Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Актуальность проблемы. Цели и задачи исследования 11
1.1 .Актуальность работы 11
1.2. Аналитический обзор литературы 12
1.3. Методы оценки качества спермы человека и животных 16
1.3.1. Определение концентрации спермы 17
1.3.2.Оценка подвижности и типы движения спермиев 19
1.4. Генетические ресурсы — составляющая часть биосферы 22
1.5. Цели и задачи исследований 24
Глава 2. Материалы и методы исследования 25
2.1. Характеристика спермы человека 25
2.2. Характеристика спермы животных 28
2.2.1. Оценка качества спермы животных ...32
2.2.1.1.Определение концентрации сперматозоидов .32
2.2.1.2. Определение процента живых 34
2.2.1.3. Испытания методами шоковых воздействий 34
2.3. Выводы 35
Глава 3. Аппаратно-программный комплекс определения параметров траекторий и скоростей движения сперматозоидов 36
3.1.Предпосылки решения задачи экспресс — диагностики спермы оптическими методами 38
3.2 Оптико-электронные системы формирования и обработки изображения 40
3.2.1. Оптико-электронные системы формирования и обработки изображений 41
3.2.2. Оптическая диагностика рассеивающих сред 42
3.3. Постановка задачи 43
3.3.1. Ошибки при анализе эякулята 43
3.3.1.1. Статистические ошибки подсчета при анализе эякулята 43
3.3.1.2.0шибки подсчета при оценке концентрации сперматозоидов 43
3.3.1.3.Ошибки подсчета при оценке подвижности и морфологии сперматозоидов 44
3.3.1.4. Значение контроля качества 45
3.3.1.5.Рутинный коїггроль и корреляция результатов между образцами 46
3.3.2.Схема основных этапов работы аппаратно-программного комплекса 47
З.З.З.Математическое решение к выбору аппаратного средства 50
3.3.4. Обзор имеющихся аппаратных средств 52
3.3.4.1 .Фрейм-грабберы 52
3.3.4.2.ТУ-тюнеры 53
3.3.4.3. Преобразователи VGA-TV 53
3.3.3.3. MPEG-плейеры 53
ЗААлгоритм траекторной обработки 53
3.4.1 Фильтрация 53
3.4.2.Точность оценок траектории 62
3.4.3. Операция экстраполяции 66
3.4.4.Экстраполяция ковариационной матрицы 67
3.4.5. Селекция 67
3.4.6.0бнаружение 69
3.4.7.3авязка 69
3.4.8. Формирование списка траекторий 70
3.5. Реализация аппаратно - программного комплекса 72
3.5.1.Оптимизация параметров настройки (увеличения микроскопа и фокусировки изображения) 73
3.5.1.1. Увеличение микроскопа 73
3.5.1.2. Фокусировка изображения 75
3.5.3. Алгоритмы траекторной обработки 80
3.5.3.1. Алгоритм пороговой обработки 80
3.5.3.2. Алгоритм логического сглаживания 84
3.5.3.3. Обработка траекторий 86
3.5.4. Тестирование 87
3.5.5. Оценка биосреды 88
3.5.6. Работа с программой 92
3.5.7. Руководство пользователя 93
3.5.8.Выводы 95
Глава 4. Определение концентрации биосреды лазерным нефелометрическим методом 97
4.1. Диагностическое значение концентрации сперматозоидов 97
4.2. Физические методы анализа биологических дисперсных сред 98
4.2.1. Сперма - биологическая дисперсная среда 98
4.2.2. Физические методы анализа биодиснерсий 98
4.2.3. Применение методов светорассеяния Б биологии и медицине 103
4.3. Теоретические основы рассеяния света 106
4.3.1. Подход к методу исследования на ансамбле частиц 108
4.3.2. Краткое описание рассеяния волн в дисперсной среде 110
4.3.3. Статистическое описание состояния дисперсной среды 111
4.3.4. Интегральное представление характеристик светорассеяния... 113
4.3.5. Интегральное рассеяние света большими частицами 114
4.3.6. Определение угла регистрации рассеянного излучения 115
4.4. Требования к параметрам зондирующего излучения 115
4.5. Экспериментальное исследование зависимости интегральной характеристики светорассеяния на биосреде 117
