Метод и устройство диагностики нарушений тканевого метаболизма на основе оптической спектроскопии (на примере сахарного диабета) Дрёмин Виктор Владимирович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Анализ проблемы диагностики нарушений тканевого метаболизма 11

1.1 Актуальность проблемы 11

1.2 Обзор патологий, связанных с осложнениями сахарного диабета 13

1.3 Обзор инструментальных методов диагностики осложнений сахарного диабета 16

1.4 Экспертная оценка уровня ошибок инструментальной диагностики 19

1.5 Метод флуоресцентной спектроскопии 25

1.5.1 Физические основы флуоресценции 28

1.5.2 Диаграмма потенциальных энергий 29

1.5.3 Диаграмма Яблонского 31

1.5.4 Собственные эндогенные флуорофоры 32

1.6 Метод лазерной допплеровской флоуметрии 35

1.7 Применение функциональных проб при исследовании нарушений микрогемодинамики 43

1.8 Экспериментальные исследования возможности измерения метаболизма биотканей 47

1.8.1 Изучение флуоресценция эпителиальных тканей на примере мочевого пузыря 47

1.8.2 Исследование флуоресценции ногтевого ложа 54

1.8.3 Предварительные экспериментальные исследования взаимосвязи метаболизма и кровотока 57

1.8.4 Вопросы методологического и приборного обеспечение предлагаемых методов 64

Глава 2. Математическое моделирование 90

2.1 Обзор подходов к моделированию распространения оптического излучения в биологических тканях 90

2.1.1 Теория вероятностной миграции фотонов 92

2.1.2 Теория Кубелки-Мунка 94

2.1.3 Теория диффузионного приближения 96

2.1.4 Комбинированные аналитические методы 97

2.1.5 Метод Монте-Карло 98

2.2 Численная модель глубины проникновения зондирующего излучения 101

2.3 Аналитическая модель глубины проникновения зондирующего излучения 106

Глава 3. Экспериментальные исследования 111

Глава 4. Разработка метода и устройства диагностики нарушений тканевого метаболизма 120

4.1 Синтез структурной схемы 120

4.2 Вопросы медико-технических требований 124

4.3 Выбор оптимального ПЗС фотоприемника 126

4.4 Разработка модели для решения обратной задачи количественного анализа экспериментальных спектров 127

Заключение 133

Список использованных источников 135

Приложение А – Справки об экспертных оценках и форма опросного листа 151

Приложение Б – Акт об использовании результатов научно-исследовательской работы в БУЗ Орловской области «Орловская областная клиническая больница»... 153

Приложение В – Акт о внедрении результатов научно-исследовательской работы в ООО НПП «ЛАЗМА» 155

Приложение Г – Акт о внедрении результатов научно-исследовательской работы в ООО «НПП «АСТРОН ЭЛЕКТРОНИКА» 156

Приложение Д – Акт об использовании результатов диссертационной работы в ФГБОУ ВО «ОГУ имени И.С. Тургенева» 157

• Экспертная оценка уровня ошибок инструментальной диагностики
• Предварительные экспериментальные исследования взаимосвязи метаболизма и кровотока
• Численная модель глубины проникновения зондирующего излучения
• Разработка модели для решения обратной задачи количественного анализа экспериментальных спектров

Введение к работе

Актуальность работы.Нарушение метаболических процессов в организме человека связано с развитием большого числа заболеваний. Одним из примеров таких патологий являются нарушения, возникающие при прогрессировании и осложнениях сахарного диабета, которые связаны с развитием гипоксии тканей, накоплением токсичных продуктов углеводного обмена и т.п. Однако в арсенале клинициста имеется ограниченное количество инструментальных методов оценки подобных изменений.

В настоящее время проводится множество исследований, направленных на изучение процессов тканевого или клеточного метаболизма с использованием различных методов, регистрирующих флуоресценцию флуорофоров, например, флуоресцентная спектроскопия (ФС).Митохондриальная функция является важным параметром жизнеспособности ткани. Так, например, по показателям активности дыхательной цепи имеется возможность предсказывать гибель клетки, диагностировать состояние тканевой ишемии или говорить о злокачественной активности. Одним из методов оценкимитохондриальной функции является анализсодержания кофермен-тов NADH и FAD, определяемого по интенсивности их эндогенной флуоресценции. Выявление измененийих концентраций методами флуоресцентной спектроскопии является одним из многообещающих направлений invivo диагностикиметаболиче-ских нарушений в биотканях.

