Исследование механических свойств белковых комплексов Кононова Ольга Геннадьевна

Содержание к диссертации

Введение

1 Обзор белковых ассамблей 16

1.1 Вирус Cowpea Chlorotic Mottle Virus 16

1.2 Микротрубочки 18

2 Обзор существующих вычислительных методов для описания механики биомолекул 21

2.1 Метод конечных элементов, метод нормальных мод, полноатомное моделирование молекулярной динамики 21

2.2 Упрощенные (крупнозернистые) модели 24

3 Крупнозернистая модель на основе нативной топологии 25

3.1 Наноиндентирование in silico: обоснование использования крупнозернистого моделирования для описания биомолекулярных ассамблей 25

3.2 Модель Саморганизующегося Полимера 26

3.3 Параметризация модели СОП для капсида CCMV 29

3.4 Параметризация модели СОП для полимера МТ 30

3.5 Программный пакет SOP-GPU 31

4 Наноманипулирование in vitro и in silico 33

4.1 Динамическая силовая спектроскопия на одной частице 33

4.2 Метод наноиндентирования in silico з

5 Биомеханика капсида CCMV 37

5.1 Силовое наноиндентирование in silico капсида CCMV 37

5.2 Механические свойства CCMV зависят от локальной симметрии 39

5.3 Термодинамические характеристики процесса индентирования CCMV 46

5.4 Механическая реакция капсида в зависимости от геометрии приложенной силы 47

5.5 Динамика CCMV в равновесии и вдали от равновесия 48

5.6 Основные выводы и обсуждение результатов исследования биомеханики CCMV 52

6 Биомеханика полимера МТ 60

6.1 Силовое наноиндентирование in silico полимера МТ 60

6.2 Структурные переходы в полимере МТ под воздействием внешнего механического напряжения 62

6.3 Механизм деформации и коллапса МТ 64

6.4 Термодинамика тубулиновых взаимодействий в полимере МТ 66

6.5 Определение жесткости при изгибе протофиламентов и полимера МТ 70

6.6 Основные выводы и обсуждение результатов исследования биомеханики МТ 71

7 Аналитическая модель деформации биологической частицы 77

7.1 Обоснование разработки аналитической модели 77

7.2 Определение степеней свободы деформируемой частицы 80

7.3 Модель Флуктуирующих Нелинейных Пружин 83

7.4 Применение модели Флуктуирующих Нелинейных Пружин 87

7.5 Обсуждение полученных результатов 91

Заключение

Список литературы

• Микротрубочки
• Упрощенные (крупнозернистые) модели
• Модель Саморганизующегося Полимера
• Термодинамические характеристики процесса индентирования CCMV

Введение к работе

Актуальность темы исследования

Большие белковые супрамолекулярные комплексы обладают уникальными способостями самостоятельно собираться, разбираться, изменять свою форму и выполнять самостоятельное восстанавление под влиянием контролиру-емного механизма. Эти особенности играют фундаментальную роль в биологии и детальное изучение таких биомолекулярных систем позволяет решить ряд прикладных задач в области биофизических наук.

Одним из наиболее ярких примеров комплексных биомолекулярных структур являются вирусы. Вирусы представляют собой биологические инфицирующие нанострукутуры, которые состоят из нуклеиновой кислоты, упакованной внутри белковой оболочки — капсида. Биомедицинское значение вирусов как инфицирующих агентов очень велико. Они могут найти применение во многих сферах. Действительно, их наноразмеры, умение самостоятельно собираться, а также возможность изменять свои свойства на генетическом уровне, делают вирусные капсиды привлекательным материалом для биотехнологического использования. Например, в наномедицине их можно использовать в качестве переносчиков генетического материала, а также в качестве биотехнологических и индустриальных биореакторов уникальных наномет-ровых размеров. В связи с этим, изучение динамических, энергетических и биомеханических свойств вирусов и вирусоподобных частиц имеет огромное практическое значение.

Другой пример биомолекулярных ассамблей — это полимеры микротрубочек (МТ), которые являются главными стержневыми компонентами и важными структурами, определяющими архитектуру клетки, ее полярность и движение хромосом в процессе деления клетки. МТ стабилизируются посредством продольных и поперечных связей между своими субъединицами — тубулинами. Динамика МТ, а именно, их способность подвергаться случайному циклу полимеризации и деполимеризации, играет видную роль во многих клеточных процессах. Тем не менее, до сих пор недостаточно изучена термодинамика поперечных и продольных связей и физические свойства продольных рядов тубулинов, называемых протофиламентами МТ.

Одним из экспериментальных способов изучения больших белковых комплексов, является их наноиндентирование методом атомно-силовой микроскопии (АСМ; англ. Atomic Force Microscopy, AFM). Несмотря на то, что эта технология обладает достаточно высоким уровнем разрешения, она при этом имеет некоторые недостатки: 1) невозможно определить точное положение молекулы, которая подвергается наноиндентированию; 2) отсутствует четкое

изображение объекта после деформации зондом АСМ; 3) в результате этого невозможно определить энергетические характеристики, относящиейся к конкретным событиям в процессе наноиндентирования.

