Наноструктурированные зонды для сканирующей силовой микроскопии: создание, исследование, применение Жуков Михаил Валерьевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Литературный обзор 12

1.1. Нановискерные структуры и методы их роста 12

1.2. Специализированные зонды в сканирующей зондовой микроскопии 17

1.3. Метрологическая обеспеченность СЗМ измерений 20

Глава 2. Технология изготовления наноструктурированных зондов 30

2.1. Зонды с металлуглеродными Pt/C нановискерами, нановискерами c Ni/Co магнитным покрытием и углеродными нанопластинами 30

2.2. Зонды на основе гидроксиапатита кальция 36

2.3. Зонды-пипетки с наносферами 40

2.4. Выводы по главе 2 44

Глава 3. Тестирование наноструктурированных зондов 45

3.1. Тестирование зондов с металлуглеродными нановискерами в воздушной и жидкой средах 45

3.2. Зонды c углеродными наноскальпелями: литография, надрезание мембран клеток и манипулирование объектами 53

3.3. Тестирование нановискеров и нанопластин на механическую устойчивость59

3.3.1. Измерение модуля Юнга углеродных нановискеров 59

3.3.2. Расчет критической силы и тестирование нановискеров и нанопластин на механическую устойчивость 64

3.4. Зонды c магнитными нановискерами 68

3.4.1. Моделирование поведения магнитных зондов в магнитном поле доменных структур 68

3.4.2. Визуализация карт магнитных полей на доменных структурах 71

3.5. Тестирование зондов с гидроксиапатитом 75

3.6. Тестирование зондов-пипеток с наносферами: совмещение методов сканирующей силовой микроскопии и сканирующей микроскопии ионной проводимости 79

3.7. Выводы по главе 3 86

Глава 4. Применение наноструктурированных зондов 88

4.1. Использование наноструктурированных зондов в области биологии 88

4.1.1. Изучение нативных и высушенных клеточных структур в различных средах зондами с нановискерами 88

4.1.2. Надрезание мембран клеток с помощью наноскальпелей 96

4.1.3. Изучение аортального стеноза клапана сердца с использованием зондов с гидроксиапатитом 98

4.1.4. Изучение клеток CHO с помощью зондов с нановискерами и зондов-пипеток 103

4.2. Использование наноструктурированных зондов в области наноэлектроники 105

4.3. Использование зондов с нановискерами для устранения артефакта инверсии изображения в сканирующей силовой микроскопии 108

4.4. Выводы по главе 4 116

Заключение 118

Список литературы 119

Приложение А. Перечень профильных предприятий и академических институтов, с которыми осуществлялось сотрудничество 142

Приложение Б. Акт о внедрении 143

• Метрологическая обеспеченность СЗМ измерений
• Тестирование зондов с металлуглеродными нановискерами в воздушной и жидкой средах
• Тестирование зондов-пипеток с наносферами: совмещение методов сканирующей силовой микроскопии и сканирующей микроскопии ионной проводимости
• Использование зондов с нановискерами для устранения артефакта инверсии изображения в сканирующей силовой микроскопии

Введение к работе

Актуальность темы

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) успешно применяется как метод изучения микро- и наноразмерных объектов как в научных исследованиях, так и в наноиндустрии. В основе СЗМ метода лежит детектирование разнообразных сигналов, возникающих в результате прецизионного взаимодействия сверхострого твердотельного зонда с объектом исследования. В зависимости от природы взаимодействия и вида детектируемого сигнала различают: сканирующую туннельную микроскопию (СТМ), сканирующую силовую микроскопию (ССМ), сканирующую ближнепольную оптическую микроскопию (СБОМ), сканирующую микроскопию ионной проводимости (СМИП), и т.п. При этом наибольшее распространение получил метод ССМ благодаря возможности проводить измерения практически в любых средах и на любых объектах. В основе ССМ лежит детектирование локальной силы между зондом и образцом, при этом вклад в силовое взаимодействие могут вносить упругие силы, вызванные механической деформацией, силами Ван-дер-Ваальса, трения, адгезии, капиллярными и электромагнитными силами.

Сканирующая силовая микроскопия является относительно новым методом нанодиагностики материалов, активно развивающимся последние (20-30) лет, поэтому в настоящий момент задачи улучшения однозначности, достоверности и воспроизводимости получаемых с помощью ССМ данных являются актуальными. К числу основных проблем, существующих в области ССМ, можно отнести повышение точности измерений в нанометровом диапазоне, расширение функциональных возможностей путем создания новых типов зондов, а также устранение различных артефактов, присущих данному методу.

Получаемое ССМ изображение представляет собой конволюцию (свертку) геометрических параметров зонда и поверхности, поэтому правильный подбор и учет параметров зондов может решающим образом повлиять на точность измерений и интерпретацию полученных данных.

Варьируя геометрию и материал зондов, можно значительно улучшить разрешение и контраст получаемых ССМ изображений, а также реализовать разнообразные функции, такие как: локальная модификация поверхности (литография), манипулирование микро- и наночастицами, измерение сил адгезии, шероховатости, электрических и магнитных полей, и т.п. Поэтому в последнее время актуальным является создание новых типов специализированных зондов для ССМ, при этом особое внимание уделяется зондам с наноструктурированной поверхностью.

