антагонистов в подавлении развития грибных болезней злаков и влияние на продукционные процессы растений;
изучить влияние интродукции бацилл на фитогормональный статус растений пшеницы и оценить способность природных изоля-тов к продукции рострегулирующих веществ;
разработать методику выделения микробных цитокининов н установить их химическую природу;
исследовать состав комплекса бациллярных мнколитическнх ферментов и изучить влияние условий на их продукцию;
выделить, очистить и охарактеризовать хитиназу Bacillus sp.73,9 и выяснить роль этого фермента в проявлении антагонизма к грибам;
- разработать и произвести в промышленных условиях бактериаль
ный препарат "Бациспецин БМ" для расширенных производст
венных испытаний,
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование влияния интродуцируемых в ризосферу растении бацилл-антагонистов на ультраструктуру клеток и продукционные процессы растений, на реакцию фитопатогенных грибов и развитие аборигенной микрофлоры в прикорневой зоне. Установлено, что при предпосевной инокуляции клетки развивающихся бактерий проникают в колеоризу и выступают как слабые патогены. Антагонистическое действие бацилл в отношении микромицетов проявляется в нарушении процесса прорастания грибных спор и строения скелета формирующегося мицелия, образованием сферопластов на кончиках гиф с последующим их лизисом. Показано, что колонизация поверхности формирующихся корней проростков пшеницы
бациллами происходит путем образования микроколоиий, прикрепленных к эпидермалыюму слою материалом, подобным гликокаликсу. Характер заселения ризосферы растений зависит от впдовон принадлежности бацилл и факторов внешней среды и, в первую очередь, от температурного режима почвы. Развитие внедренных в ризосферу бацилл не оказывает угнетающего воздействия на основные агрономически значимые группы аборигенной микрофлоры, одновременно с этим увеличивает фунгистатнческин потенциал прикорневой зоны почвы. Эффективное подавление корневых гнилей растений происходит на ранних этапах развития, для злаков, - до стадии начала цветения.
Впервые обнаружена способность бактерий рода Bacillus воздействовать на фито1 ^рмоиальный статус растений и продуцировать ругательиые гормоны цитокнпиновой группы. Выде1ена и охарактеризована новая форма "цитокипниов, представляющая собой комплекс зеатннрибозида с полисахаридами.
Исследован миколитическин комплекс ферментов культуры Bacillus sp.139, включающий Р-1,3-глкжаназу, хитииазу и хитозаназу. Подтверждена белковая множественность форм хитиназ, синтезируемых представителями рода Bacillus и установлено, что по механизму действия фермент является экзо-хитиназой. Впервые для бацилл проведено подробное исследование роли хитнназы в проявлении антнгрибной активности к некоторым фитопатогенным грибам. Показано отсутствие взаимосвязи между литической активностью очищенной хнтиназы Bacillus sp. 739 и ее способностью ингибнровать ростовые процессы у фитопатогенных грибов.
Практическая значимость. Установлены закономерности развития интродуцпрованных бацилл в ризосфере растений. Выявлен механизм антагонистического действия бацилл в отношении микромицетов и положительное влияние бактеризации растений отобранными штаммами на продукционные процессы и снижение заболеваемости.
Предложен штамм Bacillus sp.139 в качестве основы биопрепарата "Бацнспецин БМ" и продуцента хитнназы. Заявлен штамм B.subtilis ИБ-22 - продуцент цитокинннов.
Апробация результатов. Основные результаты исследований были представлены на II Симпозиуме стран членов СЭВ по микробным пестицидам (Протвино, 1990), Всесоюзной конференции "Микробиология в сельском хозяйстве" (Кишинев, 1991), Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991), Всесоюзном снмпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург, 1991), конференции "Биология почв антропогенных ландшафтов" (Днепропетровск, 1991), IV Всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущине, 1992), П-й конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1993), конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, 1994), Всероссийском съезде по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного ком-
плекса: экономика, эффективность, экологичность" (Санкт-Петербург, 1995), Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы" (Пермь, 1996), 5-ом международном симпозиуме "Root Demographics and Their Efficiencies in Sustainable Agriculture, Grasslands and Forest Ecosystems" (Клемсон, ЮК, США, 1996), Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), Международной школе "Проблемы теоретической биофизики" (Москва, 1998), Международной, конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998), III съезде Докучаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000).
Публикации. Основные результаты исследований изложены в 37 науч.^.лх публикациях, включая 3 патента и авторских свидетельств.