В данной диссертации предлагается многоуровневый подход моделирования, который мы назвали "наноиндентирование in silico". Данный метод позволяет исследовать биомеханику биомолекулярных частиц на компьютере. Метод совмещает в себе моделирование молекулярной динамики (МД) атомарной структур биомолекулярных частиц, а также моделирование динамики Ланжевена их крупнозернистых моделей на основе нативной топологии. Этот уникальный "эксперимент" in silico предоставляет детальное отображение всего процесса деформации биомолекулы путем силового сдавливания, которое можно сравнивать с результатами АСМ эксперимента и использовать в качестве дополнения к ним. Такое моделирование можно применять для углубленного изучения процессов возникновения механической "усталости" в белковых ассамблеях и их структурных коллапсов, которые сложно объяснить с помощью современных экспериментальных методов.

В данной диссертации показывается применение указанного подхода наноиндентирования in silico на примере исследования биомеханических свойств вирусного капсида Cowpea Chlorotic Mottle virus (CCMV) и полимера микротрубочки (МТ). По результатам этого эксперимента была разработана аналитическая модель, способная качественно интерпретировать спектральные линии силы-деформации, получаемые с помощью экспериментов по АСМ. Эта теория связывает наклон, критическую силу, критическую деформацию FX кривых с физическими характеристиками структуры, геометрией и общей формой частицы и индентора. Полученная модель была успешно опробованная на лабораторных данных, полученных для разных вирусных частиц.

Цели и задачи работы

Целью данной работы является а) разработка вычислительной методологии, позволяющей исследовать механические свойства больших белковых ассамблей, и Ь) ее применение к исследованию биофизических свойств вирусных капсидов и полимеров микротрубочек; а также для с) создания аналитической модели деформации больших белковых систем для интерпретации результатов экспериментов по силовой спектроскопии.

Задачи работы:

1. Разработка численного подхода наноинденирования in silico, основанного на многоуровневом молекулярном моделировании, который будет являться компьтерным аналогом эксперимента по атомно-силовой микро-

скопии. Данный подход будет являться дополнением к существующему пакету SOP-GPU, использующего ускорение графических процессоров для выполнения моделирования больших белковых структур.

1. Применение разработанной методологии для проведения эксперимента по in silico наноиндентированию вирусного капсида CCMV, сравнение полученных результатов с экспериментальными данными.

2. На основе результатов, полученных в ходе численного эксперимента по наноиндентированию капсида CCMV и согласованных с экспериментальными данными, сделать детальное описание биомеханики вирусного капсида, подверженного внешней силовой нагрузке, а также определить структурные и термодинамические характеристики данного процесса, которые невозможно получить из эксперимента in vitro.

3. Применить методологию многоуровневого моделирования и наноиндентирования in silico к полимеру МТ и для деформации одного протофи-ламента МТ разной длины. Полученные результаты сравнить с ранее опубликованными данными.

4. Результаты, полученные из эксперимента по численному моделированию силового наноиндентирования полимера МТ и деформации прото-филамента, изпользовать для разрешения структурных переходов, возникающих в МТ под воздействием внешней механической силы, а также для определения термодинамических характеристик тубулиновых интерфейсов в МТ и жесткости при изгибе одного протофиламента.

5. Использовать результаты силового наноиндентирования in silico для проведения детального структурного анализа капсида CCMV и полимера МТ, подверженных внешнему механическому воздействию, чтобы определить основные степени свободы, которые вносят вклад в динамику деформации белковых ассамблей с регулярной геометрией. Разработать теоретическую модель для описания обнаруженных степеней свободы.

6. Основываясь на проведенном анализе, разработать и реализовать аналитическую модель, способную описывать механический ответ системы на внешнюю сдавливающую деформацию, а также определять наиболее важные механические характеристики биомолекул и предсказывать предел их прочности.

8. Разработанную модель применить для описания спектров силы-деформации для различных вирусных капсидов, полученных в лаборатории. Определить механических характеристики этих систем, сравнить с опубликованными ранее результатами.

Научная новизна

Новые современные эксперименты позволяют широко исследовать уникальные физические свойства разнообразных биологических ассамблей. Несмотря на это, из-за сложности организации и больших размеров этих систем, эти эксперименты предоставили большое количество данных, которые почти невозможно корректно интерпретировать без какой-либо начальной информации о ландшафтах энергии. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали новый подход наноиндентирования in silico, который совмещает многомасштабное моделирование (полноатомное моделирование молекулярной динамики и крупнозернистое моделирование динамики Ланжевена) и высокопроизводительные вычисления (ускоренные на графических процессорах), чтобы исследовать физико-химические свойства и биомеханику больших биомолекулярных ассамблей. В отличие от предыдущих попыток моделирования, которые были основаны на удобных вычислительных методах, мы сможем провести моделирования больших биологических систем, состоящих из '-ЛО⁴ —10⁵ аминокислот, на экспериментальной шкале времени 30—60 мс.

Таким образом, данная методология наноиндентирования in silico дает нам возможность генерировать теоретически полный спектр силы-смещения, который содержит всю информацию о механических свойствах рассматриваемой системы. Ни один из существующих методов не обладает такой возможностью. Сравнение экспериментов и моделирования позволяет впервые соотнести динамические структурные особенности вирусного капсида/МТ в режиме их переходов в состояние коллапса с их биомеханикой на нанометро-вой шкале, а также разрешить механические и термодинамические характеристики этих структур, которые были недоступны ранее.

