Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор. 7
1.1. Гидроксиэтилирование крахмала 8
1.2. Применение гидроксиэтилированных крахмалов 10
1.3. Способы получения гидроксиэтилированных крахмалов 13
1.4. Гидролиз гидроксиэтилированного крахмала 22
1.5. Определение величины молекулярной массы (ММ) и 23 молекулярно-массового распределения (ММР) 1.6. Анализ молярного замещения (МЗ) и степени замещения 28 (СЗ)
1.7. Анализ характера замещения 31
1.8. Синтез модельных соединений 39
Экспериментальная часть 44
2.1. Гидролиз крахмала 44
2.1.1. Определение степени гидролиза крахмала 45
2.1.2. Гидролиз крахмала различного происхождения в водной суспензии
2.1.2.1. Определение зависимости ММ от времени гидролиза в водной суспензии
2.1.2.2. Гидролиз крахмала до требуемой величины ММ в водной суспензии
2.1.3. Гидролиз крахмала различного происхождения в изопропаноле
2.1.3.1. Определение зависимости ММ от времени гидролиза в изопропанольной суспензии
2.1.3.2. Гидролиз крахмала до требуемой величины ММ в изопропанольной суспензии
2.2. Фракционирование обычного сорта пищевого крахмала с целью очистки от амилозы
2.3. Гидроксиэтилирование крахмала различного происхождения
2.3.1. Анализ реакционной смеси методом ЯМР 13С 52
2.3.2. Анализ интенсивности поглощения реакционной массы
2.3.3. Гидроксиэтилирование крахмала этиленоксидом в присутствии NaCl
2.3.4. Гидроксиэтилирование крахмала этиленоксидом в присутствии NaOH
2.3.5. Гидроксиэтилирование крахмала этиленхлоргидрином в присутствии NaOH прямым способом
2.3.6. Гидроксиэтилирование крахмала этиленхлоргидрином в присутствии NaOH обратным способом
2.4. Анализ тонкой структуры продуктов гидроксиэтилирования полисахаридов
2.4.1. Условия проведения хроматографического анализа 58
2.4.2. Подготовка образцов к хроматографическому анализу
2.4.2.1. Частичное метилирование ГЭК в воде 58
2.4.2.2. Исчерпывающее метилирование частично метилированного ГЭК в диметилацетамиде
2.4.2.3. Полный гидролиз избыточно метилированного 59 ГЭК
2.4.2.4. Ацетилирование частично метилированных производных глюкозы
Результаты и их обсуждение 60
3.1. Основные стадии синтеза гидроксиэтилированного крахмала
3.2. Изучение реакции гидроксиэтилирования крахмала 62
3.2.1. Метод количественной оценки параметров реакции гидроксиэтилирования крахмала и характеристик полученных продуктов на основе спектроскопии ЯМР 13С
3.2.1.1. Обоснование выбора критериев для оценки свойств ГЭК и оптимальных условий проведения реакции гидроксиэтилирования
3.2.1.2. Обоснование выбора метода анализа для изучения реакции гидроксиэтилирования крахмала
3.2.1.3. Анализ методом ЯМР 13С спектроскопии основных характеристик ГЭК и параметров реакций его получения
3.2.1.4. Спектрофотометрический анализ реакционной массы после гидроксиэтилирования крахмала
3.2.2. Влияние отдельных факторов на реакцию гидроксиэтилирования крахмала
3.2.2.1. Гидроксиэтилирование крахмала этиленоксидом в присутствии хлорида натрия
3.2.2.1.1 Концентрация раствора крахмала 74
3.2.2.1.2 Концентрации катализатора хлорида натрия 76
3.2.2.1.3 Температура реакции
3.2.2.1.4 Соотношение реагентов - крахмал / этиленоксид 79
3.2.2.2. Гидроксиэтилирование крахмала этиленоксидом в 81
присутствии гидроксида натрия
3.2.2.2.1 Концентрация катализатора гидроксида натрия 82
3.2.2.2.2 Температура реакции 83
3.2.2.2.3 Определение оптимального соотношения реагентов— крахмал / этиленоксид при щелочном катализе
3.2.2.3. Гидроксиэтилирование крахмала этиленхлоргидрином в присутствии гидроксида натрия
3.2.2.3.1 Прямой способ гидроксиэтилирования крахмала этиленхлоргидрином
3.2.2.3.2 Обратный способ гидроксиэтилирования крахмала этиленхлоргидрином
3.2.2.4. Сравнительный анализ методов синтеза ГЭК 94
3.2.2.4.1 Гидроксиэтилированный крахмал со СЗ = 0,4 94
3.2.2.4.2 Гидроксиэтилированный крахмал со СЗ = 0,5 96