Однако определение митохондриальной функции invivo до сих пор является не полностью решенной задачей. Сравнительно мало исследований проводится на органном уровне. Между тем, результаты экспериментов на конкретном органе или участке организма имеют большие шансы быть успешно применены в клинической практике по сравнению с исследованиями на клеточном и субклеточном уровне.В данном направлении относительное распространение получили исследования в рамках так называемого мультипараметрического или мультимодального подхода. Данный подход заключается в использовании нескольких измерительных каналов с целью определения параметров дыхательной цепи (NADH/FAD) нафоне влияющих факторов. Группой А. Маевскогобыли получены убедительные данные по определению митохондриальной функции в тканях мозга. Множество работ в настоящее время направлено на изучение эндогенной флуоресценции миокарда для оценки повреждений, индуцированных ишемией в условиях кардиохирургического вмешательства.

Задача определения параметров дыхательной цепи по соотношению флуоресценции коферментов NADH и FAD в эпителиально-стромальных или эпителиально-дермальных тканях в настоящее время удовлетворительно не решена. Основная проблема, которая может влиять на результаты измерений, заключается внеобходимости учитывать вклад других флуорофоровв итоговый сигнал. Так, например, при сахарном диабете при длительно существующей гипергликемии наблюдается повышение гликирования белков, что сопровождается увеличением так называемых конечных продуктов гликирования (КПГ), участвующих в гликировании коллагена и других белков капиллярной мембраны и кожи. Учитывая, что коллаген является основным компонентом соединительной ткани, накопление КПГ может увеличивать интенсивность флуоресценции исследуемого участка и это необходимо учитывать при интерпретации диагностического результата.Изменения флуоресценции основных

флуорофоровNADH и FAD тесно связаны с кровотоком в большинстве органов тела, что требует также регистрации и анализа гемодинамических параметров. Данному требованию в полной мере удовлетворяет лазерная допплеровская флоуметрия (ЛДФ) – метод оптической неинвазивной диагностики, позволяющий оценивать интенсивность кровотока в микроциркуляторном звене кровеносного русла, а также обнаруживать и исследовать ритмические процессы системы микроциркуляции кро-ви.При этом дополнительные возможности оценки функционального состояния микроциркуляторного русла при исследованиях методами ЛДФ дает применение функциональных проб, например, холодовой, тепловой, окклюзионной и т.п.

Таким образом, на сегодняшний день актуальными задачами диагностики нарушений метаболизма биологических тканей человека являются поиск и обоснование диагностически значимых критериевоценки метаболического состояния биотканей, базирующихся на совместном использовании различных оптических технологий, а также разработка методов, реализующих данный подход.

Объектомисследования являются метаболические нарушения, возникающие в биологических тканях человека при сахарном диабете.

Предметомисследования являются метод и средствадиагностики метаболических нарушений, возникающих в биологических тканях человека при сахарном диабете.

Целью диссертацииявляется повышение качества диагностики тканевого метаболизма человека на примере нарушений, возникающих в нижних конечностях при сахарном диабете, за счет выявления патологических процессов с меньшей вероятностью ложноотрицательного результата посредством разработки метода и устройства диагностики, основанных на совместном использовании методов флуоресцентной спектроскопии и лазерной допплеровской флоуметрии при тепловых пробах.

Задачамиисследования являются:

1. обзори анализ существующих инструментальных методов оценки метаболических процессов вбиологических тканях человека;

2. обоснование принципа получения диагностической информации о метаболическом состояниитканей человека, заключающегосяв совместном использовании-оптических технологий, таких как ФС и ЛДФ, в том числе при проведении локальных тепловыхпроб, на примере метаболических нарушений, возникающих в биотка-няхчеловека при сахарном диабете;

3. разработка математической моделидля анализа глубины проникновения зондирующего излученияизмерительного устройства, описывающей распространение оптического излучения в мутных биологических средах и учитывающей их мно-гослойность и различные морфологические свойства;

4. проведение теоретических и экспериментальных исследований с целью создания диагностического критерия выявления метаболических нарушений в биотканях человека;

5. разработка метода и устройства диагностики метаболических нарушений-биотканей человека.

Методы исследования.Результаты работы получены на основе математических теорий дифференциального и интегрального исчислений, теории переноса из-

лучения,стохастического моделирования Монте-Карло, диффузионной теории, прикладной математической статистики, экспертного оценивания, методов регрессионного, корреляционного и линейного дискриминантного анализа, методов клинических исследований.