Актуальность создания наноструктурированных зондов обусловлена также наличием конкретных задач в области медицины, наноэлектроники, электрохимии, цитологии, наноматериаловедения и т.п., которые могут быть решены с привлечением метода ССМ.

Цель работы: создание, исследование и апробация наноструктурированных зондов для повышения пространственного разрешения и контраста, расширения функциональных возможностей и достоверности метода сканирующей силовой микроскопии.

Основные задачи работы:

1. Отработка технологии изготовления наноструктурированных зондов: зондов-нановискеров, включая нановискеры с магнитным покрытием, зондов-наноскальпелей, зондов-нанопипеток со сферами и зондов-кластеров с гидроксиапатитом;

2. Расчёт механической прочности и измерение модуля Юнга углеродных нановискеров, формируемых на поверхности зондов. Моделирование силового взаимодействия зондов-нановискеров с магнитным покрытием с магнитными доменами, апробация магнитных зондов-нановискеров на тестовых образцах;

3. Апробация наноструктурированных зондов в воздушной и жидкой средах при исследовании объектов различной природы;

4. Сравнение результатов, полученных с помощью наноструктурированных зондов с результатами, полученными с помощью стандартных зондов, исследование артефактов изображений.

Методы исследования:

Для решения поставленных задач применялись следующие методы: анализ литературных источников, математическое моделирование при помощи программного продукта COMSOL Multiphysics, различные технологические и диагностические методы, статистическая обработка экспериментальных результатов.

Основными технологическими методами были: метод фокусированного электронного пучка (ФЭП), электронно-лучевая литография, травление сфокусированным ионным пучком, осаждение металлических пленок (Au, Cu, Ni) методом электронно-лучевого и магнетронного напыления; химическое и электрохимическое травление, термическое вытягивание макро- и нанопипеток, центрифугирование биологических проб; фиксация биологических объектов с использованием гелеобразующих веществ.

Основными диагностическими методами были: оптическая микроскопия,

конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ), сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), электронная дифракция, сканирующая силовая микроскопия (ССМ); сканирующая микроскопия ионной проводимости (СМИП).

Научная новизна:

4. Впервые обнаружен и объяснен эффект самоорганизованного распада углеродной пластины, образующейся под воздействием фокусированного электронного пучка на вершине W иглы, на наноструктуру (нановилку) в виде параллельно расположенных одиночных вискеров.

5. Впервые создан и апробирован зонд-кластер с гидроксиапатитом, представляющий интерес для исследований причин возникновения аортального стеноза.

6. Впервые выполнено надрезание клеточных мембран и манипулирование нанообъектами с помощью зондов-наноскальпелей с последующей ССМ-визуализацией результатов локального воздействия с использованием того же зонда.

4. Впервые экспериментально продемонстрировано, что использование зондов с
нановискерами устраняет инверсию ССМ-изображений наноканалов и нанопор на
гидрофильной поверхности, имеющую место при использований стандартных кремниевых
кантилеверов.

5. Впервые созданы и протестированы зонды-нановискеры с магнитным покрытием, показано улучшение контраста и пространственного разрешения при исследовании магнитных структур с помощью таких зондов.

6. Впервые предложена технология совмещения ССМ и СМИП с использованием зондов-пипеток с калиброванными наносферами, позволяющими повысить стабильность в силовом режиме измерений.

Достоверность научных результатов обеспечивается корректностью постановки
задач исследования, воспроизводимостью результатов измерений, проведением

математического моделирования, статистической обработкой полученных данных, соответствием теоретических и экспериментальных данных, включая исследование тестовых структур с заданными характеристиками и различных объектов органической и неорганической природы. Результаты диссертации представлены на международных и всероссийских конференциях, форумах, ассамблеях и научных школах, а также опубликованы в журналах и иных публикациях, входящих в базы цитирования ВАК, РИНЦ, Scopus и WoS.

Практическая значимость: 1. Расширена номенклатура зондов, используемых в сканирующей зондовой микроскопии при исследовании объектов различной природы.

2. Зонд-пипетка с наносферой расширяет возможности метода СМИП, позволяя совместить его с методом ССМ.

3. Зонд-кластер с гидроксиапатитом открывает возможность применения ССМ в медицине при исследовании аортального стеноза.

4. Технология создания зондов-нановискеров может быть использована для восстановления ухудшившегося в процессе эксплуатации пространственного разрешения стандартных кремниевых кантилеверов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Модификация вершин Si кантилеверов платиноуглеродными нановискерами
повышает качество силовых изображений по сравнению с изображениями, получаемыми
стандартными зондами:

- не менее, чем в 2 раза увеличивается точность определения координат резких
перепадов рельефа на поверхности исследуемых образцов;

устраняется инверсия изображения нанопор и наноканалов и повышается контраст при визуализации гидрофильных поверхностей за счёт проникновения зондов сквозь адсорбированный слой воды;

не менее, чем в 1,5 раза увеличивается фазовый контраст в режиме магнитной силовой микроскопии при использовании Со покрытий толщиной 50 нм;

5. Модификация вершин Si кантилеверов углеродными нанопластинами позволяет проводить устойчивую силовую литографию с разрешением 50 нм, локальный надрез мембран клеток при постоянной силе воздействия в диапазоне (0,5-7,5) мкН и устойчивое манипулирование наночастицами с размерами менее 300 нм на поверхности подложки.