Теооретическая и практическая значимость работы

Вирусные капсиды имеют потенциальное применение во многих сферах. В наномедицине они могут служить в качестве поставщиков генов или медикаментов, а также играть роль наноразмерных биореакторов в биотехнологиях. Поэтому понимание детальной динамики, энергетики и биомеханических свойств вируснах частиц представляет большой научный интерес и поможет

сформулировать основные концепции рационального дизайна и проектирования нанореакторов и нанокомпартментов на основе различных белковых оболочек.

Сложность структуры МТ препятствует использованию традиционных кинетических и термодинамических экспериментальных подходов для непосредственного измерения ландшафтов свободной энергии связей между их составными компонентами тубулинами. Форма профилей энергий и даже геометрия и количество участков связывания в моделях МТ до сих пор являются спорными. Физические свойства индивидуальных тубулиновых протофила-ментов также не были до сих пор определены. Величину изгибной жесткости протофиламента важно знать потому, что эти значения имеют непосредственное применение в механизме генерации силы в процессе деполимеризации МТ. Углубленное биофизическое понимание этих биологических функций было затрудненно ввиду отсутствия точной качественной информации о прочности взаимодействий между тубулинами и жесткости при изгибе протофиламента МТ.

Результаты, полученные с помощью моделирования процесса наноинден-тирования для систем вирусного капсида и МТ будут применены для разработки аналитически простой физической модели, которая позволит описывать деформацию, уплощение (прогиб) и переход в состояние структурного коллапса в биологических частицах, обладающих регулярной геометрией. На данный момент существует большое количество экспериментальных спектров силы-деформации для различных систем, которые требуют смысловой интерпретации. При этом не существует моделей, способных полноценно описывать эти результаты, что ограничивает количество информации, которую можно получить из экспериментальных и теоретических спектральных кривых. Модель, которую мы разработали, позволяет связать наблюдаемые (макроскопические) величины с микроскопическими структурными и геометрическими характеристиками. Эта модель также позволяет исследователям описывать форму спектров силы-деформации, полученных из экспериментов по силовой спектроскопии на отдельных биологических частицах.

Методология и методы исследования

Для решения поставленных задач использовалась методология математического и численного моделирования. Вычислительные эксперименты проводились с применением высокопроизводительных вычислений, а анализ их результатов — при помощи методов механики сплошных сред и математической статистики.

Положения, выносимые на защиту

Положения, выносимые на защиту, отражены в основных результатах работы, приведенных в конце автореферата.

Соответствие паспорту специальности 05.13.18

Работа содержит все необходимые компоненты специальности 05.13.18 — математическое моделирование, численные методы и комплексы програм:

1. Математическое моделирование: Разработана аналитическая физическая модель деформации сферической белковой оболочки под действием внешней механической силы.

2. Численные методы: Разработаны численные процедуры расчета движения сферического индентора и его взаимодействия с биомолекулой с использованием гибридной архитектуры (центральных процессоров + графических сопроцессоров).

3. Комплексы программ: Разработаны новые вычислительные модули для расчета механических характеристик белковых оболочек, которые используются в пакете программ SOP-GPU.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты диссертации опубликованы в 8 работах, из которых 6 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ [1, 3, 4, 6, 7, 8], были доложены, обсуждены и получили одобрение специалистов на следующих научных конференциях:

4. Научная конференция Московского физико-технического института -Всероссийская молодёжная научная конференция с международным участием "Проблемы фундаментальных и прикладных, естественных и технических наук в современном информационном обществе" (МФТИ, Долгопрудный, 2011);

5. International Workshop "Computational and Theoretical Modeling of Biomo-lecular Interactions" (Dubna, Russia, 2013);

6. Albany 2015: The 19th Conversation (University at Albany SUNY, Albany, NY, USA, 2015);

Микротрубочки

Наш подход наноиндентирования in silico в составе программного пакета SOP-GPU позволяет отобразить ландшафт свободной энергии, лежащий в основе деформации вирусного капсида/МТ Эту информацию невозможно получить из экспериментов и других вычислительных методов. Преимущество данного подхода состоит в том, что он позволяет исследовать динамику интересуемой биологической частицы за пределами режима равновесия и упругих деформаций в режиме перехода в состояние коллапса, где происходят глобальные изменения формы системы. Таким образом, данная методология наноиндентирования in silico дает нам возможность генерировать теоретически полный спектр силы-смещения, который содержит всю информацию о механических свойствах рассматриваемой системы. Насколько нам известно, ни один из существующих методов [30-35] не обладает такой возможностью. Сравнение экспериментов и моделирования позволяет впервые соотнести динамические структурные особенности вирусного капсида/МТ в режиме их переходов в состояние коллапса с их биомеханикой на нанометровой шкале.