Научная новизнаработы заключается в том, что при решении задачвыявлени-ятканевых метаболических нарушений предложены:

6. математическая модель процесса распространения оптического излучения в мутных биологических средах, основанная на законе Бугера-Ламберта-Бера и теории диффузионного приближения,отличающаяся учетом многослойности структуры биологической ткани и верифицированная с помощью адаптированного к конкретной задаче моделирования Монте-Карло;

7. диагностический критерий оценки метаболического состояния биологических тканей, базирующийся на дискриминантной функции, включающей значение перфузии и амплитуд сигналов флуоресценции на выбранных длинах волн, вычисляемые по данным ФС и ЛДФ, и позволяющий классифицировать состояние кожных покровов нижних конечностей при сахарном диабете на классы отсутствия, наличия или более тяжелой формы метаболических нарушений;

8. метод диагностики нарушений тканевого метаболизма, базирующийся на совместном применении технологий ФС и ЛДФпри локальныхтепловых пробах иот-личающийся возможностью выявления нарушений с помощью предложенного диагностического критерия с меньшей вероятностью ложноотрицательного результата диагностики.

Теоретическая значимость работысостоит в том, что предложена математическая модель процесса распространения оптического излучения в мутных биологических средах, а также метод диагностики нарушений тканевого метаболизма нижних конечностей при сахарном диабете.

Разработанные математическая модель и метод диагностики составили основу для получения результатов, представляющих практическую значимость:

методика диагностики нарушенийтканевого метаболизманижних конечностей, позволяющаяклассифицироватьсостояние кожных покровов нижних конечностей при сахарном диабете;

устройство диагностики нарушений тканевого метаболизма, позволяющее совместно регистрировать интенсивность флуоресценции тканевых флуорофоров ипоказатель микроциркуляции крови иклассифицироватьсо стояние кожных покровов нижних конечностей при сахарном диабете.

Результаты диссертационного исследованияиспользованы в БУЗ Орловской области «Орловская областная клиническая больница», а также приняты к внедрению в ООО НПП «ЛАЗМА» (г. Москва) и ООО «НПП «АСТРОН ЭЛЕКТРОНИКА» (г. Орел), а такжев учебный процесс ФГБОУ ВО «ОГУ имени И.С. Тургенева» при подготовке бакалавров и магистров по направлению «Биотехнические системы и технологии».Отдельные результаты, полученные соискателем, использованы при выполнении работ по темам: «Разработка прибора неинвазивной диагностики для флюоресцентной спектроскопии биоткани»(Договор (Соглашение) № 2249ГУ1/2014 от 18.06.2014; Договор (Соглашение) № 7678ГУ2/2015 от 08.10.2015), финансируемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере; ГЗ-14/9 «Разработка методов и средств контроля для диагностики функцио-

нального состояния системы микроциркуляции крови и концентраций ферментов
биоткани» (2014-2016 гг.), выполняемой в рамках базовой части государственного
задания МинобрнаукиРФ № 310 Госуниверситету-УНПК;№ МК-

7168.2016.8 «Разработка технологии визуализации метаболической активности биологических тканей in-vivo на основе методов флуоресцентной спектроскопии и спектроскопии диффузного отражения» (2016-2017 гг.), выполняемой в рамках гранта Президента Российской Федерации; № 16-32-00662 мол_а «Разработка научных основ оценки митохондриальной функции в эпителиальных тканях методом флуоресцентной диагностики invivo» (2016-2017) и №16-32-50144мол_нр «Исследование влияния морфологии капилляров и скорости кровотока на регистрируемые спектры эндогенной флуоресценции биологических тканей» (2016 г.), выполняемые в рамках грантов РФФИ.

Личный вклад авторазаключается в проведении обзора текущего состояния вопросовдиагностики метаболических процессов в биологических тканях человека, разработке математических моделей, планировании и проведении экспериментальных исследований, разработке аппаратных и программных средств эксперименталь-ныхмакетов предложенных устройств, формулировке требований и разработке метода диагностики нарушений тканевого метаболизма на основании проведенной аналитической работы и математического моделирования.

Положения, выносимые на защиту:

9. математическая модель процесса распространения оптического излучения в мутных биологических средах, основанная на законе Бугера-Ламберта-Бера и теории диффузионного приближенияи верифицированная с помощью адаптированного к конкретной задаче моделирования Монте-Карло, отличающаяся учетом много-слойности структуры биологической ткани, позволяет решать задачу определения глубины зондирования диагностическим устройством;

10. метод диагностики нарушенийтканевого метаболизма нижних конечностей пациентов с сахарным диабетом, включающий регистрацию спектров интенсивности флуоресценции и сигналов ЛДФ при проведении локальных тепловых проб с дорсальной поверхности стопы, а также последующую математическую обработку полученных данных с вычислениемдиагностических критериев,базирующихся на дискриминантной функции, позволяет классифицировать состояние биологических тканей на классы отсутствия,наличия или более тяжелой формы метаболических нарушений с вероятностью ложноотрицательного результата диагностики менее 0,2;

