Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Факторы вирулентности уропатогенных бактерий 10
1.2. Механизмы устойчивости возбудителей инфекций мочевыводящих путей к антимикробным препаратам 14
1.3. Роль микробных биопленок в развитии инфекций мочевыводящих путей 18
1.4. Клинические проявления инфекций мочевыводящих путей 21
2 Объект, материалы и методы 24
2.1. Экспериментальные модели 24
2.2. Методы микробиологических и молекулярно – генетических исследований 25
2.3. Методы статистической обработки экспериментальных данных 29
3 Характеристика условно-патогенных бактерий, выделенных от больных с признаками инфекций мочевыводящих путей 31
3.1. Видовой состав микроорганизмов, выделяемых при инфекциях мочевыводящих путей 31
3.2. Характеристика спектра чувствительности уропатогенных бактерий к антимикробным препаратам 36
3.3. Определение наличия БЛРС фенотипическим методом и выбор препаратов 40
4 Определение наличия детерминант вирулентности у клинических штаммов e. coli 45
4.1. Выявление генов устойчивости к антибиотикам 45
4.2. Определение гена fimH 50
5 Влияние наличия гена fimh на адгезивные свойства и пленкообразующую способность клинических штаммов e. COLI 52
5.1. Изучение адгезивной активности штаммов E. coli, отличающихся по наличию гена fimH 52
5.2. Динамика формирования микробных биопленок эталонным и клиническими штаммами E. coli 54
5.3. Исследования морфологических особенностей модели микробной биопленки E. coli на поверхности изделий медицинского назначения 57
Заключение 61
Выводы 67
Список использованной литературы
- Механизмы устойчивости возбудителей инфекций мочевыводящих путей к антимикробным препаратам
- Методы микробиологических и молекулярно – генетических исследований
- Характеристика спектра чувствительности уропатогенных бактерий к антимикробным препаратам
- Динамика формирования микробных биопленок эталонным и клиническими штаммами E. coli
Введение к работе
Актуальность исследования. Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) занимают второе место по распространенности среди заболеваний мочевыделительной системы человека (Takhar, Moran, 2014). Данные заболевания диагностируются у людей обоих полов разного возраста, хотя чаще встречаются у женщин (Manning et al., 2010). Ежегодно более 7 млн человек обращаются к специалистам с подозрениями на ИМП, более миллиона из них госпитализируют, а затраты на их лечение составляют примерно 3 млрд долларов (Naber et al., 2009).
Инфекции мочевыводящих путей чаще всего имеют бактериальную этиологию (Al-Badr, Al-Shaikh, 2013; Brooks et al., 2010). Ведущую роль в развитии ИМП играют представители семейства Enterobacteriaceae, а на долю Escherichia coli приходится почти 90% всех диагностированных случаев (Reza et al., 2011). Бактерии E. coli, поражающие мочевыделительную систему, получили название уропатогенных E. coli (UPEC). В процессе эволюции эти бактерии приобрели целый ряд факторов, включая адгезины, токсины, сидерофоры и полисахаридные структуры клеточной стенки, которые обеспечивают их адаптацию к существованию в данном биотопе, а именно поддерживают и усиливают прикрепление к клеткам уроэпителия, повышая их устойчивость к действию лекарственных препаратов, иммунологических защитных механизмов (Гриценко и др., 1998; Yamamoto et al., 2007; Farshad et al., 2010; Sokurenko et al., 2004; Thoureen et al., 2015).
Важным параметром, описывающим активность бактерий – возбудителей ИМП, является резистентность к антимикробным препаратам (Erb et al., 2007). Выработка патогенными бактериями, обитающими в мочевыводящей системе, резистентности к антимикробным препаратам – это проблема, с которой в последнее время все чаще сталкиваются во многих странах (CDER, 2015). Частично данное явление обусловлено обширным, чрезмерным, нецелевым или неправильным использованием антибиотиков (Johnson et al., 2006). Согласно исследованиям европейских ученых, количество зафиксированных случаев резистентности к антибиотикам возрастает от года к году, при этом в последнее время появились сведения о существенном увеличении числа патогенных бактерии, устойчивых к действию нескольких наиболее распространенных антибиотиков, использующихся для лечения ИМП (Barber et al., 2013).