6. Локализация микрогранулы гидроксиапатита с характерным размером 600 нм на вершине зонда позволяет провести измерение сил адгезии гидроксиапатита к субэндотелиальным и эндотелиальным областям сердечного клапана, что открывает новые экспериментальные возможности для изучения природы аортального стеноза.

7. Объединение зонда в виде нанопипетки с пьезорезонансным датчиком силового взаимодействия обеспечивает совмещение режимов силовой микроскопии и микроскопии токов ионной проводимости. При этом локализация коллоидной наносферы диаметром ~200 нм на вершине нанопипетки с диаметром апертуры ~175 нм улучшает устойчивость и воспроизводимость силовых изображений.

Реализация работы:

Результаты диссертации использовалась при выполнении государственных контрактов в рамках Государственной финансовой поддержки ведущих университетов Российской Федерации (субсидия 074-U01), РФФИ (14-02-31703, 16-32-00806), НИОКР, финансируемые в рамках подготовки магистрантов и аспирантов из централизованных средств Университета ИТМО (№ 615893, 414643), конкурса премии грантов Правительства Санкт-Петербурга 2015 и 2016 гг., а также программы У.М.Н.И.К. (№11698р/17266, № 3132ГУ2/2014).

Апробация работы:

Основные результаты исследований и разработок, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на следующих конференциях, форумах, ассамблеях и школах: 2nd/3rd/4th International School and Conference "Saint-Petersburg OPEN 2015/2016/2017", март-апрель 2015-2017 гг.; 2nd/3rd International Theoretical and Practical Conference «Sensorica-2014/2015», октябрь-ноябрь 2014-2015 гг.; V International Scientific conference STRANN, апрель 2016 г.; International conference Physica.SPb/2016, 1-3 ноября 2016 г.; VIII/IX/X Всероссийский форум студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах», октябрь 2014-2016 гг.; XLIV/XLV/XLVI научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО, февраль 2015-2017 гг.; IV Всероссийский конгресс молодых ученых, 7-10 апреля 2015 г.; Международный научный форум молодых ученых «Наука будущего – наука молодых», сентябрь-октябрь 2015 г. (Россия, г.

Севастополь); 18 молодёжная школа «Микро- и нанотехника нового поколения», ноябрь

2015 г.; III Всероссийская научная молодежная конференция «Актуальные проблемы нано- и
микроэлектроники», декабрь 2015 г. (Россия, г. Уфа); Междисциплинарная научная
конференция "Биология и фундаментальная медицина в Санкт-Петербурге", апрель 2016 г.;
18 всероссийская конференция «Физика полупроводников и наноструктур,
полупроводниковая опто- и наноэлектроника», 28 ноября – 2 декабря 2016 г.; участие в
финале ВИК.Нано (Всероссийский инженерный конкурс по нанотехнологиям), 9-15 ноября

2016 г. (Россия, г. Москва); 24-ая/25-ая Международная летняя школа Jyvskyl Summer
School (Финляндия, г. Ювяскюля), август 2014-2015 гг.

Личный вклад автора:

Личный вклад автора заключался в анализе литературных источников по теме диссертации, проведении всех CСМ и СМИП экспериментов, результаты которых приведены в данной работе, большей части экспериментов в СЭМ и оптических измерений. Автор является основным разработчиком всех приведенных типов наноструктурированных зондов, провёл измерение модуля Юнга нановискерных структур статическим методом, активно участвовал в обсуждении и анализе полученных результатов, а также в подготовке и написании статей, тезисов, выступал на конференциях.

Публикации:

Основные результаты диссертации изложены в 34 печатных работах, включая 12 статей в рецензируемых журналах, из которых 9 статей входят в перечень Web of Science и/или Scopus, 3 статьи входят в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы из 168 наименований. Текст диссертации изложен на 143 страницах, содержит 78 рисунков и 6 таблиц.

Метрологическая обеспеченность СЗМ измерений

Нанометрология представляет собой дисциплину, занимающуюся измерениями, методами и средствами их обеспечения единствами и способами достижения требуемой точности в нанометровой области. Основный целью нанометрологий линейных величин можно считать обеспечение наношкалы в нанометровом и прилегающем к нему диапазонах. Из этого можно выделить следующие задачи:

1. Реализация единства измерений геометрических параметров изучаемого нанообъекта, базирующиеся на метрологии линейных измерений.

2. Обеспечение точного позиционирования зонда измерительного устройства в необходимое место с эталонной точностью для измерения его свойств (топологии, силы взаимодействия, электромагнитных сил и т.п.) [60, 61].