4.5.1. Общая характеристика прибора 117
4.5.2. Анализ погрешностей измерения оптических характеристик рассеяния 121
4.5.3.Экспериментальное исследование зависимости характеристик светорассеяния от параметров биосреды 123
4.5.4 Исследование зависимости характеристик светорассеяния от подвижности сперматозоидов 130
4.6. Выводы 133
Глава 5. Взаимодействие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) с биообъектами 135
5.1. Взаимодействие НИЛИ с биообъектами 135
5.1.1. Стимулирующее и биологическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения 136
5.1.2. Биофизический аспект взаимодействия НИЛИ с биообъектами 143
5.1.3. Модельный анализ основных биологических процессов
при воздействии низкоинтенсивного лазерного излучения 144
5.1.4. Информационный аспект структурного отклика биожидкостей на внешние воздействия 147
5.2. Исследование воздействия лазерного излучения на сперму человека 149
5.2.1. Исследование воздействия лазерного излучения с длиной волны 0,63 мкм на сперму человека 149
5.2.2. Исследование воздеисгвия лазерного юлучения с длинами волн 0,63 мкм и 0,89 мкм на сперматозоиды племенных животных 153
Глава 6. Исследование воздействия НИЛИ на свойства криосохраняемых репродуктивных клеток 162
6.1. Роль и место криобиологии в репродукции человека и животного 162
б.Ы.Криконсервация генетических ресурсов 163
6.1.2. Биологическая мембрана 165
6.1.3. Структурно- биохимические изменения спермиев при криоконсервации 166
6.1.4. Альтернативные методы повышения эффективности криоконсервации спермиев 168
6.1.4.1. Использование постоянного магнитного ноля ъ криоконсервации спермы 168
6.1.4.2. Использование низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в криоконсервации спермы 169
6.2. Исследование возможности криоконсервации спермы барана с использованием НИЛИ с длинами волн 0,63и 0,89 мкм 170
6.2.1.Материалы и методы 170
6.2.2. Замораживание спермы 171
6.2.3. Оттаивание спермы 173
6.2.4. Анализ воздействия НИЛИ на подвижность сперматозоидов 173
6.3. Результаты экспериментов 169
Выводы по работе 177
Список литературы
- Методы оценки качества спермы человека и животных
- Оценка качества спермы животных
- Оптико-электронные системы формирования и обработки изображений
- Физические методы анализа биодиснерсий
Введение к работе
Согласно современным представлениям жизнь на Земле возникла около 3,5 миллиарда лет тому назад. Основой возникновения жизни было появление молекулы ДНК - уникального биосубстрата, определяемого двумя свойствами: способностью к воспризводству и синтезу белков и определенной последовательностью аминокислот.
Индивидуальные качества каждого живого существа определяются генетическим набором, содержащимся в ДНК. ДНК человека состоит из более, чем трех миллиардов последовательно соединенных частиц, объединенных в 100 000 геномов. Каждый геном ответственен за какое-либо свойство организма человека. Сто тысяч геномов распределены вдоль 23 пар хромосом.
ДНК-человека - самая мощная молекула из существующих в природе нашей планеты. Именно ДНК обеспечила человеку доминирующее положение в современном живом мире на Земле. Всего 10 000 лет тому назад на Земле было около 10 млн. человеческих особей. Около 4000 лет назад их число стало быстро увеличиваться. К началу нашей эры их было уже четыре миллиарда человек.
В текущем столетии человек стал преобладающим видом не только по численности, но и по распространенности на планете: он проник на самые высокие точки Земли, морское дно и в космос. Ответственность современного человека за будущее развитие жизни на планете возрастает с каждым днем.