Объем и структура работы. Диссертационная работ? состоит ::з введения, обзора литературы, экспериментальной части (7 глав), заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на 287 страницах, содержит 48 рисунков и 56 таблиц. Список лите-ратуры в^ючает559 наименование вт.ч ^иностранных публикаций
Особенности колонизации ризосферы растений аэробными спорообразующими бактериями
По мнению Lugtenberg et al. (1994) основными факторами, лимитирующими применение микробиологических средств защиты и требующими всестороннего изучения и обсуждения, являются колонизация, выживаемость на семенах и активность интродуцентов в процессе прорастания семян. В настоящее время накоплено достаточно много данных о микроорганизмах, функционирующих в системе "микроорганизмы - корневая система растения". Имеющиеся работы представляют достаточно много интересных данных о процессах, происходящих на поверхности корня и в прикорневой зоне растений. Опубликованные результаты посвящены изучению закономерностей формирования и развития микробных сообществ на корневой поверхности в различные фазы роста и развития растений; наблюдениям за изменением биомассы микроорганизмов на корнях растений; соотношению и составу некоторых групп микроорганизмов в ризосфере отдельных видов растений. Все это дает довольно много полезной информации о жизнедеятельности микроорганизмов в ризосфере и ризоплане растений. К сожалению, лишь незначительное количество работ посвящено изучению поведения конкретных видов микроорганизмов и, в частности, бацилл-антагонистов при их интродукции.
Считается, что бактерии рода Bacillus не относятся к типично ризосферной микрофлоре. Численность бацилл, в пределах ризосферной и окружающей почвы, практически не изменяется, а ризосферный эффект для этих микроорганизмов равен примерно 1 (Мишустин, 1972; Geels, Schippers, 1983; van Elsas et al., 1986; Miller et al., 1989). Тем не менее, в ризосфере обитают довольно значительные популяции видов Bacillus. Аэробные спорообразующие бактерии хорошо развиваются в ризосфере риса, ячменя, кукурузы и других сельскохозяйственных культур, где чаще всего преобладают виды B.subtilis. В реальных полевых условиях их численность может достигать 105 КОЕ/г почвы (Flannigan, 1987). Полагают, что развиваясь в ризосфере растений, бациллы обеспечивают быструю хелатизацию минеральных солей (Зак, 1975).
Существует несколько основных путей интродукции бактерий-антагонистов в ризосферу растений: обработка семян, внесение в почву, опрыскивание растений суспензией культур. Согласно литературным данным наиболее эффективной является предпосевная инокуляция семян, приводящая к быстрому распространению микроорганизмов в корневой системе. Процесс колонизации корней интродуцированными бактериями протекает в 2 стадии (Howie et al., 1987). На первой стадии бактерии, нанесенные на семя, вступают в контакт с зарождающимися корнями и пассивно распределяются по растущему корню благодаря его удлинению. Howie, Cook (1985) и Dijkstra с соавторами (1987) также полагают, что распространение бактерий по корням растений происходит путем пассивного переноса, а не активной миграцией. На второй стадии бактерии размножаются и распространяются по корню в конкуренции с аборигенной микрофлорой. С удлинением корня большая или меньшая часть бактериальных клеток остается на поверхности корня, а другая часть проникает в прикорневую почву (Weller, 1988).
Биологический вид растений влияет на численность интродуцированных микроорганизмов. Podile и Dube (1988) инокулировали культурой Bacillus subilis AF 1 семена огурцов, голубиного гороха, хлопка, томата и баклажана. На 21 день после прорастания численность этого штамма на корнях растений составляла от 1,8 103 до 1,5 104 КОЕ/г корней, причем наивысшей она была у огурца, а наименьшей - у хлопка. Вероятно, специфичность корневых эксудатов влияет и на плотность популяций микроорганизмов в ризосфере.
Существует гипотеза о взаимодействии геномов растений и ризосферных бактерий. Chanway et al. (1988) исследовали взаимодействие бактерий рода Bacillus с растениями различных сортов яровой пшеницы (Tritikum aestivum L.). Бактерии, выделенные из ризосферы сорта Katepwa, стимулировали рост растений лишь этого сорта, но ни один из этих изолятов не оказывал влияния на другой сорт Neepawa HY 320. Возможно, существует некая адаптация ризосферных бактерий к соответствующему сорту. Авторы установили, что для пшеницы срок адаптации составляет около 5 лет (Chanway et al., 1988; Chanway, Nelson, 1990).