Еще одной стратегией бактерий, позволяющей им выживать в условиях
макроорганизма, является их способность к формированию микробных
биопленок, что и играет ключевую роль в патогенезе ИМП (Jabalameli et al.,
2012). Биопленочные формы бактерий характеризуются сниженной
метаболической активностью и повышенной устойчивостью к действию
антимикробных препаратов. Микробные биопленки могут формироваться как
на поверхности клеток макроорганизма, так и на изделиях медицинского
назначения, обуславливая тем самым длительную персистенцию возбудителя и
развитие катетер–ассоциированных инфекций (Wilson et al., 2011;
Peter et al., 2012).
Степень разработанности проблемы. Ведущая роль в развитии ИМП принадлежит условно-патогенным бактериям семейства Enterobacteriaceae (Gradwohl et al., 2011; Mazzulli, 2012; Vasudevan, 2014; Edmonton, 2015; NICE, 2015).
В работах (Mladin et al., 2009; Ramirez, Tolmasky, 2010; Tada et al., 2013;
Saad et al., 2015; Praharaj et al., 2016) приведены данные о наличии в геноме
условно-патогенных бактерий генов, кодирующих устойчивость к
антимикробным препаратам.
Значение факторов адгезии грамотрицательных бактерий для реализации начальных этапов взаимодействия с макроорганизмом, обеспечивающих развитие инфекционного процесса, представлено в работах (Далин, Фиш, 1985; Маянский, 2006; Mladin et al., 2009; Oliveira et al., 2011; Tarchouna et al., 2013; Abass et al., 2014; Hojati et al., 2015).
В работах (Schroll et al., 2007; Wilson et al., 2011; Jabalameli et al., 2012; Peter et al., 2012; Scott et al., 2015) обоснована важная роль микробных биопленок в развитии инфекционных заболеваний, связанных с оказанием медицинской помощи при использовании изделий медицинского назначения.
Цель исследования – изучить адаптивные свойства уропатогенных Escherichia coli, выделенных от пациентов Багдадского учебного госпиталя.
Задачи исследования.
-
Изучить видовой состав возбудителей, выделенных от больных с признаками ИМП, определить преобладающие виды и провести анализ частоты встречаемости возбудителей заболеваний в зависимости от пола и возраста пациентов.
-
Определить спектр чувствительности клинических штаммов E. coli к антимикробным препаратам и наличие у них бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) фенотипическим методом.
-
Выявить корреляцию установленной фенотипическими методами устойчивости к бета-лактамным и аминоглизидным антибиотикам уропатогенных E. coli с наличием генетических детерминант: плазмидных генов ctx-m и aac(3)-II.
-
Изучить влияние наличия гена fimH на адгезивные свойства и пленкообразующую способность клинических штаммов E. coli.
-
Исследовать структурные особенности моделей микробных биопленок E. coli, сформированных на поверхности изделий медицинского назначения в условиях in vitro, штаммами, отличающимися по наличию гена fimH.
Научная новизна. Впервые показано, что наличие гена fimH обеспечивает
более эффективный процесс формирования микробных биопленок
клиническими штаммами E. coli в условиях in vitro на инертных поверхностях
лунок иммунологического планшета и фрагментах полиуретанового
уретрального катетера.
Установлено, что продукция БЛРС уропатогенными штаммами E. coli, выделенными от пациентов с признаками ИМП Багдадского учебного госпиталя, связана с наличием плазмидного гена ctx-m, что и обусловливает их полирезистентность к бета-лактамным антибиотикам.
Выявлено, что сочетанная устойчивость клинических штаммов E. coli к аминогликозидам II и III поколения связана с наличием плазмидного гена aac(3)-II, кодирующего фермент ацетилтрансферазу, субстратом для которого являются тобрамицин и гентамицин.