Метрологическое обеспечение в наноиндустрии регламентируется единством измерений, которое определяется Конституцией Российской Федерации, Законом «Об обеспечении единства измерений» и нормативными документами (ГОСТы, Правила, Рекомендации и др.) [62-65].

Головной организацией метрологического обеспечения нанотехнологии и наноиндустрии в России является Государственная метрологическая служба, функции которой переданы Федеральному агентству по техническому регулированию и метрологии (Ростехрегулирование) и на подвластные этому агентству организации.

Нормативной базой в области нанометрологии и наноиндустрии считаются Государственная система стандартизации (ГСС) и государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ), ответственные за разработку государственных стандартов, правила и положения метрологического обеспечения, параметры государственных эталонов и государственных поверочных схем, разработку методов и средств поверки, и т.п.

Федеральным законом № 139-ФЗ от 19.07.2007 г. создана Государственная корпорация «Российская корпорация нанотехнологий» (РОСНАНОТЕХ) для реализации государственной политики в сфере нанотехнологий и наноиндустрии. Кроме того, для обеспечения нанометрологии в РФ создан Технический комитет по стандартизации «Нанотехнологии» (ТК 441), который является объединением заинтересованных предприятий и организаций, созданным на добровольной основе в соответствии с Приказами Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 09 ноября 2009 г. № 4001, от 13 апреля 2010 г. № 1223. ТК создан на базе ОАО «РОСНАНО»: которая осуществляет финансирование, а также материальное и организационное обеспечение его работы [61, 66, 67].

Стоит отметить, что первые зачатки возникновения нанометрологии появились уже на первых этапах зарождения нанотехнологии, которые можно связать, прежде всего, с разработкой немецких учёных М. Кнолла и Э. Руска, получившей впоследствии название сканирующего (растрового) электронного микроскопа (СЭМ, РЭМ) в 1931 году. Тем не менее, настоящий прорыв произошел в 1982 г., когда Г. Бинниг и Г. Рорер сконструировали прибор совершенно нового типа, посредством которого стало возможным изучение и манипулирование отдельными атомами на поверхности. Впоследствии был разработан атомно-силовой микроскоп, позволяющий исследовать свойства непроводящих образцов в различных средах, включая газ и жидкость. Спустя несколько лет был разработан ближнепольный сканирующий микроскоп, сочетающий оптический и механический каналы взаимодействия зонда с образцом, а также ряд под-методик СЗМ [68, 69].

Как известно, сканирующая зондовая микроскопия успешно применяется как метрологический метод по изучению микро- и наноразмерных объектов. Тем не менее, применение СЗМ сопровождается рядом трудностей, связанных с получением однозначных, достоверных и воспроизводимых данных об объекте исследования. К основным проблемам, решаемым в области нанометрологии линейных расстояний в сканирующей зондовой микроскопии, можно следующие аспекты:

- Повышение точности измерений и расширение возможностей ССМ путем развития конструкции и материалов зондов,

- Точное определение и контроль параметров зондовых датчиков, в том числе при их взаимодействии с поверхностью,

- Недостатки систем сканирования (шумы электроники, нелинейность и гистерезис пьезокерамики, крип, внешние воздействия и т.п.).

- Наличие различных артефактов при формировании изображений исследуемых объектов.

При обеспечении контроля параметров зондов широко используются методы численного моделирования свёртки поверхности и зонда, использование специальных калибровочных решёток, использование иных методов микроскопии для контроля геометрии зондов, таких как сканирующая электронная микроскопия, методы оптической микроскопии и т.п. [60, 70].

Недостатки систем сканирования решаются путём совершенствования технической части параметров микроскопов при проведении экспериментов. Для решения данных аспектов широко применяется обеспечение защиты экспериментов от внешних воздействий, для чего используются системы по активной и пассивной виброизоляции, совершенствование и улучшение параметров пьезокерамики в системе сканирования, создание новых типов сканеров, калибровочных и тестовых структур, и т.п.

Артефакты ССМ изображений связаны с физическими процессами особенностей взаимодействия зонда и поверхности объекта, поэтому для решения данных вопросов применяются методы моделирования различных взаимодействий зонда с поверхностью, включающие силы Ван-дер-Ваальса, электростатические, магнитные, оптические, акустические взаимодействия, неупругий и упругий каналы туннелирования электронов, изучение капиллярных сил взаимодействий зонд-конденсат-образец, особенности отображения мягких объектов, объектов со сложной топологией структуры и т.д. [70, 71].

Рассмотрим более подробно возможные причины искажения изображения и меры по предварительной настройке (калибровке) оборудования для предотвращения возможных артефактов изображения.

Пьезокерамика широко используется в СЗМ в качестве сканера благодаря высокой точности перемещений, однако она обладает рядом недостатков, таких как нелинейность, гистерезис и ползучесть (крип).

- Нелинейность пьезокерамики

Нелинейность пьезокерамики заключается в нелинейной зависимости деформаций пьезокерамики l от приложенного управляющего напряжения U, что искажает результат исследования (рисунок 1.4). Для устранения данного эффекта следует работать в линейном диапазоне пьезокерамики или компенсировать нелинейности с помощью средств программирования [72, 73].