Философия наших древних предшественников, считавших своей основной задачей сохранение человеческого рода, практически не изменилась на протяжении многих веков существования человечества.
В современной биологической науке понятия "адаптация" и " оптимизация" вида практически отождествлены с возможностями воспроизводства здорового потомства.
В настоящее время бесплодие в браке - проблема, занимающая особое место в медицине. Бесплодие в браке практически всегда социальное, психическое, и очень часто физическое. При частоте бесплодия 15% и выше возникает проблема
социально-демографическая. Немаловажное значение имеют данные о том, что у нерожавших женщин частота опухолей репродуктивной системы значительно выше, чем у женщин, имеющих детей.
В настоящее время в медицине наиболее остро встает вопрос лечения
и диагностики заболеваний, связанных с репродуктивной функцией человека.
Приведем небольшую статистику: состояние беременных женщин с каждым
годом резко ухудшается, выросла заболеваемость беременных по сравнению с 1993 годом: анемией - на 14,5 %, болезнями мочеполовой системы - на 13,9 %, системы кровообращения - на 11,9 %, число поздних токсикозов увеличилось на 9,4%. Доля нормальных родов составила в 1998 году - 31,5 % (в 1994-37,9 % , в 1990 году 52 %). Заболеваемость злокачественными новообразованиями репродуктивной системы составила 280 на 100 000 человек населения. Заболевания мочеполовой системы у мужчин увеличилась на 16,6% (1993г.-10,3%).
О развитии тревожной тенденции мужского бесплодия заговорили во всем мире, особенно в России, Германии, Франции и Норвегии: все больше и больше мужчин в промышленно развитых странах не могут стать отцами. Постоянно увеличивается количество супружеских пар, которые ненамеренно остаются бездетными. В 50-е годы в европейских государствах таких семей было около 8%, а в начале 90-х уже свыше 20%. В настоящее время ответственность за бесплодие распределяется уже поровну между супругами в 40% "виноваты" мужчины, в 40% - женщины, в 15% "виноваты" оба, и в 5% случаев причина бездетности остается неизвестной.
Основная причина угрожающе растущей неспособности сперматозоидов мужчин к оплодотворению - загрязнение окружающей среды ядовитыми соединениями промышленного производства, тяжелыми металлами, радионуклидами и другими вредоносными веществами.
Проводя массовые исследования качества и концентрации сперматозоидов в сперме мужчин, немецкие ученые установили, что в среднем насчитывается всего 25 млн. в 1мл эякулята. Для сравнения: в начале нашего века в 1 мл семен-
ной жидкости у мужчин было в среднем около 100 млн/мл, 25-30 лет назад этот показатель снизился до 60 млн/мл, а сегодня нормой считается уже 40 млн.
На первый взгляд 40 миллионов - громаднейшее количество, но на долгом пути к яйцеклетке сперматозоиду приходится преодолевать " полосу препятствий": кислоты, энзимы, гормоны. Даже при высокой концентрации сперматозоидов в эякуляте до маточной трубы, где происходит оплодотворение, доходит обычно лишь несколько сотен, а то и десятков живых сперматозоидов, то есть чем меньше полноценных сперматозоидов в эякуляте, тем меньше шансов на зачатие.
Ситуация осложняется существенным ухудшением качества сперматозоидов. По данным немецких ученых в настоящее время в среднем только четвертая часть из них в состоянии оплодотворить яйцеклетку. При изучении причин было обращено внимание на то, что качество сперматозоидов мужчин, проживающих в промышленных районах значительно хуже, чем качество сперматозоидов у мужчин, живущих в более экологически чистых районах.
Например, в Рейно-Рурском районе среднее количество сперматозоидов в эякуляте мужчин к 2000 году снизилось до 14 млн. в 1 мл по сравнению с 24 млн. в 1981 году. В относительно же "чистых" землях Германии соответствующие показатели оказались равными 36 и 44 млн.