11. устройство, основанное на совместном использовании методов ФС и ЛДФ при локальных тепловых пробах, позволяетвыявлять метаболические нарушенияби-отканей человека.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатовобоснована использованием апробированных и подтвержденных методов и методик обработки результатов измерений, сравнением результатов аналитического моделирования с результатами стохастического моделирования Монте-Карло.Апробация результатов диссертационной работы проводилась на базе эндокринологического отделения БУЗ Орловской области «Орловская областная клиническая больница».

Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на 23международных и 5 всероссийских конференциях, в том числе:III,IV, V-мВсероссийском конгрессе молодых учных (Санкт-Петербург, 2014-2016); XXIII-м

Международном научно-техническом семинаре «Современные технологии в задачах
управления, автоматики и обработки информации» (Алушта, 2014);II, III,
IVSymposium: OpticsandBiophotonics –SaratovFallMeeting(Саратов, 2014-

2016);InternationalCongress SPIE «PhotonicsWest», ConferenceBiOS (Сан-Франциско,
США, 2015-2017);19-й Международной Пущинской школе-конференции молодых
ученых – Биология – наука ХХI века (Пущино, 2015); X-й Международной конфе
ренции «Микроциркуляция и гемореология (Клиника и эксперимент: из лаборатории
к постели больного)» (Ярославль, 2015);V

InternationalSchoolandConferenceonPhotonics «PHOTONICA2015» (Белград, Сербия,
2015),3^RDFast-DotSummerSchool «PhotonicsMeetsBiology» (Крит, 2015); VI-й Всерос
сийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровооб
ращения (Москва, 2016);XII-й Международной научной конференция «Физика и ра
диоэлектроника в медицине и экологии» ФРЭМЭ’2016 (Суздаль,
2016);InternationalconferencePhysica.SPb/2016 (Санкт-Петербург,
2016);SummerSchoolonOptics&Photonics (Оулу, Финляндия,
2017);EuropeanConferencesonBiomedicalOptics (Мюнхен, Германия, 2017); Всерос
сийской научно-практической конференции с международным участием «Актуаль
ные проблемы эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2017);IV MESO-BRAIN
SummerSchool «PhotonicsMeetsBiology» (Таррагона, Испания, 2017).

Публикации.По теме диссертации опубликованоболее40научных работы, в том числе21публикация в ведущих рецензируемых научных изданиях, рекомендо-ванныхВАК, получено свидетельство о регистрации программы для ЭВМ.

Структура и объем диссертационной работы.Работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка использованных источников, включающего 170 наименований, 6приложений и изложена на 195страницах машинописного текста, содержит70иллюстраций, 20таблиц.

Экспертная оценка уровня ошибок инструментальной диагностики

Как показал проведенный обзор, для диагностики осложнений СД в настоящее время применяется множество разнообразных инструментальных методов. Практически все они основаны на оценке наличия макро- и микроциркуляторных нарушений. Однако зачастую практикующие врачи сталкиваются с высокой вероятностью ошибок инструментальной диагностики.

Примем за нулевую гипотезу предположение, что обследуемый человек (пациент) имеет макро- и микроциркуляторных нарушения нижних конечностей, соответственно альтернативная гипотеза будет обозначать отсутствие у обследуемого человека подобных нарушений нижних конечностей. В этом случае ошибка первого рода (ложноположительный результат инструментальной диагностики) заключается в ложном признании наличия нарушений у пациента с использованием инструментальных средств и методов диагностики. Ошибка второго рода (ложно-отрицательный результат инструментальной диагностики) заключается в ложном признании отсутствия нарушений у пациента с использованием инструментальных средств и методов диагностики.

Ошибки первого и второго рода не всегда оказываются эквивалентными на практике. Например, пропуск возможного заболевания при диспансеризации населения более опасен, чем ложная тревога [27]. Очевидно, что применительно к диагностике макро- и микроциркуляторных нарушений нижних конечностей задача минимизации ошибок второго рода принимает первостепенное значение, поскольку своевременная диагностика и адекватно назначенная терапия позволяют отдалить или даже избежать наступление тяжелых осложнений.

Для установления текущего уровня вероятности ложноотрицательного результата инструментального обследования было принято решение использовать метод экспертных оценок. С использованием данного метода можно не только установить текущий, но и обосновать желаемый уровень ошибок инструментальной диагностики.