Гистерезис пьезокерамики предоставляет собой неоднозначность зависимости удлинения сканера l от направления изменения приложенного управляющего напряжения U. На рисунке 1.5, а, представлен гистерезис пьезокерамики, в результате которого при одних и тех же напряжениях U удлинение сканера варьируется в зависимости от направления движения. Для устранения гистрезиса необходимо работать только на одной из кривых [87].

Ползучесть - запаздывание удлинения пьезокерамики l на изменение величины управляющего напряжения U, в результате чего изображение начинает смещаться. Часто крип проявляется на начальных этапах сканирования, для его устранения необходимо преждевременно «прогреть» пьезокерамику (быстрое сканирование для снятия остаточных потенциалов) или вводить временные задержки для компенсации запаздывания [72, 73].

- Влияние геометрии зондов и эффект свёртки изображения

Полеченное в СЗМ изображение поверхности всегда представляет собой свёртку геометрии зонда и образца, т.е. геометрия зонда как бы накладывается на топологию исследуемого объекта. При исследовании объектов сложной топологией структуры форма зондового датчика имеет решающее значение.

Так, на рисунок 1.6 показана визуализация области резких перепадов высот зондами с разным профилем. Чем острей зонд, тем более достоверное изображение можно получить на выходе, поэтому для исследования глубоких каналов или резких ступенек рекомендуется использование высокоаспектных зондов (рисунок 1.6, в) [72, 74].

Тестирование зондов с металлуглеродными нановискерами в воздушной и жидкой средах

Тестовым объектом для изучения особенностей проведения измерений методом АСМ в воздушной и жидких средах служила калибровочная решетка TGQ01 (НТ-МДТ, Россия), представляющая собой упорядоченный массив квадратных ячеек с размером одной стороны 1,5±0,35 мкм фиксированной высоты 20±1,5 нм и периода 3±0,05 нм [97]. Номер меры TGQ01 в государственном реестре 41680-09 [98], Исследования на воздухе проводились при использовании зондов NSG01 (NT-MDT, Россия). Характерная длина НВ лежала в диапазоне 700-900 нм. Тестирование зондов с НВ и НС осуществлялось на СЗМ Ntegra Aura (NT-MDT, Россия) в полуконтактной, контактной и МСМ модах.

Тестирование зондов с НВ в жидкости проводились при использовании кремний-нитридных зондов SNL-10 (Bruker, США). Характерная длина НВ лежала в диапазоне 300-500 нм для повышения устойчивости зондов при наличии микротечений в жидкости. Лучшие результаты были обнаружены на кантилеверах с малой жесткостью (0,06–0,12 Н/м). При работе в жидких средах была использована жидкостная ячейка и держатель зонда c призмой.

Тестирование зондов с НВ проходило в полуконтактной силовой моде для сохранения устойчивости зондов с НВ, а также для уменьшения разрушающего воздействия зонда на образец. При исследовании решётки TGQ01 было проведено не менее 100 измерений структуры в различных областях образца для каждой среды. Выявлено, что уширение ступеньки на одной из ячеек составляет в среднем в 2 раза меньшие значения при использовании зондов с НВ (Рисунок 3.1). Так, на сечении одной ячейки можно увидеть уширение ступеньки, составляющее для стандартного зонда значение около 162±5 нм, тогда как для зонда с НВ значения составили около 79±3 нм.

Улучшение отображения областей вертикальных стенок говорит об улучшении пространственного (латерального) разрешения ССМ. Улучшение разрешения связано с высоким аспектным отношением зондов с НВ, что позволяет более точно описывать геометрию объектов за счет более локального контакта зонда с образцом, а также повысить проникающую способность зондов относительно узких наноканалов и нанопор на поверхности образцов.

Для изучения проникающей способности зондов с НВ были измерены наноразмерные каналы фиксированной глубины 100 нм и ширины 200 нм, сформированные в электронном резисте ПММА, нанесенном на подложку чистого кремния (рисунок 3.2). Выявлено, что зонд с НВ проникает на всю глубину канала до 98±4 нм, тогда как стандартный зонд проникает только до 39±5 нм, что связано с контактом стенок стандартного зонда, имеющего форму пирамиды, со стенками канала. Улучшение проникающей способности зондов с НВ говорит об увеличении диапазона отображения высот измеряемых объектов, а, следовательно, и контраста получаемых ССМ изображений [82].

В качестве жидких сред были выбраны часто используемые при проведении медицинских исследований буферные растворы с разной кислотностью: PBS -натрий-фосфатный буфер (7,4 pH, плотность 0,995 г/см3), NaOH 0,1M (12,9 pH, плотность 1,109 г/см3), NaOH 0,5M (13,7 pH, плотность 1,525 г/см3).

Лучшие результаты по качеству отображения калибровочной решётки TGQ01 выявлены при использовании специализированных зондов с НВ в PBS буфере (рисунок 3.3, а, г). Замечено общее снижение уширения ступенек при использовании зондов с НВ и увеличение значений шероховатости поверхности (увеличение диапазона отображения высот), что говорит о лучшем разрешении и контрасте изображения (таблица 3.2, рисунок 3.4, а, г). Однако в некоторых случаях были замечены колебания на границе ступеньки в верхней области ячейки, что может быть обусловлено двойным касанием НВ о стенки ячейки из-за отклонения НВ от ортогональной ориентации относительно образца при сканировании [99].