На сегодняшний день остается невозможным определение энергий межтубулино-вых связей и жесткости при изгибе протофиламентов МТ, используя только экспериментальные подходы. Абсолютные значения энергий поперечных и продольных взаимодействий до сих пор неизвестны, а опубликованные оценки энергий диссоциации поперечных и продольных связей и изгибной жесткости тубулинового про-тофиламента варьируются в пределах порядка величины [36-40]. Мы определили энергии поперечных/продольных взаимодействий, используя моделирования деформаций под действием внешней силы, а также релаксацию системы при движении зонда кантилевра в обратном направлении, для оценки обратимой работы. Мы так 12 же определили изгибную жесткость протофиламентов, имеющих размер 8—24 ту-булиновых димеров в длину, используя моделирование деформации изгибания. Это дало нам возможность предложить механистическое понимание процесса формирования и диссоциации тубулиновых связей внутри МТ, а также установить важные термодинамические ограничения на теоретические модели динамики МТ.

Теооретическая и практическая значимость работы

Вирусные капсиды имеют потенциальное применение во многих сферах. В на-номедицине они могут служить в качестве поставщиков генов или медикаментов, а также играть роль наноразмерных биореакторов в биотехнологиях. Поэтому понимание детальной динамики, энергетики и биомеханических свойств вируснах частиц представляет большой научный интерес. Механистическое понимание тех структурных изменений, которые определяют биомеханическую реакцию вирусного капсида CCMV на внешнюю сдавливающую силу в процессе наноиндентирования позволит нам также предсказать ответную реакцию системы на внешнее силовое воздействие и соответствующие ландшафты свободной энергии для других вирусов и вирусоподобных нанокомпартментов, имеющих икосаэдральную симметрию. Новое понимание динамики и физических свойств капсида CCMV поможет сформулировать основные концепции рационального дизайна и проектирования нанореакторов и нанокомпартментов на основе различных белковых оболочек.

Сложность структуры МТ препятствует использованию традиционных кинетических и термодинамических экспериментальных подходов для непосредственного измерения ландшафтов свободной энергии связей между их составными компонентами тубулинами. Физические свойства индивидуальных тубулиновых протофиламентов также не были до сих пор определены из-за отмеченной выше хрупкости их важных промежуточных структур в процессе разборки. Несмотря на то, что взаимодействия между тубулинами являлись предметом многих исследований, на данный момент не существует устоявшегося соглашения относительно значений энергий связей между тубулинами, а также изгибной жесткости тубулинового протофиламента. В процессе разборки МТ поперечные связи рвутся раньше продольных [41]. Это и другие наблюдения предполагают, что продольные связи между тубулинами прочнее чем поперечные [42], но абсолютные значения энергий их взаимодействия неизвестны. Форма профилей энергий и даже геометрия и количество участков связывания в моделях МТ до сих пор являются спорными [36-39, 43]. Опубликованные ранее оценки изгибной жесткости протофиламента МТ также варьируются в пределах порядка величины [40]. Величину изгибной жесткости протофиламента важно знать потому, что эти значения имеют непосредственное применение в механизме генерации силы в процессе деполимеризации МТ. Углубленное биофизическое понимание этих биологических функций было затрудненно ввиду отсутствия точной качественной информации о прочности взаимодействий между тубулинами и жесткости при изгибе протофиламента МТ.

Результаты, полученные с помощью моделирования процесса наноиндентирова-ния для систем вирусного капсида и МТ будут применены для разработки аналитически простой физической модели, которая позволит описывать деформацию, уплощение (прогиб) и переход в состояние структурного коллапса в биологических частицах, обладающих регулярной геометрией, например, сфера (вирусы и бактериальные нанокомпартменты) или цилиндр (МТ, некоторые вирусы). На данный момент существует большое количество экспериментальных спектров силы-деформации (FX) для различных систем, которые требуют смысловой интерпретации. При этом, не существует моделей, способных полноценно описывать эти результаты, что ограничивает количество информации, которую можно получить из экспериментальных и теоретических спектральных кривых. Основные характеристики, которые можно определелить из имеющихся FX спектров это коэффициент жесткости и модуль Юнга. Однако, наши результаты, полученные для оболочки CCMV, показали, что коэффициент жесткости капсида меняется с изменением глубины индентирования, являясь функцией, зависящей от упругих свойств системы и от размера и геометрии индентора (зонда кантилевра). Намного больше информации может быть получено из анализа формы спектра. Например, пик силы, который соответствует пределу механической прочности, можно связать с функцией распределения вероятностей силы разрыва/разлома, что в свою очередь зависит от прочности/природы белок белковых взаимодействий между различными структурными субъединицами (кап-сомерами, мономерами и димерами тубулинов). Кроме того, поведение FX кривых в окрестности точки перехода в состояние коллапса, а именно, наклон падение силы, может характеризовать механическую природу рассматриваемой системы, будет ли она поддаваться внешней нагрузке или сразу ломаться. Таким образом, в данной работе показано, что существует прямое соответствие между экспериментально наблюдаемыми величинами и внутренними биомеханическими свойствами системы. Модель, которую мы разработали, позволяет связать наблюдаемые (макроскопические) величины с микроскопическими структурными и геометрическими характеристиками. Эта модель также позволяет исследователям описывать форму спектров силы-деформации, полученных из экспериментов по силовой спектроскопии на отдельных биологических частицах