Полагают, что способность самих бактерий к колонизации корневой системы растений видо-, а возможно, и штаммоспецифична (Misaghi, 1990). Так, по данным Maplestone & Campbell (1989), виды B.subtilis и B.pofymyxa заселяют поверхность корней пшеницы по всей их длине, a B.mycoides располагаются только на базальных участках корней, близко расположенных к инокулированному зерну. Неравномерность в распределении микроорганизмов по корневой системе может быть обусловлена количеством и составом эксудатов, выделяемых различными частями корня. По данным Оразовой с соавт. (1994), динамика численности бактерий и грибов определяется преимущественно за счет средней части корня, тогда как динамика актиномицетов - за счет апикальной части. Важным фактором, характеризующим конкурентную активность микроорганизмов в ризосфере, является время их генерации в ризосфере растений. Так, для интродуцированных псевдомонад время генерации на корнях сосны лучистой {P.radiatd) составляло 5,2 ч, a Bacillus spp. - 39 ч (в почве соответственно 77 ч и более 100 ч) (Bowen, Rovira, 1976). В целом установлено, что бактерии рода Pseudomonas колонизируют ризосферу сельскохозяйственных растений намного быстрее, чем бактерии рода Bacillus (Renwick et al., 1991).
В ряде работ, посвященных исследованию физиологического состояния интродуцированных в ризосферу микроорганизмов, было показано, что большая часть клеток бацилл находится в споровом состоянии (van Elsas et al., 1986; Dijkstra et al., 1987; Weihs, Jagnow, 1989).
Динамику численности B.subtilis в ризосфере пшеницы в модельных опытах изучали van Elsas с соавторами (1986). Численность бактерий резко снижалась в течение 60-ти дней после инокуляции, но затем оставалась стабильной до конца опыта (120 дней). Reddy & Rahe (1989 а), наблюдали сходные результаты в ризосфере лука. При инокуляции растений штаммом B.subtilis В2 (4,810 КОЕ/растение), происходило резкое снижение численности бацилл к 14 дню (1,110 КОЕ/раст). Затем, в течение 12-ти недель снижение численности происходило медленнее. К 14-ой неделе численность интродуцированных бактерий составила лишь 9,510 КОЕ/раст. Вместе с тем, бактеризация семян лука B.subtilis привела к снижению плотности аборигенной микрофлоры в ризосфере (Reddy, Rahe, 1989 b). А.Д.Гарагуля с соавторами (1988) также показали, что конечная плотность популяции интродуцированных бактерий на корнях пшеницы примерно одинакова, несмотря на то, что начальная различалась. Согласно модели Newman & Watson (1977), плотность популяции на корнях лимитируется количеством эксудатов, и к концу вегетации растений, независимо от количества внесенного инокулята, это приводит к выравниванию численности бактерий.
Тем не менее, при инокуляции растений или семян агентами биологического контроля важно определить оптимальную дозу инокулята. В опытах Freier et al. (1990), по биологической защите гвоздики от фузариозного увядания антагонистом B.subtilis Т 99, при внесении суспензии штамма (2107 КОЕ/мл) в почву эффективными оказались дозы в 20 - 40 мл на 1 м2 почвы. При высоких (160 мл/м2) или низких (10 мл/м2) дозах инокулята поражение гвоздики фузариозным увяданием было даже выше, чем в контроле. Отрицательное влияние высоких доз инокулята В. subtilis на рост яровой пшеницы продемонстрировали Chanway и Nelson (1990). Дозы выше 107 КОЕ на участок почвы диаметром 7,5 см вызывали уменьшение веса корней и надземной части проростков. Сложилось мнение, что эффективная доза инокулята бацилл-антагонистов должна обеспечивать численность популяции порядка 10-10 КОЕ/г корней (Maplestone, Campbell, 1989; Freier et al., 1990). А при инокуляции семян или корней растений, оптимальной дозой антагонистов считается такая, при внесении которой концентрация клеток составит 105-106КОЕ на 1 растение или семя (Filippi et al., 1984; Bashan, 1986).