Теоретическая и практическая значимость работы. Обобщены и систематизированы данные о биологических особенностях уропатогенных E. coli – возбудителях ИМП бактериальной этиологии, механизмах их устойчивости к антимикробным препаратам, роли микробных биопленок в развитии ИМП. Полученные результаты являются основанием для выбора наиболее эффективных антибиотиков при лечении ИМП, вызванных полирезистентными штаммами уропатогенных E. coli, продуцирующих БЛРС и ацетилтрансферазу. Данные о повышенной способности уропатогенных E. coli, имеющих плазмидный ген fimH, к формированию биопленок на изделиях медицинского назначения являются основанием для разработки и проведения мероприятий по предотвращению катетер-ассоциированных инфекций при оказании высокотехнологичной медицинской помощи.
Методология диссертационного исследования. Диссертационная работа носит экспериментальный характер. Выбор методов настоящей работы соответствовал поставленным целям и задачам. При проведении исследования и изложении материала автором были применены такие общенаучные методы, как анализ литературных данных и обобщение, эмпирические методы исследования (измерение, эксперимент, метод сравнения, оценка и описание). Применение указанных методов и детальный статистический анализ полученных значений позволили обеспечить объективность и достоверность результатов и выводов.
Внедрение в практику. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры микробиологии, биотехнологии и химии ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова», кафедры микробиологии и физиологии растений ФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Клинические штаммы уропатогенных E. coli, выделенные от пациентов с признаками ИМП, находящихся на амбулаторном лечении в Багдадском учебном госпитале, характеризуются множественной лекарственной устойчивостью к антимикробным препаратам, применяемым для этиотропной терапии.
-
Устойчивость клинических штаммов уропатогенных E. coli к бета-лактамным и аминогликозидным антибиотикам связана с наличием у них гена ctx-m, кодирующего БЛРС, и гена aac(3)-II, кодирующего фермент ацетилтрансферазу.
-
Активное формирование микробных биопленок на поверхности изделий медицинского назначения клиническими штаммами уропатогенных E. coli связано с их высокой адгезивной способностью, обусловленной наличием гена fimH.
Степень достоверности и апробация работы. Высокая степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждается использованием как общепринятых, так и современных микробиологических и генетических методов исследований и статистической обработки информации. Исследования проведены с использованием аттестованных методик и поверенного оборудования.
Результаты диссертационного исследования представлены на следующих научных конференциях: II Международная научно-практическая конференция «Основные проблемы естественных и математических наук» (Волгоград, 2015 г.), VII Международная научная конференция молодых ученых «Представляем научные достижения миру. Естественные науки» (Саратов, 2016 г.), VIII Региональная научная конференция «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2016 г.), Международная научно-практическая конференция «Материалы и методы инновационных исследований и разработок» (Пенза, 2016 г.), Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии «ХIХ Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2016).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов, трех глав экспериментальных исследований, заключения и выводов, а также списка использованной литературы, который включает 350 источников, в том числе 337 иностранных авторов.
Механизмы устойчивости возбудителей инфекций мочевыводящих путей к антимикробным препаратам
Инфекционные заболевания мочевыводящих путей являются одной из наиболее распространенных причиной заболеваемости и смертности среди людей (Salvatore, Resmanargoff, 2015). Чаще всего инфицированию подвергаются уретра и мочевой пузырь (Al-Badr, Al-Shaikh, 2013; Doi et al., 2013). Представители семейства Enterobacteriaceae в целом, и E. coli в частности, являются наиболее частыми бактериальными агентами в патогенезе ИМП, они являются возбудителями в 65-75% неосложненных и осложненных случаев ИМП (Gupta, Hooton, 2011). Штаммы E. coli, поражающие мочеполовую систему человека (UPEC) обладают особыми факторами вирулентности, которые играют важную роль в патогенезе (Carattoli, 2009). Перенос детерминант антибиотикорезистентности к другим штаммам E. coli и другим родам бактерий, а также синтез ферментов, разрушающих антимикробные препараты, являются наиболее важными факторами вирулентности, проявляемыми штаммами UPEC (Mladin et al., 2009; Tsai et al., 2009).