Существенные различия в качестве репродуктивных клеток мужчин, проживающих на территориях с неодинаковой экологической ситуацией отмечались также в Дании, Швеции, Австралии и США. По мнению большинства ученых эти очевидные различия настолько велики, что они однозначно указывают на загрязнение окружающей среды как основную причину растущего бесплодия среди мужчин.
От начала формирования мужской половой клетки до полного созревания сперматозоида проходит до 3-х месяцев - время, в течение которого на репродуктивную систему мужчин могут оказывать влияние различные вредоносные факторы.
В лабораторных условиях экспериментальным путем было доказано, что сперматозоиды становятся неподвижными при добавлении в 1 мл эякулята всего 10*2 мг полихлорбифинила, вещества широко применяемого в качестве пластификатора при производстве клеев, лаков и пластмасс.
Не меньший вред может принести контакт с тяжелыми металлами: свинцом, кадмием, ртутью. При попадании в организм они повреждают тончайшие оболочки семенных канальцев и нарушают процесс образования сперматозоидов.
На способность мужчин к зачатию неблагоприятно влияют многие лекарственные препараты: болеутоляющие, гормональные, психотропные средства. Уже давно установлено отрицательное воздействие на мужские половые клетки веществ, сознательно употребляемых людьми: никотин, алкоголь, опиум.
Радикальных методов лечения мужского бесплодия вызванного снижением качества спермы, нет. В качестве мягкой терапии немецкие врачи советуют для восстановления способности к зачатию сменить место жительства на более экологически чистый район.
В последнее время все более широкое применение находит создание "банков семени": мужчина многократно сдает сперму, которая замораживается и хранится при температуре -196 С. После того как ее набирается достаточное количество "концентрат" вводится женщине в благоприятный физиологический период для зачатия. Для многих мужчин это единственный способ спасения от бездетного брака.
Прогресс в понимании генетической основы мужского бесплодия в совокупности с успехами вспомогательных репродуктивных технологий вернули надежду мужчинам, ранее считавшихся бесплодными. Успех применения ультразвука, лазерного излучения, электрического и магнитного поля в лечении репродуктивных нарушений привел к возрождению интереса к оценке функциональных характеристик сперматозоидов.
Методы оценки качества спермы человека и животных
Сперматозоиды могут совершать прямолинейно-поступательное (ППД), манежное и флигсллирующсс движения. Манежное (по кругу) движение совершают неполноценные спермин, в отличие от нормальных, не вращающихся вокруг своей оси [12, 14, 144]. Разбор механизмов движения имеется в работе [138]. Оплодотворяющей способностью обладают только спермин с ППД, прочие учитываются как аномальные.
Турбидиметрическое определение подвижности по изменению оптической плотности суспензии спермиев описано в [210].
Из различных микрофотографических методов определения подвижности и типов движения сперматозоидов следует указать на фотографирование в темном поле с большой выдержкой (2с) [163], и на метод множественной экспозиционной фотографии (МЭФ), основанный на стробоскопическом освещении (импульсы света около 160 мс) суспензии спермиев при открытом затворе фотоаппарата [177]. В обоих случаях неподвижные спермин имеют четкие изображения, движущиеся - оставляют следы (треки).
Видеосистемы анализа кинетических характеристик сперматозоидов позволили получить изображения треков подвижных клеток [171], определять концентрацию окрашенных и разбавленных спермиев [36,52]. Предшественниками видеосистем являются системы микрофотографический анализа, первые сведения о которых появились в 1970 году [160], позволяющих отследить подвижные спермин, используя видеозапись (но из-за сложности оборудования не нашел широкого применения. Длительность анализа составляет 20 минут).
Введение современной аппаратуры в сперматологическую практику позволило ввести новые параметры движения: амплитуду перемещения головки и среднюю скорость [139].