Упрощенные (крупнозернистые) модели

Таким образом получается, что нет другого способа преодолеть ограничения, описанные выше, кроме как напрямую моделировать динамику деформации вирусной частицы. Чтобы уменьшить число степеней свободы, некоторые исследователи предложили использовать крупнозернистое описание полипептидной цепи. В этих методах группы атомов или целые мономеры заменяются одним "шариком" (центром), и взаимодействия между шариками задается с помощью функции потенциальной энергии [37, 63]. Стохастическая динамика системы получается путем пропагирова-ния вперед по времени уравнения движения Ланжевена для каждого шарика. Для создания крупнозернистого представления вирусного капсида был предложен метод основанный на разбиении Вороного [35, 64]. И хотя этот метод представляет собой значительный шаг вперед, такой подход объединяет несколько аминокислот в один шарик, что уменьшает структурное разрешение частицы. Чтобы преодолеть эту проблему, были использованы различные крупнозернистые модели, в основе которых находятся Са-атомы, то есть каждая аминокислота представлена своим атомом Са. Этот метод использовался для моделирования наноиндентирования капсида CCMV и капсида Cowpea Mosaic Virus [65] путем сдавливания оболочек между двумя плоскостями. Однако, так как в этом моделировании скорость измнения внешней силы на три порядка выше чем в аналогичном эксперименте, результаты экспериментов in vitro и in silico нельзя сравнить напрямую, что ограничивает интерпретационные способности этого метода. 3 Крупнозернистая модель на основе нативной топологии

Ограниченные возможности описанных выше методов затрудняют изучение широкого круга вопросов, которые возникаю при анализе кривых силовой спектроскопии. В данной работе использовалась модель Самоорганизующегося Полимера (СОП, англ. Self Organized Polymer - SOP) полипептидной цепи, чтобы описать механические свойства вирусов и микротрубочек (Рис. 4). Модель СОП основана на замене каждой аминокислоты ее Са-атомом. Существует немало работ, показывающих, что эта модель способна аккуратно описывать физико-химические свойства бимолекул [9-11, 13, 14, 66] и биомолекулярных ассамблей [12, 15, 16, 18-20]. Применение упрощенной модели СОП основано на том, что не атомарные детали структуры, а ее уникальные особенности, связанные с нативной топологией и локальным расположением капсомеров/тубулинов, определяют динамическое поведение биомолекулярных частиц под воздействием механического напряжения (Рис. 3). Более того, дополнительное 200-кратное вычислительное ускорение, получаемое с помощью графических процессоров (ГП) [67, 68], приближает нас к условиям приложения сил, непосредственно используемым в экспериментах по силовой спектроскопии. Это делает наш метод описания вирусной механики с помощью модели СОП ускоренной на ГП (программный пакет SOP-GPU, см. Раздел 3.5) уникальным средством компьютерного моделирования. В данном подходе "наноиндентирования in silico" совместно с крупнозернистой моделью также используются силовые поля полноатомной Молекулярной Динамики, чтобы определить детали белок-белковых взаимодействий на атомарном уровне внутри и между белковыми мономерами. Эта информация затем используется для параметризации крупнозернистой модели СОП биомолекулярных частиц. Важно отметить, что основа нашего многоуровневого подхода для наноиндентирования in silico не требует наличия никакой другой кинетической или термодинамической информации для осуществления моделирования биомеханики вирусов или МТ.

Модель СОП была изначально разработана для решения вопросов связанных с проблемой сворачивания белков. Существует немало публикацией, описывающих успешное примененение этой модели для изучения различных биологических систем [9-15, 18, 66-68]. Модель СОП полипептидной цепи [9, 10, 67, 68] можно использовать для описания каждой белковой субъединицы, составляющей вирусный кап-сид или полимер МТ. Модель СОП основана на нативной топологии, в ней каждый аминокислотный остаток представлен единственным центром взаимодействия, который описывается соответствующим Са-атомом. Белковая структура всей молекулы представлена набором Са-Са ковалентных связей длиной а=3.8 А (длина пептидной связи, см. Рис. 4).

Функция потенциальной энергии конформации белка USOP определена в терминах координат положения частиц {ГІ}=Г\, Гг,... , Гдг, где N - количество аминокислотных остатков, и задается формулой

Здесь к = 14 нН/нм - это константа упругости и RQ=2 А - индекс чувствительности к изменениям ковалентной связи. Потенциал FENE описывает связи по цепи белка, "v+i — это расстояние между аминокислотными остатками і и і + 1, а гі+1 — то же самое расстояние в начальной конформации. Для того чтобы учесть нековалентные взаимодействия, которые стабилизируют начальную структуру в свернутом состоянии (нативные контакты), мы использовали потенциал Леннарда-Джонса (англ. Lennard-Jones potential)

В Ур. 4 дополнительное ограничение наложено на все угловые связи, образованные аминокислотными остатками г, г + 1, г + 2 путем включения отталкивающего потенциала с параметрами єг=1.0 ккал/моль и 7,.=3.8 А. Эти параметры определяют силу и диапазон отталкивания. Параметр єи в модели СОП задает величину энергии взаимодействия пары нативных контактов. Этот параметр оценивается на основе результатов полноатомного МД моделирования биологической частицы в равновесии. Динамика системы расчитывается путем численного пропагирования вперед по времени уравнения движения Ланжевена для каждой частицы с координатами г\ в задемпфированном пределе (броуновский предел):