Инфекции мочевых путей лечат антибактериальными терапевтическими препаратами (Bush, 2010). Антибиотики, такие как аминогликозиды, цефалоспорины, карбапенемы или фторхинолоны существенно сокращают период лечения и восстановления (ECDC, 2014). Устойчивость многих бактериальных уропатогенов к широкому спектру антибиотиков, активно используемых при лечении ИМП, является крайне актуальной проблемой в последние годы. Наиболее явной причиной данного явления является увеличение использования антибиотиков в медицине (Sidjabat, Paterson, 2015). aac(3)-II ген устойчивости к аминогликозидам Аминогликозиды являются группой традиционных антибактериальных терапевтических агентов широкого спектра действия (Yang, 2010). Они действуют путем ингибирования синтеза белка в бактериальной клетке, и показывают зависимую от концентрации бактерицидную активность в отношении большинства грамотрицательных аэробных и факультативн-анаэробных бактерий (Bothe, 2012). Гентамицин, амикацин, тобрамицин являются наиболее часто используемыми аминогликозидами в клинической практике (Schlecht, Bruno, 2015). Устойчивость к гентамицину и другим аминогликозидам обусловлена либо хромосомными мутациями, либо приобретением бактериями генов устойчивости, переносимых на мобильных генетических элементах (плазмиды, интегроны и транспозоны) (Moulds, Jeyasingham, 2010). Кроме того, было выявлено, что синтез аминогликозидмодифицирующих ферментов является наиболее часто встречающимся плазмидным механизмом возникновения антибиотикорезистентности (Tada et al., 2013). Эти ферменты включают аминогликозидацетил-трансферазы AAC, аминогликозидфосфорил-трансферазы APT и аминогликозиднуклеотидил-трансферазы ANT, которые выполняют роль кофакторов при модификации лекарственных препаратов в бактериальной клетке. В результате модифицированные аминогликозиды плохо связываются с рибосомами, что позволяет бактериям выживать в присутствии антибиотиков (Saad et al., 2015). AAC(3)-трансферазы относятся к N-ацетилтрансферазам, которые представлены девятью подклассами (I-IX), отличающимися друг от друга изоферментами и сайтами связывания с субстратом (Emanuele et al., 2009). Гены, кодирующие синтез AAC(3)-ферментов, являются преобладающими факторами, определяющими устойчивость к аминогликозидам в различных популяциях E. coli (включая UPEC) (Ramirez, Tolmasky, 2010). Показано, что эти гены имеют по меньшей мере пять аллелей от aac(3)-IIa до aac(3)-IIe (Ho et al., 2010).
В связи с вышеизложенным, идентификация генов устойчивости к антибиотикам группы аминогликозидов имеет крайне важное значение как непосредственно для лечения инфекций мочевыделительной системы, так и для создания генетической базы данных факторов патогенности (Erb et al., 2007).
Бета-лактамазы расширенного спектра действия Бета-лактамазы расширенного спектра действия относятся к ферментам, которые кодируются плазмидными или хромосомными генами (мутации в генах tem и shv) и могут разрушать бета-лактамные молекулы антибиотиков Rahn, 2008; Grabe et al., 2012. Бета-лактамазы расширенного спектра действия представляет собой один из основных механизмов формирования устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у грамотрицательных патогенов (наиболее часто у E. coli и Klebsiella spp.) Этот механизм возникает в результате широкого использования антибиотиков (Jain, Mondal, 2008). Существует много типов бета-лактамаз, которые различаются по своей способности к дезактивации определенного бета-лактама, по их уязвимости к действию ингибиторов бета-лактамаз и физическим характеристикам (молекулярная масса и изоэлектрическая точка) (Bush, 2010; Beytur et al., 2015). Они накапливаются в периплазматическом пространстве и атакуют бета-лактамные препараты, прежде чем они взаимодействуют со своими клеточными мишенями (Sharma et al., 2012). Показано, что БЛРС подразделяются на четыре основные группы: A, B, C, и D. Наиболее распространенными типами БЛРС являются TEM, SHV, CTX-M, AmpC и OXA-БЛРС (Yazdi et al., 2012; Kaye, Pogue, 2015).