Использование лазерного излучения в сиерматологни позволило определять скорость движения спермиев по спектру рассеянного монохроматического излучения на OCHORC гхІкЬекта Лоплепа N981. Математическое обоснование и ппеиму щества использования лазерного излучения в данном методе подробно описаны в [170]. Недостатком данного метода является то, что оценивается общая подвижность образца, а не процент спермиев с прямолинейно-поступательным движением.
Актуальной задачей является разработка современных средств автоматического анализа подвижности сперматозоидов. Современный уровень развития средств фиксации и цифровой обработки изображений позволяет решить эту задачу с использованием оптико-электронных устройств, ПЗС (приборы с зарядовой связью)-камер и алгоритмов выявления и селекции движущихся целей, используемых в радиолокации.
Для оценки морфологических показателей качества сперматозоида и его ор-ганелл был предложен метод атомно-силовой микроскопии. Для сопоставления молекулярных и физиологических изменений спермиев предложено изучение на-тивной флуоресценции [185,] ,т.е. используются различные флуоресцентные красители.
Для более надежного прогнозирования биологической полноценности спермы, определения патологических элементов, оплодотворяющей способности на-тивной и криоконсервированной спермы необходимы дальнейшие исследования с привлечением новейших научных достижений в различных смежных областях.
Прогресс в этом направлении может быть достигнут использованием методов неразрушающего контроля. Одним га них является нефелометрический метод, основанный на явлении светорассеяния на спонтанных флуктуациях концентрации - метод измерения интегральной интенсивности рассеянного света. Метод не вносит возмущений в исследуемые образцы, даёт объективную информацию, имеет высокую чувствительность, технические средства на его основе легко поддаются автоматизации.
Метод лазерной нефелометрии, основанный на измерении рассеянного на биожидкости света, хорошо зарекомендовал себя в иммунологии [20, 94, 95, 115].
Использование лазерной нефелометрии в анализе отдельных классов иммуноглобулинов показало преимущества данного метода благодаря его чувстви телыюсти, стабильности и экономичности. Высокая чувствительность определения иммунных комплексов методом лазерной нефелометрии позволяет выявлять их в различных биологических жидких субстратах.
Линейная зависимость светорассеяния от количества эритроцитов в суспензии позволяет использовать лазерные нефелометры не только для определения концентрации отдельных компонентов биоседы, но и для оценки её функциональной активности. Новым достижением явился способ оценки активности им-мунокомпетентных клеток с помощью лазерной нефелометрии [82].
Использование низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в нефело-метрическом анализе позволяет разработать эффективные методы неразрушаю-щего контроля биологических объектов.
Анализируя внедрение лазерной нефелометрии в клиническую иммунологию и учитывая высокую скорость, эффективность, точность и экономичность исследования, а так же учитывая оптические свойства семенной жидкости, предполагаем возможность использования нефелометрического метода для диагностики семенной жидкости человека.
Для реализации метода лазерной нефелометрии диагностики семенной жидкости актуальным становится определение доз не возмущающего воздействия лазерного излучения на морфофункциональные свойства сперматозоидов.
Определение доз биостимулирующего характера НИЛИ на сперматозоиды, несомненно важно для исследования механшма воздействия лазерного излучения на сперматозоид на клеточном и субклеточном уровне.
Многочисленные результаты использования НИЛИ в лечении заболеваний репродуктивных органов и мочеполовой системы, стимуляции сперматогенеза и функций семенников [28, 105], и одновременно с этим невозможность сравнения и использования литературных данных ввиду их недостаточной информативности свидетельствуют об актуальности исследования воздействия НИЛИ на репродуктивные клетки человека и животных.
Практический и теоретический интерес представляет изучение возможности использования НИЛИ для повышения биологической активности спермы животных.
Многократно отмеченное стимулирующее действие НИЛИ на биообъекты на организменном и клеточном уровне и единичные сообщения [86, 87] об использовании защитного действия гелий-неонового (HE-NE) лазерного излучения для хранения сперматозоидов животных говорит о целесообразности использования НИЛИ в качестве криопротективного фактора.