Аборигенная микрофлора оказывает влияние на интродуцированные бактерии. Bagnoli и Filippi (1985) отмечали, что в ризосфере гвоздики, инокулітро-ванной штаммом B.subtilis М 51,- антагонистом возбудителя фузариозного увядания F. oxysporum, его численность достигала 80% от всей численности бактериальной микрофлоры, но, тем не менее, защитный эффект носил временный характер. По мнению К.В.Попковой и А.И.Фролякиной (1989) это может быть связано с постепенным вытеснением популяции бацилл из ризосферы сапрофитной микрофлорой. Присутствие грибов-фитопатогенов в ризосфере должно оказывать влияние на поведение бацилл-антагонистов (Siala, Gray, 1974). Maplestone и Campbell (1989) показали, что популяция антагониста B.pumilus на корнях пшеницы в присутствии возбудителя корневых гнилей пшеницы G.graminis возрастает, тогда как В.cereus var. mycoides, наоборот, снижается. Существенное влияние на поведение интродуцированных микроорганизмов в ризосфере оказывают физические факторы среды. Сведений о влиянии температуры на рост и развитие почвенных и ризосферных бацилл крайне мало. В экспериментах с культурой B.subtilis, антагонистом возбудителя выпревания сахарной свеклы Rh. solani, было установлено отрицательное влияние на подавление болезни повышения температуры от 21 до 27С (Dunleavy, 1955). Вместе с тем, на примере штамма B.subtilis В2, рекомендованного для подавления возбудителя белой гнили лука Sclerotium cepivorum, было показано, что его развитие в ризосфере угнетается низкой температурой почвы. При 17-19С плотность популяции этой культуры была значительно ниже, чем при 22-25С (Reddy, Rahe, 1989 а). Как правило, оптимальные температуры роста бактериальной популяции in plate и in situ значительно отличаются. Так, было показано, что при росте Bacillus spp. на глюкозодрожжевом экстракте нижний порог образования антибиотических веществ составлял 12 С, а при росте на почвенном экстракте -14-16С. У яровой пшеницы, при выращивании в полевых условиях, начальная температура прорастания и формирования корневой системы не превышает 7-10 С, что, по мнению Lengkeek, Otta (1979), не позволяет активно развиваться и образовывать антибиотики интродуцированным бациллам. Вместе с тем, почвенные фитопатогены, в частности, возбудители корневых гнилей, способны развиваться и при более низких температурах. С другой стороны, имеется достаточно много примеров и успешного применения бацилл для предотвращения заражения растений почвенными патогенами (Merriman et al., 1974; Faull, Campbell, 1979; Lengkeek, Otta, 1979; Capper, Campbell, 1986; Bassett et al, 1987; Hornby, 1987; Chanway, Nelson, 1990). Вероятно, подавление почвенной инфекции в ризосфере интродуцированными бактериями, связано не только со способностью продуцировать ими антигрибные вещества. Возможно, имеет место индукция устойчивости растений за счет взаимодействия с интродуцированными микроорганизмами, также как и иной механизм взаимоотношений с фитопа-тогенной микрофлорой, например миколизис.
Взаимодействие бацилл-антагонистов с некоторыми микромицетами
Антагонизм бацилл в отношении микроскопических грибов может осуществляться за счет продукции комплекса ферментов, лизирующих клеточные стенки грибов (Morgan, 1963), синтеза антибиотических веществ (Pusey & Wilson, 1984; Islam & Nandi, 1985; Backhose & Stewart, 1989) и за счет конкуренции в потреблении питательных веществ, включая потребление продуктов экзоосмоса прорастающих спор грибов (Возняковская, Труфанова, 1988). На наш взгляд, среди перечисленных механизмов антагонистического действия наиболее значимым является действие антибиотиков, выделяемых бактериальными клетками в окружающую среду. Известные на сегодняшний день бациллярные антибиотики, за редким исключением, являются линейными или циклическими пептидами. По аминокислотному составу, строению и физиологическому действию антибиотики, продуцируемые бактериями группы B.subtilis и группы B.polymyxa, имеют существенные различия, а это должно проявиться в характере их воздействия на мицелиальные грибы.
В данной работе была поставлена задача, изучить и сопоставить действие метаболитов, выделяемых в среду бактериями-антагонистами двух различных таксономических групп рода Bacillus на процесс прорастания спор и развитие мицелия грибов - возбудителей обыкновенной корневой гнили злаков.
В работе использовали изоляты ЕМ-16, идентифицированный и обозначенный в лабораторной коллекции как штамм Bacillus subtilis ИБ-15, изолят 813, определенный как B.polymyxa ИБ-37 и штамм B.macerans ВКМБ-506. В качестве тест-объектов использовали местные изоляты B.sorokiniana и F.solani, а также F. avenaceum и F. culmorum - из коллекции ВИЗР.