CTX-M ферменты являются представителями класса A, кодируются плазмидными генами blactx-m и обнаруживаются, главным образом, в бактериях E. coli. Они не ассоциированы с TEM - или SHV-БЛРС и впервые были изолированы в Германии, Аргентине и Франции в 1989 году (Canton et al., 2008). В последние годы наблюдается распространение CTX-M ферментов во всем мире и в различных географических районах, в том числе в США, Африке, Европе и Азии. Эти ферменты обладают более высокой активностью в отношении цефотаксима по сравнению с другими цефалоспоринами (цефтазидим, цефтриаксон), с чем связано их название (CTX-M-БЛРС) (Canton et al., 2008; Doi et al., 2013; Tansarli et al., 2014; Sidjabat, Paterson, 2015). В исследованиях последних лет было показано, что в Европе ген ctx-m у бактерий UPEC стал преобладающим по сравнению с tem- и shv. Количество инфекций
Методы микробиологических и молекулярно – генетических исследований
В настоящее время ни один из используемых стандартных микробиологических методов не позволяет определить наличие у возбудителя БЛРС в 100% случаев. Кроме того, в клетке бактерий может находиться одновременно несколько детерминант резистентности к различным антимикробным препаратам. Использование молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет определять не только гены резистентности, но и классы ферментов, обеспечивающих устойчивость (Эйдельштейн, 2001).
Определение гена антибиотикорезистентности ctx-m проводили для клинических штаммов Е. coli, частота выделения которых от больных с ИМП была самой высокой и для которых предварительно фенотипическим методом были определены БЛРС. В качестве отрицательного контроля БЛРС использовали эталонный штамм Е. coli АТСС 25922. Результаты генотипической детекции гена устойчивости к антибиотикам ctx-m приведены на рисунке 4.1.1.
Было установлено, что ген ctx-m, кодирующий БЛРС, размер которого составлял 590 пар нуклеотидов, обнаруживался у 63,2 % клинических штаммов E. coli, для которых предварительно было установлено наличие данных ферментов фенотипическим методом (рис. 4.1.2). Тетрахорический коэффициент сопряженности составил 0,67 (при p 0,05). БЛРС - БЛРС + ctx-m + ctx-m Рисунок 4.1.2 - Результаты определения гена устойчивости у клинических штаммов E. coli
Так как ген ctx-m кодирует БЛРС, относящиеся к функциональной группе 2be молекулярного класса А, то для них характерна выраженная субстратная специфичность, которая проявляется в способности расщеплять цефалоспорины III–IV поколений наряду с ранними цефалоспоринами и пенициллинами (Bush et al., 1995). Полученные нами результаты согласуются с литературными данными, поскольку все клинические штаммы E. coli, продуцирующие БЛРС, характеризовались устойчивостью к представителям цефалоспоринов III поколения расширенного спектра, относящихся к оксиимино-b-лактамам-цефтазидиму, цефотаксиму и цефтриаксону. Кроме того, исследуемые штаммы E. coli были чувствительны к представителю карбапенемов-имипенему, а некоторые из них (26%) сохраняли чувствительность к цефокситину, принадлежащему ко II поколению цефалоспоринов и относящегося к подгруппе цефамицинов, что также согласуется с данными, приведенными в работе М.В. Эйдельштейна (2001). Аналогичные результаты получены ранее учеными из США (Doi et al., 2013), Бангладеша (Rashid et al., 2015), Ирана (Sharifi et al., 2015), Ливии (El-Garbulli et al., 2015) и Пакистана (Rahman et al., 2016). Высокая частота обнаружения и степени экспрессии гена устойчивости к бета-лактамным антибиотикам ctx-m, приведенная в том числе и в нашей работе, подтверждает тот факт, что в настоящее время преобладающим генотипом БЛСР среди UPEC в Европе стал тип ctx-m, вытеснивший типы tem и shv (ECDC, 2014).