Учитывая особенности воздействия НИЛИ с длинами волн 0,63 и 0,89 мкм на биообъекты, в том числе на репродуктивные органы, можно предположить, что НИЛИ оказывает биостимулирующие свойства на сперматозоиды и тем, самым может оказать защитное действие на сперматозоиды при их длительном низкотемпературном хранении, т.е. в криоконсервации. Определение воздействующих (стимулирующих и угнетающих) доз воздействия НИЛИ на сперматозоиды актуально как в плане создания новых методов тестирования биологической полноценности и жизнеспособности спермы, метрдої} консервации и хранения репродуктивных ресурсов, так и для разработки технических средств диагностики.
Таким образом, задача исследования врпросов диагностики и стимуляции спермы представляет интерес для различных областей знаний (науки, биологии, криобиологии, медицины, биофизики) и является актуальной.
Оценка качества спермы животных
Андрология - наука о мужской репродукции, является относительно молодой в России. Долгие годы под андрологией подразумевали лишь область урологии, относящуюся к мужскому бесплодию. Перемены в жшни общества обусловили развитие андрологии по ряду направлений, в том числе в области становления эндокринологии мужского организма, проблем мужского бесплодия, сексологии и сексопатологии, геронтологических аспектов.
Не только в России, но и во многих развитых странах мира диагностика заболеваний мужской половой сферы не совершенна, что отчасти объясняется многопричинностью таких нарушений и отсутствием единых высокоинформативных методов лабораторного исследования эякулятов.
Известно, что 40-50% всех причин бесплодия в браке происходит вследствие нарушений репродуктивной функции у мужчины. Необходимость проведения анализа эякулята и оценки состояния сперматозоидов в случаях выяснения причин длительного бесплодия супружеских пар, даже если у мужчины в прошлом имелись дети, подчеркнут в [128].
Важнейшим методом в оценке функционального состояния половых желез и суждении о плодовитости мужчин является исследование спермы. В связи с этим, выявление мужского фактора при обследовании бесплодных пар в большой степени зависит от точного и корректного определения показателей подвижности и концентрации сперматозоидов [24]. Эти данные являются основными дискриминационными показателями и решающими в оценке ее репродуктивной полноценности [10,12]. Признание значимости количественной оценки биологической полноценности репродуктивных клеток привело к созданию различных методических подходов и устройств, позволяющих вычислять подвижность и концентрацию.
Анализ литературы по методам и используемым средствам в диагностике показал, что основными показателями репродуктивной полноценности сперматозоидов человека и животных являются концентрация и подвижность.
В основе стандартных процедур лабораторного анализа эякулята человека и животных лежит визуально-микроскопическое исследование, несмотря на его низкую точность, высокую трудоемкость, длительность по времени, необходимость рутинной пробоподготовки.
К разряду нетрудоемких методов, позволяющих быстро провести качественный анализ спермы, относится определение коэффициента подвижности сперматозоидов [171]. Метод регистрирует флуктуации оптической плотности, вызванные движением сперматозоидов через тонкий оптический канал. Частота этих флуктуации кореллирует с концентрацией подвижных клеток и интенсивностью их движения, что используется для вычисления коэффициента подвижности сперматозоидов. Однако вопрос
применимости этого параметра в клинической практике остается открытым. Также нерешенными остаются вопросы стандартизации измерений. Это в первую очередь касается температурного режима, типа камеры и состава среды для разведения образцов.
Важным недостатком при разработке и апробации новых методов исследования концентрации и подвижности является прототипныи метод сравнения — метод визуального подсчета сперматозоидов в счетных камерах (Маклера, Горяева) и гемоцитометрах, точность и аналитическая чувствительность которого зачастую намного ниже разрабатываемых, например, оптических методов. Поэтому первостепенной задачей является автоматизация микроскопического метода определения концентрации и подвижности клеток.
На перспективность, клиническую полезность, необходимость компьютерного анализа эякулята указано в руководстве ВОЗ. В серии документов международных организаций (Международная организация стандартизации, Международная Федерация клинической химии и лабораторной медицины) принципиальное значение ключевого фактора придается обеспечению достоверности лабораторной клинической информации.