Бациллы выращивали сплошным газоном на поверхности капроновой мембраны (размер пор 0,2 мкм), помещенной на питательный агар. Отделение растущей культуры от питательной среды мембраной не препятствовало транспорту трофических компонентов и диффузии в агар метаболитов, но предотвращало контаминацию агара бактериальными клетками. После трех суток инкубации при 32С мембрану с биомассой бацилл удаляли, а на поверхность агара высевали суспензию конидий тестируемого гриба. Для получения суспензии спор грибов использовали 7-суточные культуры. Наблюдение за процессом прорастания грибных пропагул и конидий вели с помощью светового микроскопа просматривая в каждом образце по 50-60 спор.
Конидии F.culmorum, F.solani и B.sorokiniana, высеянные на агар, насыщенный проникшими через мембрану метаболитами бацилл, не проросли даже после 22 ч инкубации (табл.3.2.1). Конидии же F.avenaceum, хотя и со значительной задержкой, сумели преодолеть фунгистатический эффект антибиотиков B.subtilis, но не B.polymyxa. Метаболиты неантагонистичной культуры В.тасегат не оказывали отрицательного влияния на прорастание и развитие всех испытуемых грибов. Длина ростовых трубок через 7 часов инкубации практически не отличалась от контрольных и, через 22 ч инкубации, у F.avenaceum и F.culmorum отмечено спорообразование, а у B.sorokiniana и F.solani сплошной рост мицелия как в контрольном варианте, так и на среде, пропитанной метаболитами В. macerans. Следовательно, прединкубация бацилл на питательном агаре не приводила к истощению субстрата. Полное подавление прорастания конидий на насыщенном метаболитами бацилл-антагонистов агаре свидетельствует о том, что концентрация антибиотических веществ в нем была выше летальной дозы.
Для изучения воздействия нелетальных доз метаболитов бацилл на процесс прорастания конидий и морфогенез изучаемых грибов мы создавали в агаре зоны с радиальным градиентом концентраций. Для этого, после удаления мембраны с биомассой бацилл, сверлом вырезали агаровые блоки диаметром 8,0мм и помещали их на поверхность свежей агаризованной среды по 6 блоков на одну чашку Петри и выдерживали при 28С в течение 24 ч. Затем блоки удаляли, а поверхность агара засевали суспензией спор соответствующего тест-гриба. В зоне диффузии достаточное время сохранялся радиальный градиент концентрации антибиотических веществ. В контрольных вариантах споры фитопато-генов высевали на стерильный ЮГА. Для оценки возможного влияния на прорастание спор грибов истощения субстрата, за счет его потребления культурой бацилл, использовали штамм В.тасегат ВКМ-506, не проявлявший антагонистического действия в отношении изучаемых грибов.
На периферии антибиотических зон наблюдалась задержка прорастания спор, продолжительность которой зависела от штамма антагониста (табл.3.2.2). В первые часы инкубации лишь метаболиты B.polymyxa заметно замедляли прорастание конидий фитопатогенов. Метаболиты B.subtilis по разному влияли на прорастание конидий, в частности, конидии B.sorokiniana оказались наиболее уязвимыми и не проросли даже через 22 ч инкубации, тогда как прорастание конидий фузариев мало отличалось от контрольного варианта.
Через 22 ч экспозиции четко проявился эффект градиента концентраций. В середине пятна антибиотиков B.subtilis (место наложения блока) прорастания спор всех испытуемых грибов не происходило, а ближе к периферии из проросших спор формировался мицелий с морфологическими уродствами, проявившимися в образовании сферопластов на кончиках ростовых трубок (рис.3.2.1.б) и растущих гиф (рис.3.2.2.б). Вне зоны диффузии антибиотика мицелий был хорошо развит и имел типичный для конкретной культуры вид (рис.3.2.1.а,3.2.2.а).
По другому проявилось действие антибиотических веществ B.polymyxa. Образования сферопластов в зоне метаболитов этого штамма нами не выявлено, но обнаружено нарушение морфогенеза грибов, проявившееся в резком увеличении степени ветвления мицелия как у B.sorokiniana (рис.3.2.1.в), так и у исследованных представителей рода Fusarium (рис.3.2.2.в).