Поскольку фенотипическими методами установлено наличие БЛРС у 57 клинических штаммов E. coli, то, вероятно, 36,8% штаммов, у которых не был выявлен ген ctx-m, продуцировали другие варианты этих ферментов, которых в настоящее время известно более 200, включая типы tem, shv, oxa и AmpC (Лагун, 2012; Kaye, Pogue, 2015; Salvatore, Resmanargoff, 2015).
Для лечения ИМП в клинической практике широко применяют антибиотики, относящиеся к группе аминогликозидов. В ходе проведенных нами исследований было установлено, что исследуемые клинические штаммы E. coli проявляли высокую чувствительность только к амикацину (100% случаев), к другому представителю III поколения аминогликозидов – тобрамицину – чувствительность была ниже и составила 71%, а к представителю II поколения-гентамицину – всего 44%. Поэтому представляло интерес исследовать наличие генетических детерминант, кодирующих устойчивость к аминогликозидам, с использованием ПЦР. В исследованиях использовали 23 клинических штамма E. coli, для которых была установлена устойчивость к тобрамицину и гентамицину. Поскольку одним из преобладающих механизмов развития устойчивости к аминогликозидам является их энзиматическая инактивация с помощью аминогликозидмодифицирующих ферментов, в исследованиях определяли ген aac(3)-II, который кодирует фермент ацетилтрансферазу, благодаря которому к антибиотику присоединяется молекула уксусной кислоты, в результате чего происходит потеря его активности (Решедько, 1999).
Характеристика спектра чувствительности уропатогенных бактерий к антимикробным препаратам
Инфекции мочевыводящих путей относятся к одним из наиболее распространенных и часто диагностируемых бактериальных инфекций и представляют серьезную проблему для современного здравоохранения (Agarwal et al., 2012). Возбудители ИМП поражают все возрастные группы населения обоих полов, как в условиях стационара, так и во внебольничной среде (Rashid et al., 2015; Salvatore, Resmanargoff, 2015).
В патогенезе ИМП важную роль играют множество видов бактерий, однако наиболее распространенными возбудителями являются представители семейства Enterobacteriaceae (Gupta et al., 2011). Согласно данным мировой литературы, наиболее частыми возбудителями ИМП являются штаммы E. coli, на долю которых приходится 50-75% всех диагностированных случаев заболеваний, а также Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Morganella spp., представители других семейств, среди которых с наибольшей частотой выделяются Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., S. aureus, Enterococcus spp. (Shaaban et al., 2012; Nor et al., 2015).
Для лечения ИМП в отсутствие каких-либо осложнений используют антибактериальные препараты, такие как цефалоспорины, пенициллины, аминогликозиды или хинолоны, которые эффективны как при кратковременном, так и долгосрочном применении (Zalamanovici et al., 2010; ECDC, 2014). Степень чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам различна и зависит от множества факторов, включая место их локализации, условия среды и стадию заболевания (ECDC, 2014). Однако все более распространенным явлением становится развитие устойчивости многих возбудителей ИМП к действию множества различных групп антимикробных препаратов, а в последние годы такая тенденция заметно усилилась, что обусловлено обширным, чрезмерным, нецелевым или необоснованным использованием антибиотиков широкого спектра действия (Paschke et al., 2010; Barber et al., 2013; Cosgrove et al., 2015). Поэтому устойчивость микроорганизмов к антимикробным препаратам является проблемой глобального масштаба, требующей незамедлительного вмешательства с целью нахождения путей ее решения.