Чтобы сгенерировать броуновскую динамику, Рис. 4: Схематичное изображение процедуры построения упрощенной крупнозернистой модели Самоорганизующегося Полимера полипептидной цепи [9, 10] (см. Раздел 3.2). На панели А показан пример "упрощения" полноатомной структуры белковой субъединицы, формирующей пентамеры и гексамеры в оболочке CCMV (см. Рис. 1). Каждый аминокис-лотый остаток представляется одним центром взаимодействия (сферической частицей) с координатами Са-атома (показано четырьмя черными окружностями над стрелочкой перехода к крупнозернистой моделе). В результате этого, скелет белка заменяется совокупностью Са-Са ковалентных связей с длиной связи 3.8 А. Функция потенциальной энергии (молекулярное силовое поле), которая задается Ур. 1, описывается основные взаимодействия: бинарные взаимодействия между аминокислотами, стабилизирующие нативное свернутое состояние белка, связи по цепи белка, удлинение цепи в результате растяжения и отсутствие самопересечений в цепи (см. Ур. 2-4). Так как модель СОП основана на нативной топологии белка, в процессе перехода к крупнозернистой моделе сохраняется вторичная структура белка: а-спирали (показаны розовым), /3-листы (показаны синим) и участки нерегулярной структуры (показаны серым).

Модель Саморганизующегося Полимера

Значение параметра е в модели СОП, который содержит атомарную информацию о взамодействиях в системе (количество бинарных контактов между аминокислотами и их энергии, см. Раздел 3.2), можно расчитать, используя непосредственно моделирование молекулярной динамики полноатомной модели оболочки CCMV при Т=300 К. Как только этот параметр получен, он импортируется в модель СОП капсида CCMV. Все нативные контакты в белковой оболочке были поделены на две группы, которые определяют тип контактов: (1) контакты внутри каждого белкового мономера капсида и (2) контакты в интерфейсах, формируемых капсидным белками. Здесь мы предполагаем, что пара аминокислотных остатков формирует контакт, если расстояние между их Са-атомами в нативном состоянии не превышает определенного радиуса обрезки Re- Мы использовали стандартный выбор радиуса обрезки Rc=8 А. Мы провели моделирование 30 не молекулярной динамики, чтобы для каждой группы контактов расчитать (і) среднюю энергию нековалентных взаимодействий (Eintra и Einter), задаваемую суммой энергий ван-дер-Ваальса (потенциал Леннарда-Джонса) и электростатической (потенциал Кулона), а также (п) среднее количество бинарных контактов между аминокислотными остатками {Nintra и N inter)) которые стабилизируют нативную структуру капсида (нативные контакты). Чтобы провести моделирование полноатомной молекулярной динамики, мы использовали модель неявного растворителя Площадь Поверхности Доступная Растворителю (англ. Solvent Accessible Surface Area, SASA) [70], которая основана на силовом поле CHARMM19 [71]. Результаты моделирования в неявном растворителе (файлы координат и энергий) [72] были использованы для расчета значений Епь и Nnb для двух групп контактов. В среднем мы получили Nintra Z, 554 - количество контактов внутри мономеров и Ninter i, 405 - количество контактов в интерфейсах между мономерами. Соответственно, полная энергия нековалентных взаимодействий внутри мономеров составляет Eintra 25,898 ккал/моль и полная энергия взаимодействий в интерфейсах между мономерами составляет Einter 3,746 ккал/моль. Наконец, чтобы найти значения параметра S\ll мы разделили два числа для каждой группы контактов. Для CCMV eintra=Eintra/Nintra=1.26 ккал/моль и einter=Einter/Ninter=l.l ккал/моль. Эти значения были использованы в модели СОП для расчета динамики Ланжевена механического индентирования капсида CCMV.

Атомарные детали, которые определяют тип и количество бинарных контактов между аминокислотами, а также их энергии, были импортированы в модель СОП для решетки МТ. Средняя энергия нековалетных взаимодействий (Епь) для всех групп контактов расчитывалась как сумма энергии ван-дер-Ваальса (потенциал Леннарда-Джонса) и электростатической энергии (потенциал Кулона). Среднее количество контактов между аминокислотными остатками (Nnb), которые стабилизируют нативную структуру МТ (нативных контактов), расчитывалось на основе определения, если пара Са-атомов находится на расстоянии меньше Rc=& А, то пара образует контакт. Все нативные контакты были поделены на пять групп (типов контактов): (1) контакты внутри мономера а-тубулина; (2) контакты внутри мономера /3-тубулина; (3) контакты внутри димера, которые стабилизируют структуру димера; (4) продольные контакты между любыми двумя димерами вдоль оси цилиндра МТ; (5) поперечные контакты между мономерами а-тубулинов и между мономерами /3-тубулинов Таблица 1: Параметризация модели СОП для решетки МТ: Среднее количество нативных контактов Nnb, среднее значение энергии нековалентных взаимодействий Епь и среднее значение прочности нековалетных взаимодействий для одного нативного контакта