Изображения, измеренные в растворах натриевых гидроксидов (NaOH 0,1М; NaOH 0,5М), также оказались более качественными при использовании зондов с НВ (таблица 3.1, рисунок 3.3-3.4). Общее уменьшение уширения при работе стандартными зондами и зондами с НВ в жидкости (среды PBS и NaOH 0,1М) по сравнению с воздушной средой может быть связано с преждевременным срабатыванием системы слежения. Микротечения, возбуждаемые при колебаниях зонда в полуконтактном режиме, могут переотражаться от стенки и воздействовать на зонд, приводя к понижению амплитуды раскачки зонда. Понижение амплитуды раскачки расценивается системой слежения как начало взаимодействия, в результате чего зонд описывает ступеньку преждевременно, и область ступеньки отображается с меньшим уширением.

При использовании стандартных зондов в данных средах были замечены шумы, которые могут быть связаны со наличием микротечений в жидкости, возникающими при работе зонда в полуконтактном режиме. Кроме того, в среде NaOH 0,5 M был замечен артефакт изображения, связанный с «выпиранием» при использовании стандартного зонда нижней (темная область) части поверхности, в результате чего она отображается искаженной - как выпуклость (светлая область) (рисунок 3.3, в, е). Зонд с НВ отображает эту зону корректно - как основание, нижнюю (темную) область поверхности.

Данное явление может быть связано с повышенным трением приповерхностного слоя жидкости со стандартным зондом в средах с высокой плотностью (NaOH 0,5М), что объясняется низким аспектным отношением и большой площадью контакта стандартного зонда со средой. При постепенном увеличении контакта зонда с образцом за счет подавления амплитуды раскачки зонда в полуконтактном режиме данный артефакт изображения был устранен. Также следует отметить, что буферные среды натриевых гидроксидов имеют явно выраженные щелочные свойства, довольно «агрессивны» и могут разъедать верхние слои объектов в процессе сканирования, поэтому для измерения химически активных объектов и биологических образцов лучше использовать иные буферные среды, например, буфер PBS.

С целью изучения взаимодействия зонда с поверхностью в жидкости и воздушной среде были измерены кривые отвода/подвода (рисунок 3.5). Как известно, в полуконтактной режиме зонд колеблется на своей резонансной частоте на определенной амплитуде колебаний, которая затухает при приближении зонда к поверхности. Амплитуда колебаний оценивается по сигналу от фотодиода, на который падает пучок лазера, отраженный от кантилевера зонда. На кривых отвода/подвода, измеренных в жидкости, были обнаружены особенности (рефлексы), представляющие собой области резкого повышения амплитуды раскачивания зонда (рисунок 3.5, а), отсутствующие при измерениях в воздушной среде (рисунок 3.5, б).

Предположительно первый и последний рефлексы возникают из-за наличия микротечений, образующихся при подводе зонда к поверхности при начальном контакте и прижиме к образцу, соответственно. Тогда последний (третий) рефлекс можно объяснить остаточным воздействием микротечений после установления контакта с подложкой, а также изгибом балки кантилевера при нарастании степени прижима и увеличении давления жидкости под балкой (пик-эффект) [100].

Тестирование зондов-пипеток с наносферами: совмещение методов сканирующей силовой микроскопии и сканирующей микроскопии ионной проводимости

ССМ является одним из немногих методов диагностики, позволяющих визуализировать нативные биологические объекты (клетки, бактерии, ДНК и т.п.) в жидкости с высоким пространственным разрешением. Тем не менее, использование метода ССМ приводит к искажению мягких биологических объектов даже в полуконтактном режиме. В последнее время в связи с возможностью уменьшения инвазивности изучения нативных объектов в жидкости получил развитие метод сканирующей микроскопии токов ионной проводимости, который также называют сканирующим микроскопом ионной проводимости (СМИП). Интерес к совмещению СМИП и ССМ обусловлен также отличным от ССМ механизмом возникновения контраста изображения в СМИП режиме, что может дать дополнительную информацию об изучаемом объекте, а также возможностью совмещения с методом “patch-clamp”.

Зонд из боросиликатного стекла в виде заполненной электролитом нанопипетки (НП) помещался в емкость с непроводящим образцом. В качестве электролита, находящегося в емкости и канале пипетки, использовался физиологический раствор хлорида натрия (NaCl). В канале НП и емкости находятся два электрода из Ag проволоки, покрытой слоем AgCl. При подаче напряжения смещения V0 между электродами начинает через электролит протекать ионный ток. При этом чем ближе зонд к поверхности, тем меньше становится ток, в результате закупоривания выходного отверстия НП. Ионный ток образуется путем обратимой окислительно-восстановительной реакции на электроде Ag/AgCl, при которой атомы хлорида получают электрон и переходят в электролит, металлизируя серебро.