Развитию антибиотикорезистентности среди возбудителей ИМП, включая E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp. и Pseudomonas spp., способствовало возникновение защитных механизмов, обуславливающих селективные преимущества, среди которых наибольшее значение имеет продукция возбудителями БЛРС (Sharifi et al., 2015; Upadhyay et al., 2015). Образование этих ферментов детерминировано плазмидными генами, что и обеспечивает быстрый горизонтальных перенос данного признака и увеличение числа резистентных штаммов.
Настоящая работа представляет собой попытку изучения спектра основных возбудителей ИМП, циркулирующих на территории города Багдад (Ирак) и их особенностей по сравнению с данными, представленными в мировой литературе.
Оценка микробного пейзажа возбудителей ИМП позволила установить, что из 200 идентифицированных штаммов в 92,5% случаев выделялись возбудители, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, среди которых ведущая роль в патогенезе принадлежала штаммам E. coli. Частота встречаемости возбудителей других систематических групп была низкой, поскольку Pseudomonas spp. выделялась из 6%, а Acinetobacter baumannii – всего из 1,5% образцов.
Для удобства оценки зависимости проявления ИМП все пациенты были разделены на шесть возрастных групп. Было установлено, что наиболее часто данные заболевания регистрировались у лиц в возрасте от 17 до 46 лет с преобладанием в возрастной группе 27-36 лет.
Анализ проявления ИМП в зависимости от пола пациентов показал, что частота встречаемости этих заболеваний была выше у женщин, что обусловлено особенностями анатомического строения их мочевыделительной системы, а также особенностями гормонального статуса в связи с использованием контрацептивов. Однако у пациентов в возрасте 57-66 лет случаи ИМП у мужчин регистрировались в 2 раза чаще, чем у женщин, что, вероятно, связано с возрастными изменениями предстательной железы и функционального состояния мочевыделительной системы.
Оценка спектра чувствительности выделенных штаммов условно-патогенных бактерий показала, что большинство из них характеризовались устойчивостью к большинству используемых для лечения ИМП антимикробных препаратов различных групп, включая цефалоспорины III поколения, аминогликозиды, нитрофураны и фторхинолоны. Из всех исследуемых антибиотиков наибольшая активность была отмечена для IPM и AK, к которым были чувствительны все выделенные штаммы бактерий и, следовательно, они могут рассматриваться в качестве препаратов выбора для эффективной этиотропной терапии ИМП.
Устойчивость большинства клинических штаммов E. coli к цефтазидиму позволила предположить нам их способность к продукции БЛРС. С использованием фенотипического метода «двойных дисков» данное свойство было изучено у 111 штаммов E. coli. Полученные результаты позволили установить, что из 61 штамма E. coli, проявивших устойчивость к цефтазидиму, способность продуцировать БЛРС установлена у 57 штаммов.
Успех лечения ИМП у пациентов, от которых выделены штаммы возбудителей с множественной лекарственной устойчивостью, зависит от правильного выбора препарата с учетом антибиотикограммы возбудителя. Оценивая чувствительность штаммов E. coli, продуцирующих БЛРС, к антимикробным препаратам, установлено отсутствие активности в их отношении цефалоспоринов II и III поколения, а также показана низкая активность ко-тримоксазола, препаратов хинолонового и пенициллинового ряда и гентамицина. Все исследованные штаммы E. coli характеризовались высокой чувствительностью к имипенему и амикацину, а также в отношении большинства из них проявили активность нитрофурантоин и тобрамицин.
Динамика формирования микробных биопленок эталонным и клиническими штаммами E. coli
Данные о существовании штаммов UPEC, осуществляющих экспрессию гена fimH, обеспечивающих формирование микробных биопленок, приведены в работах (Bahalo et al., 2013; Reisner et al., 2014; Fattahi et al., 2015). Одними из наиболее важных факторов вирулентности, способствующих как прикреплению к клеткам организма хозяина, так и формированию бактериальных биопленок являются фимбрии (типа I и P) (Oliveira et al., 2011). Образование микробных биопленок играет ключевую роль в патогенезе ИМП (Robino et al., 2013). Уропатогенные бактерии E. coli связываются с клетками мочевого пузыря через адгезин fimH, после чего UPEC встраиваются в структуру клетки посредством эндоцитоза, что вызывает серию сигнальных эффектов, которые в конечном итоге проводят к интернализации бактерий и образованию биопленки (Eto et al., 2007; Garofalo et al., 2007; Robino et al., 2014).