Для достижения указанных целей использовался один из методов получения индивидуального мнения членов экспертной группы – метод анкетного опроса. Данный тип методов основан на предварительном сборе информации от экспертов, опрашиваемых независимо друг от друга, с последующей обработкой полученных данных. К основным преимуществам индивидуального экспертного оценивания можно отнести оперативность, возможность сбора большого объема информации за достаточно короткий срок, возможность в полной мере использовать индивидуальные способности эксперта, отсутствие давления авторитетов, а также низкие затраты на экспертизу [28]. При этом подбор достаточного количества квалифицированных, компетентных и добросовестных экспертов позволяет избежать субъективности коллективного мнения экспертной группы.

Известно, что при малом числе экспертов появляется излишнее влияние оценки каждого эксперта, а при большом числе трудно вырабатывать единое мнение и снижается роль крайнего мнения, которое не всегда может быть ошибочным [28]. Для определения минимального числа экспертов TVmm применяли формулу [28]

На основании формулы (1.1) с учетом предельной ошибки Ъ = 0,2 установлено минимальное число экспертов TVmin = 10 человек (при условии, что компетентность экспертов приблизительно одинакова) [29].

В экспертную группу входили 10 врачей (ревматологи, эндокринологи, рентгенологи, врачи ультразвуковой диагностики), профессиональная деятельность которых непосредственно связана с оценкой макро- и микрососудистых нарушений нижних конечностей. Особое внимание уделялось тому, чтобы каждый член экспертной группы в клинической практике регулярно сталкивался с проблемами инструментальной диагностики подобных нарушений и мог количественно оценить уровень вероятности ложноотрицательного результата диагностики применяющимися методами (реовазография, УЗДГ, ангиография, тепловидение и др.). Справки, подтверждающие участие экспертов в оценке качества инструментальной диагностики макро- и микрососудистых нарушений, приведены в приложении А.

Единственной приемлемой формой получения экспертной информации в рассматриваемом случае является количественная оценка, представляющая собой суждение эксперта о предполагаемых абсолютных значениях текущего и желаемого уровня вероятности ложноотрицательного результата инструментальной диагностики.

Для реализации анкетного опроса членов экспертной группы составлен опросный лист, содержащий цель и задачи проведения экспертного оценивания, основные определения, используемые при формулировке вопросов и, непосредственно, сам перечень вопросов с вариантами ответов. Форма опросного листа представлена в приложении Б. Формализованные результаты экспертного опроса сведены в таблицу 1.1.

При обработке экспертной информации решались задачи оценки коллективного мнения экспертной группы и согласованности мнений экспертов.

Группу специалистов, выступающих в роли экспертов, иногда отождествляют с измерительным прибором, имеющим случайные и систематические ошибки измерения [28]. В этом случае коллективное мнение экспертной группы можно представить как результат многократного измерения с равноточными значениями отсчета.

Результатом многократного измерения с равноточными значениями отсчета является среднее арифметическое Qj n отдельных независимых значений результата измерения, составляющих массив экспериментальных данных [30]:

Предположим, что оценки экспертов подчиняются нормальному закону распределения вероятности. Известно, что при небольшом объеме экспериментальных данных среднее арифметическое значение результата измерения, подчиняющегося нормальному закону распределения вероятности, само подчиняется закону распределения вероятности Стьюдента с тем же средним значением. Поэтому для обнаружения и исключения ошибок воспользуемся критерием Романовского, согласно которому отбрасывается сомнительное значение результата измерения, отличающееся от среднего арифметического Qj больше чем на tSQ j , где SQ j – среднеквад-ратическое отклонение результата измерения, t – коэффициент Стьюдента (для n = 10 и доверительной вероятности P = 0,95 t = 2,3). Среднеквадратическое отклонение результата измерения вычислим по формуле [30]:

Задавшись доверительной вероятностью Р = 0,95, найдем половину доверительного интервала є,. = %, где t = 2,3 - коэффициент Стьюдента, а также определим нижнюю Q. - є и верхнюю Q + s границы доверительного интервала (таблица 1.2).

Согласованность мнений экспертов при количественной оценке какого-либо объекта можно оценить с помощью коэффициента вариации ,-, который определяет относительную величину разброса оценок экспертов по отношению к среднему значению коллективной оценки и рассчитывается по формуле [28, 31]:

Согласованность экспертов признают удовлетворительной, если все j 0,3 и хорошей, если все j 0,2. Данные таблицы 1.2 свидетельствуют о том, что согласованность мнений группы экспертов удовлетворительная.