Тип контактов Nnb Епь, ккал/моль Eh, ккал/моль внутри мономера (а-тубулина) 1340 2345 1.8 внутри мономера (/3-тубулина) 1240 2320 1.9 внутри димера 78 150 1.9 продольные между димерами 38 37.6 1.0 поперечные между димерами 20 17.6 0.9 соседних протофиламентов. Чтобы расчитать энергию нековалетных связей, мы использовали модели неявного растворителя Площадь Поверхности Доступная Растворителю (англ. Solvent Accessible Surface Area, SASA) [70] и Обобщенную модель Борна (англ. Generalized Born, GB) [73]. Мы использовали результаты вычисления энергии и координат с помощью модели SASA [72], чтобы расчитать значения Епь и Nnb для контактов из групп 1-3. Так как электростатические взаимодействия важны для образования продольных и поперечных межтубулиновых связей, мы использовали более аккуратную модель GB, чтобы расчитать Е, и Nnb для контактов из групп 4 и 5. Наконец, мы поделили Е„ь на соответствующее значение Nny, для каждой группы контактов и получили значения е (см. Таблицу 1), которые использовали в моделировании наноимдентирования in silico.

В зависимости от численного алгоритма и размера системы, большинство вычислений на графических процессорах (ГП) в 4—250 раз быстрее чем наилучшие оптимизированные реализации на центральных процессорах (ЦП). Мы разработали вычислительную методологию на основе ГП для того чтобы: (1) генерировать псевдослучайные числа с помощью алгоритмов Гибридный Таус (англ. Hybridaus), Фибоначчи с запаздыванием (англ. Lagged Fibonacci) и Мерсенн-Твистер (англ. Mersennewister); (2) вычислять молекулярные силы на основе подходов параллелизации по частицам и по взаимодействующим парам частиц; (3) численно пропагировать уравнение движения Ланжевена [67, 68]. Псевдослучайные числа статистически значимого качества необходимы для выполнения моделирования в стохастическом термоста 32

те; вычисление силы необходимо для описания биомолекулярных взаимодействий; уравнение движение нужно для расчета динамики рассматриваемой системы. Чтобы полностью оптимизировать вычислительные ресурсы, мы разработали: (а) подход для запуска одной траектории на ГП и (б) подход для запуска множества траекторий на ГП, чтобы генерировать одновременно несколько независимых траекторий на одном ГП-устройстве [67]. Разработанные численные алгоритмы на ГП совместно с динамикой Ланжевена на основе модели Самоорганизующегося Полимера были включены в программный пакет SOP-GPU для вычислительных исследований больших биологических ассамблей [67, 68]. Пакет SOP-GPU позволяет выполнять динамические силовые измерения in silico (см. Рис. 3) на экспериментальной временной шкале порядка сотых долей секунды [14, 15, 18, 67, 68].

Термодинамические характеристики процесса индентирования CCMV

Обозначенные выше ограничения экспериментального разрешения требуют развития альтернативных исследовательских стратегий. В связи с этим мы разработали новую методологию "наноиндентирования in silico", которая может быть использована для полноценного изучения структуры и механизма деформации, а также коллапса биомолекулярных комплексов (Рис. 3) [15, 18]. В данном методе процесс механической нагрузки и релаксации биологической частицы проводится in silico (т.е. на компьютере). Важно отметить, что измерение наноиндентирования выполняется при экспериментальных условиях приложения силы f(t)=rft (Рис. 3), т. е. в нашем моделировании мы используем экспериментальное значение скорости увеличения силы (г/). Структурные переходы, возникающие в процессе деформации, можно наблюдать по изменению координат каждого аминокислотного остатка, а термодинамические параметры и биомеханические характеристики могут быть получены путем детального анализа результирующих энергий.

Наш уникальный "эксперимент" in silico предоставляет полную и детальную картину всего процесса деформации, релаксации и коллапса частицы. Таким образом, данный подход может быть использован для того, чтобы получить подробную интерпретацию экспериментальных спектров силы-деформации. В нашем эксперименте по наноиндентированию in silico, мы имеем полный контроль над протоколом моделирования, т.е. можем задавать амплитуду и направление прилагаемой силы, точное место сопрокосновения зонда кантилевера (индентора) и биологической частицы (системы), зареплять выбранные аминокислотные остатки, чтобы предотвратить вращение частицы. Как и в эксперименте, мы можем сменить направление прилагаемой силы на противоположное, уменьшать или увеличивать амплитуду силы и т. д. Таким образом, полный контроль над системой, осуществляемый в процессе деформации, можно использовать для того чтобы (а) изучить наноиндентирование в различных точках симметрии на поверхности частицы и (б) чтобы провести сопоставление между изменениями в энергии, наблюдаемыми в каждый момент времени в моделировании, с отдельными молекулярными деталями, обнаруживаемыми в структуре частицы. Кроме того, мы можем (с) по необходимости переключаться между прямым индентированием и релаксацией при уменьшении прилагаемой силы [15, 18]. Последнее может быть использовано для моделирования повторяющихся циклов индентирования и релаксации, чтобы исследовать процесс возникновения механической "усталости" и структурного коллапса в рассматриваемой биологической системе.