На электроде ионный ток преобразуется в электронный и при помощи ПТН (преобразователь «ток-напряжение») преобразуется в напряжение V=kI через коэффициент преобразования k. Для компенсации падения тока при приближении НП на расстояния, сопоставимые с размерами выходного отверстия НП, используется следящая система с отрицательной обратной связью. Измеряемое напряжение V сравнивается с опорным Vref, после чего компенсирующий V–Vref сигнал преобразуется ПИД-регулятором, усиливается и прикладывается к сканеру с образцом. Таким образом поддерживается заданное значение тока на заданном расстоянии от поверхности, в результате чего возможно неразрушающее измерение непроводящих образцов (рисунок 3.26). При этом величина ионного тока также сильно зависит от формы зонда-пипетки [125]:

I = V0r0tg(), (3.10) где V0 - напряжение смещения, - проводимостью электролита r0 - радиус выходного отверстия НП, - угол сходимости НП.

На рисунке 3.27 показаны характерные зависимости изменения I(Z) и относительного изменения амплитуды A/Amax, полученные зондами-пипетками при их тестировании в СМИП и ССМ, соответственно. Работа в режиме СМИП осуществлялась при характерных значениях ионного тока 16-18 нА и напряжениях около ±(0,4-0,6) В. Использование зонда-пипетки в ССМ проходило при подавлении амплитуды раскачки до 10-15% (A/Amax=0,85-0,9) при частоте 5-9 кГц. Проведено не менее 100 измерений структуры в различных областях образцов.

Как видно из формулы, при увеличении угла заточки устойчивость повышается квадратично, однако использование высокоаспектных пипеток может быть важно при исслеовании объектов с развитой топологией. Если учесть, что E=22 ГПа [126] (материал B2O3), r0 = 175 нм, = 8, плучим Fкр 410–4 Н. Так как характерные силы взаимодействия зонда с поверхностью образца в ССМ составляют около 1 нН, можно говорить о возможности применения НП в режиме силовых измерений.

Проведена визуализация топологии полиэтиленовой поверхности методом СМИП и ССМ, продемонстрирована хорошая корреляция изображений, полученных разными методами. С целью определения разрешающей способности СМИП на поверхности полиэтиленового образца была специально создана периодическая структура с периодом 3 мкм и шириной линии 1 мкм. Структура представляет собой реплику (слепок) с решетки калибровочной решетки TGZ2, включенной в государственный реестр как средство измерения мер рельефных нанометрового диапазона (номер меры в государственном реестре 41678-09) [97, 98]. Параметры решетки: высота 110±2 нм, период 3±0,05 мкм. Проведено не менее 100 измерений структур в различных областях решетки.

На рисунке 3.29 и рисунке 3.30 показаны ССМ изображения структуры решетки TGZ и её реплики, полученной стандартным W зондом [95]. На решетке TGZ период структуры составил 3,6±0,4 мкм, высота 108±10 нм, на реплике период структуры составил 3,4±0,2 мкм, высота 96±8 нм.

На рисунке 3.31 показаны СМИП изображения реплики решетки TGZ, полученной зондом-пипеткой. Период структуры составил 3,4±0,3 мкм, высота 84±22 нм. Замечены небольшие срывы СМИП - изображения на границе ступенек по сравнению с полуконтактным режимом ССМ, однако в целом ССМ- и СМИП-изображения демонстрируют хорошую корреляцию.

Для повышения устойчивости НП и улучшения качества изображения, к вершение пипетки сбоку были прекреплены калиброванные Au сферы радиусом 200 нм. На рисунке 3.32 показано улучшение изображения при использовании НП со сферой.

Использование зондов с нановискерами для устранения артефакта инверсии изображения в сканирующей силовой микроскопии

Детальный анализ ССМ изображений эритроцитов показывает, что существуют области нанометровых размеров визуализируемые как выпуклости на поверхности клеточной мембраны в случае применения стандартного зонда, и как впадины (поры) при использовании зонда с НВ (рисунок 4.19). Таким образом, в полуконтактной силовой моде наблюдается инверсия контраста при использовании зондов различных типов [153].

При этом инверсия контраста наблюдалась и в контактной силовой моде (рисунок 4.20). При использовании Si зонда на поверхности эритроцита визуализируются нанометровые выступы (рисунок 4.20, а), а при его замене на зонд с Pt/C вискером нановыступы инвертируются в нанопоры (рисунок 4.20, б). При обратной замене зонда с Pt/C вискером на Si зонд возвращается исходный контраст (рисунок 4.20, в) [154].

На рисунок 4.21. представлены ССМ изображения такой наноструктуры, полученные с помощью стандартного Si кантилевера (рисунок 4.21, а) и кантилевера с Pt/C нановискером (рисунок 4.21, б). Отчетливо видно, что стандартный зонд визуализирует тестовую структуру как выступ над общей плоской поверхностью, в то время как кантилевер с нановискером дает правильную картину и разрешает наноструктуру как углубление. Детальный анализ показывает, что эффект инверсии контраста имеет место на каналах и порах с субмикронными размерами около 100 нм. Объекты с микронными размерами визуализируются структурно одинаково [156].