Образование сферопластов под действием антибиотических веществ B.subtilis ранее было описано у Sclerotinia sclerotiorum (Zazzerini & Tosi, 1985). У передающихся через почву фитопатогенных грибов Alternaria alternata (Fr.) Keissler, Drechlera oryzae (Breda de Haam) Sub. и Fusarium roseum Link, отмечено образование вздутий на кончиках растущих гиф под влиянием веществ, сек-ретируемых B.megaterium (Islam & Nandi, 1985), у возбудителя ржавчины злаков, Puccinia recondita Rob. ex Desm., - под действием B.pumilis (Morgan, 1963). Интересно, что все три вида бацилл, для которых отмечена такая реакция грибов, относятся к одной морфолого-физиологической группе, объединяющим признаком которой, является их способность синтезировать дипептидный антибиотик бацилизин (Loeffler et al., 1990). Образование вздутий на кончиках ростовых трубок приводит к их последующему лизису под действием осмотических сил.
Существует мнение, что антибиотические вещества B.subtilis подавляют прорастание грибной споры путем нарушения проницаемости мембран, что вызывает необратимые изменения цитоскелета (Pusey & Wilson, 1984). Однако, наблюдения за разрушением клеточной стенки Sclerotium cepivorum под действием метаболитов B.subtilis, позволили авторам предположить, что антибиотические вещества B.subtilis воздействуют скорее всего на метаболические процессы (Backhose & Stewart, 1989). Блокирование образования N-anenui-D-глюкозамина и включения его в структуру хитина клеточной стенки происходит, например, при действии полиоксиновых антибиотиков (Endo & Misato, 1969). Вероятно, подобный механизм имеет место и при действии антибиотиков бактерий группы B.subtilis, поскольку образование сферопластов (вздутий) наблюдается лишь на молодых, быстрорастущих гифах. Так, среди антибиотиков, продуцируемых культурами B.subtilis, бациллизин известен именно как вещество, подавляющее синтез глюкозамин-6-фосфата (Chmara et al., 1981). Другие продуцируемые бактериями группы B.subtilis антибиотики, например, микобациллин и ряд липофильных октапептидов, напротив, воздействуют на цитоплазматическую мембрану, нарушая ее проницаемость (Chattopadhyay & Bose, 1980; Себек, 1969). Очевидно, при воздействии вторичных метаболитов B.subtilis на мицелиальные грибы имеют место оба механизма одновременно.
Действие антибиотических веществ B.polymyxa, как отмечено выше, вызывает нарушения в характере ветвления гиф мицелиальньж грибов. Это, на наш взгляд, может происходить либо из-за нарушений на уровне функционирования клеточных мембран, либо на уровне функционирования генетического аппарата. Известно, что полимиксины и циркулин, наиболее часто встречающиеся антибиотические вещества бактерий группы B.polymyxa, являются ионо-форами и, связываясь с клеточной мембраной, нарушают ее нормальную проницаемость (Себек, 1969).
Таким образом, воздействие метаболитов бактерий группы B.subtilis на фитопатогенные мицелиальные грибы характеризуется образованием сферопластов на кончиках растущих гиф, а группы B.polymyxa - формированием му-товчатообразного скелета формирующегося мицелия. Описанные отличия обусловлены, вероятнее всего, природой и механизмом физиологического действия продуцируемых представителями этих групп антибиотических веществ.
Эффективность применения "Бациспецина БМ" на озимой пшенице против аэрогенных инфекций
Наиболее вредоносными из аэрогенных инфекций злаков являются возбудители желтой ржавчины Puccinia striiformis West, стеблевой P.graminis Pers, бурой P.recondita Rob. Ex Desm.. и мучнистой росы Erysiphe graminis DC. В связи с этим, представляло интерес определить возможность подавления развития этих болезней злаков с помощью отобранных нами бацилл-антагонистов; Определить антагонистическое действие по отношению к данной группе грибов in vitro не представлялось возможным, поскольку физиологически они являются облигатными паразитами и практически не культивируются на искусственных питательных средах.
Испытания проводили на базе СКНИИФ (в настоящее время ВНИИ биологических средств защиты растений, г.Краснодар) в условиях теплицы на всходах озимой пшеницы сорта Безостая 1 при условиях, оптимальных для развития растений и фитопатогенов. Эффективность действия бактерий-антагонистов и биопрепарата "Бациспецин БМ" определяли при различных способах обработки: замачивание семян в суспензии клеток, опрыскивание ве-гетирующих растений за сутки до заражения и обработка инфицированных растений (через сутки после заражения). В качестве инфекционного инокулюма при заражении использовали образцы уредоспор трех видов ржавчины и конидий мучнистой росы, которые по спектру вирулентности соответствовали популяциям фитопатогенов северокавказского происхождения. После нанесения инокулюма растения выдерживали во влажной камере не менее 24 часов. По-вторность опытов трехкратная.