Таким образом, коллективное мнение экспертов по двум вопросам можно сформулировать следующим образом:

1) Текущий уровень вероятности ложноотрицательного результата инструментального обследования пациентов с осложнениями сахарного диабета находится в интервале 0,27…0,37 с доверительной вероятностью 0,95.

2) Максимально допустимый уровень вероятности ложноотрицательного результата инструментального обследования пациентов с осложнениями сахарного диабета находится в интервале 0,14…0,21 с доверительной вероятностью 0,95.

Таким образом, актуальной задачей практической медицины является совершенствование существующих и разработка новых методов и устройств диагностики как непосредственно макро- и микрососудистых нарушений, так и иных осложнений СД, позволяющих выявлять эти нарушения с вероятностью ложноот-рицательного результата не более 0,2.

Предварительные экспериментальные исследования взаимосвязи метаболизма и кровотока

Целью данного этапа работы была оценка возможностей совместной регистрации параметров ФС и ЛДФ для анализа адаптивных способностей микроцир-куляторного русла с использованием индикаторов в виде показателя нутритивного кровотока и окислительно-восстановительного соотношения RR в физиологическом покое и при функциональной нагрузке (окклюзионный тест). Для этого были проведены экспериментальные исследования взаимосвязи между RR, определяемым методом ФС и нутритивным кровотоком, определяемым методом ЛДФ.

Экспериментальное исследование проводилось на предплечье правой руки (рисунок 1а) на 30 условно здоровых добровольцев-мужчин одного и того же возраста (19-21 лет) с европейским этническим типом кожи. Здесь объемный расход крови в значительной степени связана с метаболизмом ткани, нежели с процессами терморегуляции (например, как на ладонной поверхности пальцев). В качестве инструментов для регистрации перфузии (методом ЛДФ) и спектров флуоресценции (методом ФС) использовалось оборудование серии «ЛАКК» (ООО НПП «ЛАЗМА» (Россия) [97, 98]. Устройство «ЛАКК-02» (длина волны зондирования – 1064 нм) был использован для измерения перфузии (Im – показатель микроциркуляции) и последующей оценки уровня нутритивного кровотока (Imn). Спектр флуоресценции был зарегистрирован с помощью флуоресцентного канала комплекса «ЛАКК-М» на двух длинах волн возбуждения флуоресценции эндогенных биомаркеров NADH и FAD – 365 нм и 450 нм соответственно. Для одновременной записи оптических параметров волокна устройств были объединены специально разработанной оснасткой.

Исследование состояло из 4-х этапов (рисунок 5б): базальное состояние (4 мин запись перфузии), искусственная ишемия (окклюзия в течение 3 мин), реактивная гиперемия (3 мин) и фаза восстановления (отдых в течение 15 мин). Окклю-зионный тест (ОТ) проводили по стандартной методике с давлением 220 мм рт.ст. на плече (типичный пример ЛДФ-граммы во время ОТ показанной на рисунке 2). В первых 3-х стадиях производится запись одной пары спектров флуоресценции NADH (на длинах волн 460-470 нм) и FAD (на длине волны 510 нм) на 2-х длинах волн возбуждения соответственно (рисунок 3), на 4-й стадии релаксации производится 5 парных измерений спектров флуоресценции каждые 3 мин. Общее время одного эксперимента составляло 25 мин.

Для оценки колебательных компонент перфузии (в соответствии с методологией11), был использован спектральный вейвлет-анализ колебаний (программное обеспечение LDF 3.0.2.384, «ЛАЗМА», Россия). Эта программа использует непрерывное вейвлет-преобразование Морле [99]. Исследование было выполнено при температуре окружающей среды 21-22 С в положении сидя после 30 минутного отдыха.

После анализ окислительно-восстановительных отношений RR, рассчита-ных по формулам (1.17-1.20), были отобраны для дальнейшего анализа данные формулы (1.19), так как они имеют наименьший разброс.

Полученные зависимости изменения соотношения RR во время эксперимента были разделены на 3 группы с типичными ответами соответственно: уменьшение (рисунок 1.27), увеличение (рисунок 1.28) и почти без изменений (рисунок 1.29).

На рисунке 1.30 представлены зависимости редокс-отношения от нутритив-ного кровотока по усредненным данным для ранее выделенных 3-х групп волонтеров: 1 – для группы с увеличением RR при окклюзионной пробе, 2 – для группы с уменьшением RR при окклюзионной пробе и 3 – отсутствие изменения RR при ок-клюзионной пробе.