Представляют интерес данные об ошибках [79] выявленных в конкретной экспресс-лаборатории в течение 3 месяцев. Среди проведенных 40490 анализов было зарегистрировано 189 лабораторных ошибок ( 1 ошибочный результат на 200 верных). Распределение ошибочных результатов по этапам следующее: на преаналитический этап приходилось 68.2%, аналитический-13,3%, на постаналитический - 18,5% неправильных результатов.
Оптико-электронные системы формирования и обработки изображений
На этапе завязки, необходимо ввести начальные значения параметров траектории. Так как мы имеется квадратичная или линейная траектория, то для завязки необходимо минимум три кадра. Поэтому предлагается использовать жесткий алгоритм завязки траектории 3 из 3. Это значит, что только три подряд отметки от одной цели приводят к завязке траектории.
Критерием сброса (срыва) траектории будет служить пропуск хотя бы одной отметки на одном кадре. Эти достаточно жесткие условия на завязку и сопровождения траектории позволяют обойтись без поиска цели в случае пропуска отметки и, с другой стороны, имеется достаточно большое число отметок на одном кадре чтобы иметь большую выборку по определению скорости группы. С другой стороны, при большом количестве отметок нам надо будет перебрать все возможные траектории для отбора верных или сопровождать все траектории до их срыва. Это повлечет большие вычислительные затраты. С целью умеїгьшепия вычислений и увеличения скорости расчета можно принять следующий алгоритм завязки: все отметки, которые остались не сопровожденными, получают следующий по порядку номер траектории. То есть, не сопровожденные отметки являются началом новых траекторий. Реализация данного алгоритма выглядит следующим образом: for itarg:=l to NumTarg fl] do ArrA[1,itarg].t:=itarg; Этот блок схемы служит для хранения всех параметров траекторий для всех отметок целей.
Так как организация памяти персонального компьютера имеет сегментную структуру, то объем хранения статических данных ограничивается 64 килобайтами. Поэтому, для хранения данных применятся динамическая память. То есть указатель на сегмент данных не является строго фиксированным и равным сегистру CS, а выделяется в ходе выполнения программы.
Для хранения данных желательно использовать ОЗУ в виде массивов, расположенных в оперативной памяти. При этом быстродействие больше, нежели при сохранении на данных на жестком диске. Для хранения данных об отметках и траекториях можно использовать следующую структуру.
В настоящее время основным методом определения подвижности сперматозоидов является визуальное наблюдение. Оценка производится по четырем категориям: неподвижные сперматозоиды, сперматозоиды с непоступательным движением ( 5 мкм/с), сперматозоиды с медленным и вялопоступательным движением, быстрое поступательное движение ( 25 мкм /с при 37С) [70].
Для масштабирования используется предметное стекло с нанесенной на него сеткой (25 квадратов).
Основное время затрачиваемое в клинико- диагностических лабораториях для определения патологии геометрии клеток идет на трудоемкую пробоподготовку. В случае использования АПКа каждый кадр изображения анализируется менее, чем за секунду. Однако в данной работе задача определения патологии элементов клеток не преследуется. Основные этапы работы программы: снятие последовательности кадров изображения; на каждом кадре выделяется точечная отметка от частицы; по точечным отметкам строятся траектории движения частиц; на основании траекторий делается заключение о состояние среды.
Чтобы построить траектории и по ним судить о состоянии спермы необходимо, чтобы отметка находилась в поле зрения в течение 10 и более тактов, это с одной стороны. И с другой стороны необходимо, чтобы отметка была различима на фоне. Отметка это не точка, а область, состоящая из нескольких точек. Биологический состав плазмы и сперматозоида очень схож по оптической плотности. И то, что хорошо различимо глазом человека достаточно сложно различить программно. При увеличении х 100 мы имеем плохо различимые отметки. Средний размер отметки составляет 2x3 точки.