Эффективность действия определяли учетом количества проявившихся пустул на 1 см2 листовой поверхности. В каждом варианте учитывали 40 растений. Контролем служили необработанные инфицированные растения.
Эффективность предпосевной обработки семян против аэрогенной инфекции была определена по развитию бурой ржавчины (возбудитель P.recondita). Наибольшую устойчивость проявили растения, выращенные из семян, обработанных отмытыми клетками культуры В. subtilis ИБ-15 (табл. 6.1.1) - снижение проявления пустул патогена более 70%. При обработке семян биопрепаратом "Бациспецин БМ" с концентрацией 1,8 х 10 КОЕ/мл, проявляемость пустул снизилась в 2 раза по сравнению с контролем. В то же время обработка отмытыми клетками Bacillus spJ39 привела к снижению проявления пустул не более чем на 15%.
Сам факт снижения проявления аэрогенной инфекции, в результате предпосевной бактеризации семян, свидетельствует о существовании неких механизмов индукции устойчивости растений, поскольку в этих условиях непосредственный контакт антагониста с фитопатогеном исключен. Ранее были описаны случаи подавления развития ржавчины на листьях лука (возбудитель P. allii Rud) при обработке растений В. cereus (Doherty & Preece, 1978). Однако снижение развития ржавчины при обработке семян обнаружено нами впервые.
При профилактической обработке растений пшеницы, за сутки до заражения, также установлено значительное снижение проявления болезни (табл. 6.1.2).
Опрыскивание растений препаратом "Бациспецин БМ" привело к снижению проявления бурой ржавчины на 47,2 -73,9%%, стеблевой ржавчины на 67,3 - 72,2%% и полному подавлению проявления желтой ржавчины. Развитие мучнистой росы в результате профилактической обработки этим же препаратом снизилось на 62,5 - 68,7%%. В то же время, применение для обработки растений отмытых клеток Bacillus др. 739, биологического начала препарата "Бациспецин БМ", оказалось менее эффективным (табл. 6.1.2). Максимальный уровень снижения проявления бурой ржавчины и мучнистой росы при обработке клетками B.subtilis ИБ-15 составил 48,2 и 38,0%% соответственно. Следует отметить высокую эффективность применения клеток исследуемых культур бацилл-антагонистов в отношении возбудителя желтой ржавчины Puccinia striiformis -максимальное подавление развития патогена культурой Bacillus sp.739 достигало 85,9%, а культурой В. subtilis ИБ-15-100%.
Результаты оценки искореняющего действия препарата "Бациспецин БМ" и культур антагонистов представлены в таблице 6.1.3. Как следует из представленных данных, такая обработка (растений, инфицированных за сутки до обработки) менее эффективна, чем профилактическая. Применение Бациспецина снизило проявление болезней от 40,0 до 61,4%%, а использование клеток Bacillus sp.139 вообще не оказывало заметного влияния. Культура В.subtilis ИБ-15 оказалась достаточно эффективной в отношении возбудителя желтой ржавчины.
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали возможность использования бацилл-антагонистов в защите пшеницы от таких распространенных аэрогенных инфекций как желтая, стеблевая и бурая ржавчины и мучнистой росы. Одновременно показано, что для Bacillus sp.739 препаративная форма предпочтительнее, вероятно, потому, что в ней содержатся активные метаболиты. Вместе с тем, при профилактической обработке растений высокую эффективность продемонстрировал штамм В. subtilis ИБ-15. Важное значение для понимания механизмов биологического воздействия на растения бацилл-антагонистов имеет обнаруженный феномен снижения развития аэрогенных инфекций при бактеризации семян.
Влияние компонентов питательных сред на продукцию ферментов гидролитического комплекса
Для достижения высокого уровня секреции хитиназы при культивировании микроорганизмов-продуцентов, важную роль играет природа хитина, как основного источника питательных веществ и, одновременно, индуктора. Нами было отмечено, что при культивировании штаммов-продуцентов на хитиисо-держащем субстрате из различных видов грибов, а также на нативном хитине панцирей крабов, продуцируются относительно незначительные количества фермента. В ряде случаев грибной хитин являлся гораздо лучшим индуктором, чем нативный хитин краба. Немаловажное значение имела предобработка хи-тинсодержащего субстрата. Так, использование вместо плодовых тел хитин-глюканового комплекса, полученного из некоторых видов грибов, приводило к возрастанию секреции хитиназы штаммами Bacillus в 2-3 раза.