Эффект инверсии также был обнаружен на поверхности пористого стекла К8, изготовленного по методу кислотного травления (рисунки 4.22-4.23). Следует отметить, что в случае применения стандартного зонда поры стекла отображаются как выпуклости пирамидальной формы, что, по всей видимости, определяется формой самой пирамидки зонда.

В соответствии с уравнением Лапласа [157] давление паров воды над поверхностью водяных менисков в капиллярах со смачиваемыми стенками должно понижаться на величину p=±2(1/Ri+1/R2), (4.2) где - поверхностное натяжение воды, R\ и R2 - главные радиусы кривизны поверхности мениска. Символ (+) относится к выпуклым поверхностям в виде холмов, а знак (-) относится к вогнутым поверхностям в виде пор.

Согласно уравнению Кельвина [158] давление насыщенного пара над изогнутой поверхностью жидкости в капиллярах может быть представлено как: р = р0.е , (4.3) где P - давление насыщенного пара над изогнутой поверхностью, Pо давление насыщенных паров под плоской поверхностью; r - радиус кривизны мениска; R - газовая постоянная; V - молярный объем жидкости, T - температура.

Уравнение Кельвина показывает, что давление паров уменьшается при вогнутых поверхностях мениска в капилляре с гидрофильными стенками. Этот факт вносит вклад в явление капиллярной конденсационной жидкости в порах с субмикронными размерами. Это означает, что вода всегда присутствует внутри небольшого капилляра с гидрофильными стенками в условиях окружающей среды.

Такое понижение давления способствует явлению капиллярной конденсации жидкостей в порах с малыми размерами. Как показано в [159], при наноразмерах пор поверхность соответствующих водяных менисков может иметь достаточно сложную форму, как с вогнутыми, так и с выгнутыми участками. Согласно уравнению Лапласа это можно объяснить наличием в наноканалах воды с избыточным давлением, превышающим несколько атмосферных давлений [160]. Таким образом, в наноканалах или нанопорах с гидрофильными стенками и диаметрами ниже критических значений [161] форма мениска конденсированной воды может быть выпуклой, а капля воды может лежать на наноканале (рисунок 4.24).

На рисунке 4.25, а, представлено ССМ изображение сформированного электронно-лучевой литографией наноканала в резисторе SU-8, полученное стандартным Si зондом. Известно, что после затвердевания поверхность SU-8 характеризуется гидрофобными свойствами [162], и в наноканале конденсация воды не происходит. После обработки SU-8 раствором H2SO4 + H2O2 поверхность меняет свои свойства на гидрофильные, и в случае нормального атмосферного состояния капли воды конденсируются в наноканале и нанопорах. На рисунке 4.25, б, представлено ССМ изображение наноканала в SU-8 после обработки, полученное с помощью стандартного Si зонда. Можно видеть, что наноканал проявляется в виде возвышенности, таким образом, явление инверсии контраста действительно проявляется на стандартных зондах.

При низкой силе взаимодействия, которую используют для неинвазивного изучения биообъектов, гидрофобный зонд не может проникнуть сквозь слой влаги и достигнуть поверхности образца. Гидрофобный зонд визуализирует только поверхность, покрытую слоем влаги. Гидрофильный Pt/C НВ, напротив, притягиваясь к образцу сильнее за счет большей силы адгезии (см. п. 4.1.1.), по сравнению со стандартным Si зондом, проникает через слой влаги и позволяет визуализировать истинный рельефа поверхности образца. Данное утверждение подтверждается результатами, полученными на тестовых наноструктурах и хорошо согласуются с тем фактом, что НВ, имея сопоставимый со стандартным зондом радиус закругления вершины, обеспечивает существенное улучшение пространственного разрешения и контраста изображения [163, 164].

Улучшенное пространственное разрешение зонда с НВ также может быть обусловлено его высоким аспектным отношением, способствующим проникновению НВ сквозь слой воды, сконденсированный в тонких каналах и порах на поверхности гидрофильного образца. Таким образом, наблюдаемую с помощью Pt/C НВ тонкую структуру на поверхности эритроцитов можно связать с белковыми глобулами, которые, как известно [165], встроены в липидный бислой клеточной мембраны.

Из [166-168] следует, что артефакты при работе в резонансной силовой моде должны проявляться на зондах с более сильной адгезией. Однако в данном случае наблюдается обратная картина. т.е. артефакты дают стандартные зонды, адгезия которых к поверхности эритроцита в (2-3) раза меньше адгезии зондов с Pt/C НВ. Также была выявлена инверсия контраста при замене гидрофобного зонда на гидрофильный зонд. При этом данный эффект был выявлен как в полуконтактном, так и в контактном режиме исследований, когда колебания зонда отсутствуют, что связывает причину инверсии контраста с капиллярной конденсацией влаги в нанопорах и наноканалах.

В соответствии с полученными экспериментальными данными можно предположить, что гидрофобный Si зонд «чувствует» слои воды, заполняющие наноканалы и нанопоры на гидрофильной поверхности образца, в то время как зонд с гидрофильным Pt/C НВ проникает сквозь водяной мениск, прописывая нанопрофиль поверхности без артефакта.