Пленочные формы бактерий зачастую становятся устойчивыми к действию антибиотиков, к которым они были чувствительны в виде свободно живущих форм. Одним из возможных объяснений данного явления служит образование достаточно инертного метаболического состояния бактерий внутри биопленки, что приводит к уменьшению их чувствительности к антибиотикам, большинство из которых лучше действуют на активно делящиеся клетки (Fattahi et al., 2015). Другим возможным объяснением является предположение, что антибиотики, характеризующиеся бактериостатическим действием, только замедляют рост бактерий, а не убивают их, а их уничтожение осуществляется благодаря фагоцитозу. Большие размеры биопленок фактически не позволяют фагоцитам эффективно поглощать данные бактерии (Scott et al., 2015).
Таким образом, в ходе проведенных исследований методом спектрофотометрии было установлено, что как эталонные, так и клинические штаммы E. coli способны формировать микробные биопленки в условиях in vitro, однако большая интенсивность пленкообразования характерна для клинического штамма E. coli № 92, несущего ген fimH, который кодирует факторы адгезии – пили I типа.
Поскольку процесс неспецифической адгезии микроорганизмов и начальные этапы формирования микробных биопленок in vitro происходят в первые сутки культивирования, представляло интерес оценить интенсивность пленкообразования клинических штаммов E. coli, отличающихся по наличию гена fimH. Процесс формирования микробных биопленок моделировали на поверхности изделий медицинского назначения, в качестве которых использовали уретральный полиуретановый катетер. Небольшие фрагменты катетера помещали в пробирки с мясо-пептонным бульоном, содержащим суточные культуры исследуемых микроорганизмов в концентрации 2105 мк/мл. После экспозиции в течение 24 ч при 37С полученные образцы инактивировали в 96%-ом этаноле и готовили препараты для электронно-микроскопического исследования.
Оценка особенностей пленкообразования клиническим штаммом E. coli № 7, у которого отсутствовал ген fimH, позволила установить, что через 24 ч культивирования на поверхности фрагментов уретрального катетера происходил процесс адгезии бактерий: отмечались изолированные скопления микробных клеток, расположенные в один или два слоя, объединенные экзополимерным матриксом, количество которого было незначительным (рис. 5.3.1, А).
При формировании биопленки клиническим штаммом E. coli № 92, несущего ген fimH, через сутки культивирования вся поверхность образца была покрыта многослойной микробной биопленкой, клетки в которой были либо непосредственно связаны между собой, либо их контакт осуществлялся через компоненты экзополимерного матрикса (рис. 5.3.1, Б). Одни участки биопленки имели ровную поверхность благодаря микробным клеткам, лишенным матрикса, другие клетки были связаны с экзополимерным матриксом, благодаря чему их поверхность имела неструктурированный вид. Вся поверхность биопленки была пронизана многочисленными каналами.
Активный процесс формирования микробных биопленок на изделиях медицинского назначения связан с отсутствием специфических защитных противоинфекционных механизмов на инертных поверхностях искусственных материалов катетеров, дренажей, протезов и др. Это и объясняет формирование бактерионосительства при проведении медицинских манипуляций, а также хронизации инфекционного процесса. А
Данная работа и имеющиеся литературные данные позволяют предположить наличие корреляции между экспрессией генов вирулентности и процессом образования биопленок, тем самым подчеркивая важность адгезина fimH для начала и расширения образования биопленок бактерий, вызывающих ИМП, и увеличения устойчивости к антибиотикам и дальнейшему развитию инфекций (Hancock et al., 2010). Также очевидно, что биопленки бактерий более