Коллоидный хитин, как источник углерода, наиболее приемлем для культивирования Bacillus sp. 739. Несмотря на то, что хитинсодержащий субстрат не образует истинных растворов в воде, тем не менее, его концентрация в питательной среде оказывает влияние на уровень накопления хитиназной активности (табл.8.3.1.).
Наибольшая секреция хитиназы культурой Bacillus sp. 739 наблюдалась при концентрациях субстрата 0,75%. В случае коллоидного хитина крабов, дальнейшее повышение концентрации приводило к резкому падению активности ферментов гидролазного комплекса. При использовании в качестве хитин-содержащего субстрата измельченных плодовых тел трутовика чешуйчатого повышение активности литических ферментов происходило до концентрации субстрата 1,0%, а затем также снижалось. Таким образом, на уровень накопления ферментов гидролитического комплекса влияет не только концентрация хитинсодержащего субстрата, но и его природа.
С целью подбора питательных сред, обеспечивающих максимальное накопление хитинолитической активности продуцентами Bacillus spp., нами были испытаны в качестве основного субстрата мицелий и плодовые тела грибов различных классов (табл. 8.3.2).
Как следует из представленных данных, использование мицелия Botrytis cinerea, Penicillium chrysogenum, Trichoderma viride и плодовых тел Armillariella mellea (опенок осенний) в качестве хитинсодержащего субстрата обеспечивает более высокий уровень накопления хитиназ, чем использование нативного или коллоидного хитина. В случае исользования частично очищенного хитинглю-канового комплекса из плодовых тел Armillariella mellea или Macrolepiota procera или из мицелия Polyporus squamosus уровень хитиназной активности повышался в 2 -3 раза по сравнению с нативным материалом.
Различная степень синтеза и секреции хитиназ бациллами при их культивировании на хитинсодержащих субстратах грибной природы, по-видимому, обусловлена количественным содержанием хитина в субстрате и его доступностью. Повышенная секреция бациллами хитиназ при использовании биомассы отмеченных выше грибов вместо чистого хитина в питательных средах связана, возможно, с тем, что в клеточных стенках этих грибов, присутствуют какие-то иные, неспецифические индукторы.
Мы исследовали влияние некоторых возможных индукторов или активаторов на уровень накопления фермента в культуральной среде с коллоидным хитином (табл.8.3.3.). Как следует из представленных данных, добавление глюкозы и N-ацетилглюкозамина, а также эмульгатора Твин-80 не способствовало увеличению синтеза хитиназы у Bacillus sp. 739. Положительное влияние на накопление хитиназной активности оказало добавление в среду высокомолекулярных углеводов - бета-глюкана, пектина, хитозана и крахмала.
Богатые и полусинтетические питательные среды для культивирования аэробных спорообразующих бактерий характеризуются, как правило, высоким содержанием ростовых факторов, которые, в свою очередь, служат и источниками органического азота (Методы общей бактериологии, 1984). Поэтому представляло интерес выяснить влияние природы и концентрации наиболее употребляемых ростовых факторов на процесс образования хитиназ бациллами. В качестве источников органического азота использовали кукурузный экстракт, пептон, дрожжевой автолизат и гидролизат казеина. Замена пептона на гидро-лизат казеина при концентрации 0,3% в среде с 0,5% коллоидного хитина практически не отразилась на синтезе хитиназы, тогда как замена на дрожжевой автолизат снизила уровень активности фермента в среде почти в 2 раза (табл. 8.3.4.).
Данные о влиянии концентрации ростовых факторов питательной среды на уровень накопления фермента представлены на рисунках 8.3.1 и 8.3.2. Превышение порога 0,2% концентрации пептона в среде (при наличии 0,1% кукурузного экстракта) приводило к падению синтеза хитиназы. Для кукурузного экстракта (при наличии 0,1% пептона) таким порогом являлась концентрация 0,1%, причем характерно было резкое падение хитиназ ной активности в куль-туральной жидкости при дальнейшем увеличении концентрации (рис. 8.3.2.). В кукурузном экстракте, вероятно, в большей степени представлены факторы роста, витамины и микроэлементы, нежели в пептоне. Природа активирующего компонента пока не выяснена, хотя, наиболее вероятным представляется здесь комплексный эффект нескольких соединений.
Таким образом, в результате проведенных исследований был подобран состав питательных сред, позволяющий в лабораторных условиях получать достаточное количество фермента для препаративных целей.
Для выяснения биологической роли хитиназы в процессе подавления грибов бациллами антагонистами предстояло выделить фермент из культураль-ной жидкости и очистить его до состояния, близкого к гомогенному.