Для оценки адаптивных возможностей добровольцев нами был предложен критерий, связывающий динамику изменения редокс-отношения в стадии окклюзии и релаксации. Изменения редокс-отношения для каждой стадии оценивалось как разность RR3 до и вовремя окклюзии и в стадию релаксации

Так, например, у добровольца №6 из первой подгруппы (рисунок 1.27) видны большие колебания в метаболической активности (RR). Этот процесс описывается большим показателем предложенного критерия, а именно AM=0,1. Однако, у добровольца №2 той же подгруппы подобных колебаний не наблюдается, чему соответствует очень низкое значение предложенного критерия AM=0,003.

Стоит отметить, в фазе восстановления мы наблюдали два типа – быстрое восстановление нормального уровня метаболизма (RR) и медленное восстановление или поддержание высокого уровня обмена веществ по сравнению с исходными значениями. Второй вариант показывает снижение адаптационных возможностей МТС.

Следует также отметить, что у большинства исследованных добровольцев отмечается высокая динамика восстановления редокс-отношения в первой стадии релаксации, что вполне может согласоваться с молодым возрастом испытуемых и отсутствием каких-либо заболеваний.

С помощью неинвазивных ЛДФ и ФС методов показали связь нутритивного кровотока и редокс-отношения RR. Скорость изменения метаболизма в фазе окклюзии и реперфузии и продолжительность фазы восстановления могут быть критерием для оценки адаптационных возможностей МТС, которая имеет практическое значение для физиологии и медицины.

Были получены предварительные результаты исследования комплексного подхода к диагностике состояния биологической ткани. Положительная связь между нутритивным кровотоком и RR ткани кожи наблюдается. Положительные результаты этих экспериментов указывают на необходимость продолжения дальнейших исследований, так как это приведет к улучшению методической и инструментальной базы для использования технологии флуоресцентной спектроскопии в медицине.

Численная модель глубины проникновения зондирующего излучения

Вследствие сложности реальных условий зондирования, а также сложной комбинированной структуры эпителиальных тканей, не представляется возможным получить общее аналитическое решение для оценки объема диагностируемой биологической ткани, которое могло бы имитировать регистрируемое рассеянное оптическое излучение и его взаимодействие с тканями, их структурными аномалиями и/или физиологическими изменениями. В этой связи в данном исследовании был применен метод стохастического Монте-Карло (МК) моделирования. В настоящее время известно ряд реализаций данного метода, используемых для моделирования распространения оптического излучения в оптических тканях. Одним из подходов является использование объектно-ориентированной модели МК [130], которая позволяет описывать фотоны и структурные компоненты ткани как взаимодействующие друг с другом независимые объекты. Таким образом, объект-фотон распространяется через объект-среду (или слой среды) и взаимодействует с ее структурными компонентами, такими как клетки, кровеносные сосуды, коллагеновые волокна и т.д. Такое представление среды объектами позволяет разрабатывать реалистичные модели ткани с трехмерной вариацией биологических структур. Для достижения оптимальной производительности моделирования целесообразно реа-лизовывать параллельную структура вычислений. Это позволяет получить значительный прирост производительности за счет использования таких технологий параллельных вычислений как CUDA (Computer Unified Device Architecture), NVIDIA Corporation. С ее помощью появляется возможность моделировать одновременно тысячи фотонов и не несколько порядков ускорить процесс моделирования.

Необходимо отметить, что диагностический объем при измерениях флуоресценции определяется распределением зондирующего излучения. Это обусловлено тем фактом, что по правилу Стокса, спектр флуоресценции сдвинут в длинноволновую область относительно спектра поглощения того же соединения. При этом известно, что в оптическом диапазоне поглощение излучения в биологической ткани падает с ростом длины волны. Таким образом, для оценки диагностического объема достаточно оценить распределение излучения на длине волны возбуждения флуоресценции.

Для моделирования диагностического объема и глубины проникновения зондирующего излучения применялась модель ткани, имеющая 7 слоев. Данная модель, первоначально была предложена в работе [105]. В таблице 2.2 представлены основные параметры используемой 7-слойной модели кожи.

Рисунок 2а является примером распределения зондирующего излучения, полученного для указанных выше параметров моделирования для длины волны 365 нм. Таким образом, диагностическая глубина составляет по меньшей мере несколько сотен микрон, и включает в себя эпидермис, сосочковый слой дермы и небольшую часть верхних сосудистых сплетений. Диагностический объем по оценкам моделирования составляет порядка 0,2 мм3.

Для длины волны возбуждения 450 нм диагностическая глубина достигает 450-500 мкм и проникает в эпидермис, папиллярную дерму и захватывает большую часть верхних сосудистых сплетений (рисунок 2б). В этом случае диагностический объем приблизительно равен 0,35 мм3.