В in silico экспериментах по измерению динамической силы, кантилевер представляется виртуальным сферическим шариком, привязанным с помощью гармонической пружины к сферическому шарику радиуса RuP, имитирующиему зонд кантилевера (Рис. 3). Взаимодействие зонда с биологической частицей описывается потенциалом Л еннарда- Д жонса: производя, таким образом, индентирование внешней поверхности частицы. В Ур. 6 г І и rtip - координаты г-ого шарика (Са-атома) биологической частицы и центра зонда, соответственно; Єщ = 4.18 ккал/моль и ощ = 1.0 А— параметры взаимодействия, а суммирование выполняется по всем частицам, взаимодействующих с зондом или другим индентирующим объектом.

В Ур. 7 гф - это начальное положение центра сферического зонда (uf - это скорость движения базы кантилевера; к - жесткость пружины кантилевера), и коэффициент вязкости г]=7.0 х 106 пН пс/нм (( = 500 - безразмерная константа вязкости для сферического зонда в воде). Чтобы сгенерировать динамику рассматриваемой биологической частицы, подверженной механическому воздействию, мы решаем Ур. 1-5 для частицы (см. Раздел 3.2) и Ур. 6-7 для индентирующего объекта (сферического зонда).

Двигаясь с постоянной скоростью (/ /), база кантилевера (виртуальная частица на Рис. 3) через свой зонд создает линейно зависимую от времени силу f (i)=/(i)n в на 36 правлении п, перпендикулярном внешней поверхности биологической частицы. Эта сила вызывает механическую нагрузку на частицу. В результате этого, величина силы f(t)=rft, сдавливающей частицу, увеличивается прямо пропорционально времени t со скоростью Г/ = KUf. При моделировании прямого индентирования, база кантилевера (и сферической зонд) смещаются в направлении биологической частицы; при моделировании релаксации при уменьшении прилагаемой силы направление движения базы кантилевера (зонда) меняется на противоположное, что влечет за собой уменьшение величины сдавливающей силы до нуля. Мы можем контролировать смещение базы кантилевера Z, а также положение зонда X, которое определяет глубину индентирования. Сила сопоротивления деформации F, производимая биологической частицей, которая соответствует экспериментально измеряемой силе индентирования, расчитывается непосредственно из результирующих значений энергии. Более того, чтобы капсид не поворачивался, а также, чтобы имитировать его адсорбацию, мы закрепили нижнюю часть частицы, фиксируя несколько Са-атомов, соприкасающихся с подложкой. Чтобы учесть длину МТ, мы закрепили несколько крайних Са-атомов на "плюс"- и "минус"-концах МТ. Обладая 200-кратным вычислительным ускорением, получаемым на современных графических картах, мы используем в нашем моделировании экспериментальные значения скорости движения кантилевера (uf=0.1 — 1.0 мкм/с), что дает значительное преимущество данному методу. 5 Биомеханика капсида CCMV

Мы провели моделирование наноиндентирования белковой оболочки CCMV, используя зонд сферической формы радиусом Rtip=20 нм. Ускорение вычислений в 250 раз с помощью современных ГП позволило нам использовать экспериментальные значения прикладываемой механической силы z//=0.5 и 1.0 мкм/с (к=0.05 Н/м), а также достичь экспериментальной временной шкалы 0.1 — 0.2 с. Чтобы сравнить результаты экспериментов и моделирования, мы построили кривые силы индентиро-вания F как функцию смещения базы кантилевера Z (см. Раздел 4.1). Теоретические FZ кривые (Рис. 5 С и D) хорошо согласуются с экспериментальными графиками (Рис. 5 А и В), которые были предоставлены нам лабораторией проф. Хайста Дж. Л. Вауте (Dr. Gijs J. L. Wuite) и проф. Ваутера X. Рооса (Dr. Wouter Н. Roos) из Университета Амстердама в Голландии. FZ кривые, полученные с помощью моделирования, также демонстрируют одношаговые и многошаговые переходы, наблюдаемые у экспериментальных кривых. Второе встречается чаще при низкой скорости изменения внешней нагрузки, ввиду последовательных разломов различные межкапсомерных связей.

Мы статистически проанализировали коэффициент упругости (ксар), критическую силу (F ) и критическое смещение базы кантилевера (Z ) для первого пика силы, соответствующего первому разлому в оболочке и, соответственно, ее механическому пределу. Средние значения ксар, F , и Z хорошо согласуются с их экспериментальными аналогами (Таблица 2). Мы также проанализировали зависимость ксар от скорости смещения базы кантилевера i/f (/ /=5 и 25 мкм/с) и обнаружили, что также, как и в эксперименте, ксар не меняется с изменением i/f (Рис. 6). Затем мы выполнили моделирование релаксации при обратном направлении движения базы кантилевера с такой же скоростью, монотонно уменьшая прилагаемую силу до нуля. В качестве начальных структур мы использовали промежуточные координаты CCMV, полученные при прямом индентировании до значений смещения базы кантилевера Z=15, 25, 28 и 32 нм. Результаты нашего моделирования (Рис. 7 В) хорошо