Физические методы анализа биодиснерсий
Для обоснования использования метода лазерной нефелометрии в анализе концентрации сперматозоидов в нативном эякуляте следует обратить внимание на оптические характеристики исследуемого материала и проанализировать известные методы исследования дисперсных жидких сред физическими методами.
Сперма относится к классу биодисперсий - биологических дисперсных систем (БДС). БДС - гетерогенные дисперсные системы (ДС), состоящие из двух или большего числа фаз с развитой поверхностью раздела между ними. Биодисперсии (кровь, лимфа, сперма и другие биожидкости) часто являются объектами научных исследований. Одной из важных проблем, возникающих при работе с ДС, является характеристика их состояния, зависящего от физико-химических условий, изменений температуры. Поэтому для исследования состояния биодисперсий необходимо использовать методы, не возмущающие систему. Данными достоинствами обладают оптические методы, основанные на законах поглощения и рассеяния света. Особую актуальность данное преимущество имеет для диагностики состояния спермы, открывая возможность исследования нативного препарата.
Размер и форма биологических частиц, их изменение при взаимодействии частиц могут быть определены различными физическими методами. Среди них наибольшее распространение получил метод электронной микроскопии. Его отличает высокая разрешающая способность и наглядность получаемой информации. Максимальная решающая способность для биологических объектов составляет 1 нм и достигается за счет использования потока электронов, имеющего длину волны 0,003 нм. Поскольку электроны легко рассеиваются и поглощаются, внутри прибора необходимо поддерживать высокий вакуум и при работе, а на просвет - использовать образцы с толщиной несколько десятков нанометров. Два последних условия вынуждают прибегать к разнообразным ухищрениям при приготовлении образцов. Образцы обезвоживаются, фиксируются химическими реагентами к подложке, замораживаются с целью получения реплики. Кроме того, большинство препаратов, исследуемых под электронным микроскопом, испытывает влияние, обусловленное ионизацией и нагреванием объекта электронным пучком. Такая жесткая обработка вносит неконтролируемые изменения в исследуемый образец и искажает получаемую информацию. Для проведения количественного определения размера частиц необходимо проводить калибровку прибора. Минимальная случайная ошибка определения размера частицы с помощью электронно-микроскопического исследования составляет 5%. В случае исследования полидисперсных систем для получения среднего размера и распределения по размерам необходима статистическая обработка результатов единичных измерений частиц. Для определения молекулярно-кинетических характеристик дисперсных биологических систем широко применяются методы анализа их поведения в гравитационном поле.
Центрифугование позволяет определить коэффициент седиментации, являющийся отношением линейной скорости перемещения частицы в радиальном направлении к центробежному ускорению. Зная величину коэффициента седиментации можно определить размер частицы в приближении сферической формы, а в комбинации с величиной коэффициента диффузии, и молекулярный вес. Случайная ошибка Ъ, определения молекулярного веса частиц этим методом составляет 5%. Недостатком метода является значительная продолжительность измерений и обработки экспериментальных данных.
Важное место среди методов исследования дисперсных биологических систем занимает рентгеноструктурный анализ и, в частности, метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, позволяющий определять размер частиц и получать информацию об их внутренней структуре. В этом методе используется рентгеновское излучение с длиной волны порядка 0,1 нм. Углы наблюдения рассеянного излучения составляют от долей градуса до нескольких градусов. Метод позволяет наблюдать неоднородности вещества, имеющие размеры от десятых до нескольких сотен нанометров. Случайная ошибка определения размера частиц может достигать 6-8%. К недостаткам метода следует отнести значительную продолжительность эксперимента и обработки результатов, необходимость использования высококонцентрированных образцов, порядка 1013 кл/мл. Последнее обусловлено плохой рассеивающей способностью рентгеновского излучения некоторых органических соединений. Существенным недостатком является необходимость работы обслуживающего персонала с рентгеновским излучением.