Проведенное моделирование показывает, что предлагаемый зонд позволяет регистрировать флуоресценцию в эпидермисе, главным образом, благодаря NADH и FAD, и дермы со значительным вкладом от коллагена.

Результаты моделирования для ЛДФ показывают, что значение диагностического объема составляет около 1,8 мм3. Это подтверждает, что зонд разработанного устройства очень чувствителен к изменениям кровотока в папиллярной дерме, верхнем кровеносном сплетении и способен покрывать верхнюю часть ретикулярной дермы (рисунок 2.4).

Разработка модели для решения обратной задачи количественного анализа экспериментальных спектров

Предложено программное обеспечение, реализующее решение обратной задачи определения концентраций тканевых флуорофоров. Реализуемый алгоритм основан на аналитическом решении уравнения теории переноса, описанного во второй главе, для случая распространения флуоресцирующего излучения в мутной биологической среде.

Кожа принимается двухслойной средой, состоящий из слоя эпидермиса толщиной D и полубесконечного дермального слоя. Каждый из этих двух слоев предполагается однородными по отношению к оптическим свойствам, таким как коэффициент рассеяния, поглощения и эффективность флуоресценции.

Волоконно-оптический зонд, находящийся на одном уровне с поверхностью ткани, обеспечивает возбуждение и сбор флуоресценции. Зонд состоит из пучка оптических волокон (числовая апертура NA = 0,22) (рисунок 3.3).

Общая флуоресценция ткани может быть рассчитан как сумма вкладов от двух слоев. В пределах каждого слоя модель должна учитывать распространение возбуждающего света, поглощение флуорофоров (задается коэффициентом поглощения af), преобразование во флуоресценцию (описывается квантовой эффективностью f флуорофора) и далее распространение флуоресцирующего излучения.

Распространение излучения возбуждения и эмиссии зависит от общего поглощения и рассеяния (задается коэффициентами a и s, соответственно), а также фактора анизотропии в пределах каждого слоя g. В диапазоне длин волн интереса ( 350 нм до 650 нм) эти свойства весьма различны для эпидермиса и дермы. Было рассмотрено две различных модели для описания распространения света в двух слоях. Учитывая, что средняя длина свободного пробега = 1/(a + s) для эпидермиса (приблизительно 100-200 мкм) сравнима с его толщиной (как правило, 100-200 мкм) распространение света может быть аппроксимировано с помощью закона Бера [181]. В противоположность этому дермальный слой имеет относительно высокий уровень рассеяния с уменьшением альбедо порядка 0,9 и средней длиной свободного пробега приблизительно 30-50 мкм. В этих условиях теория диффузии обеспечивает хорошее описание распространения света.

Для упрощения рассматривается одномерная геометрия с направлением распространения света перпендикулярно к поверхности ткани. Когда коллимирован-ный возбуждающий свет с интенсивностью I0 падает на эпителиальную поверхность, интенсивность света затухает экспоненциально. Флуоресценция генерируется изотропно на каждом точечном источнике, причем половина лучей распространяется по направлению к поверхности ткани (в –z направлении) и половина в дерму (в +z направлении). Индекс 1 для всех оптических параметров относится к эпидермису. Дермаль-ные оптические параметры указаны с индексом 2.

Эффективность флуоресценции (jv ф/= є/ С/ -фу) является аддитивной, когда присутствуют несколько флуорофоров. В уравнении (3.5) разные флуорофоры обозначены индексом к. Fe (z = 0) является фактически полусферическим потоком в направлении +z, и доля этого света, который собирается с помощью волоконно-оптического зонда p1detected аппроксимируется отношением RNA телесного угла с числовой апертурой волокна к телесному углу полусферы ті/2.

При выведении формулы было использовано приближение -Эддингтона для того, чтобы достичь лучшего описания фазовой функции рассеяния вперед в дермальном слое [157].

А(em) и C2(em) являются общим и частным решением уравнения диффузии [142, 156, 160, 161]. Свет затем затухает, возвращаясь обратно через эпидермис на поверхность ткани.

Часть возбуждающего света, попадающего в дерму, отражается обратно к поверхности ткани. Обратно рассеянный свет возбуждения /;- может быть вычислен по формуле (3.7) с дермальными оптическими параметрами при длине волны возбуждения. Так как свет проходит обратно через эпидермис, он может возбудить дополнительную эпидермальную флуоресценцию

Также двухслойная модель с применением алгоритмов фиттинга экспериментальных данных позволяет решать обратную задачу оценки концентрации флуорофоров.