3.2.2.4.3 Гидроксиэтилированный крахмал со СЗ = 0,7
3.3. Метод определения тонкой структуры продуктов гидроксиэтилирования полисахаридов
3.4. Конформационный анализ макромолекул ГЭК 124
3.4.1. Описание метода расчета числа конформационных 125
состояний
3.4.2. Результаты конформационного анализа 127
Выводы 134
Список литературы 135
- Определение величины молекулярной массы (ММ) и 23 молекулярно-массового распределения (ММР)
- Гидроксиэтилирование крахмала этиленхлоргидрином в присутствии NaOH обратным способом
- Обоснование выбора критериев для оценки свойств ГЭК и оптимальных условий проведения реакции гидроксиэтилирования
- Определение оптимального соотношения реагентов— крахмал / этиленоксид при щелочном катализе
Введение к работе
Актуальность работы. Макромолекулярные системы занимают важное место среди
современных лекарственных препаратов. В том числе, это относится к полимерным компонентам кровезаменителей различного типа, в частности, производным полисахаридов, сочетающим высокую эффективность и безвредность за счет постепенного распада в организме с последующим выведением образовавшихся фрагментов.
К таким полимерам относится гидроксиэтилированный крахмал, составляющий основу плазмозамещающих кровезаменителей, широко применяемых в медицине катастроф, хирургии, акушерстве и гинекологии, а также в качестве криопротекторных составов, используемых при хранении трансплантируемых органов.
В настоящее время в Российской Федерации отсутствует производство гидроксиэтилированного крахмала. В связи с этим, работы, направленные на изучение реакции гидроксиэтилирования крахмала различного происхождения с целью создания отечественной фармацевтической субстанции являются актуальными.
Цель работы: изучение закономерностей реакции гидроксиэтилирования амилопектинового крахмала для получения фармацевтической субстанции гидроксиэтилированного крахмала из доступного отечественного сырья.
Научная новизна - определены оптимальные условия реакции гидроксиэтилирования крахмала различного происхождения: концентрация крахмала, температура процесса, концентрация и природа катализатора, мольное соотношение крахмал : алкилирующий агент.
Для прогнозирования свойств субстанции разработан математический аппарат конформационного анализа макромолекул олиго- и полисахаридов.
Предложен новый подход к количественной оценке степени превращения реагентов и
1 о
их селективности в реакции гидроксиэтилирования крахмала на основе ЯМР С спектроскопии.
Разработан комплексный метод анализа тонкой структуры амилопектина и его гидроксиэтильных производных, пригодный для стандартизации лекарственных препаратов на основе гидроксиэтилированного крахмала.
Практическая значимость работы.
Разработана оригинальная технология получения фармацевтической субстанции гидроксиэтилированного крахмала из доступного отечественного сырья. Разработан метод оперативного производственного контроля, а также комплексный метод анализа структуры
амилопектина и его гидроксиэтильных производных, пригодный для стандартизации лекарственных препаратов на основе гидроксиэтилированного крахмала. Автор защищает:
Результаты оптимизации условий реакции гидроксиэтилирования крахмала.
Метод контроля за протеканием реакции гидроксиэтилирования полисахаридов
1 о
на основе спектроскопии.
3 Новый метод исследования тонкой структуры молекул гидроксиэтилированного крахмала.
Метод конформационного анализа макромолекул олиго- и полисахаридов.
Технологию получения субстанции гидроксиэтилированного крахмала. Личное участие состояло в создании лабораторной установки гидроксиэтилирования,
непосредственном анализе химического строения полисахаридов и продуктов их модификации методом С ЯМР, подготовке проб для анализа строения гидроксиэтилированного крахмала методом ГЖХ, оптимизации условий гидроксиэтилирования крахмала, разработке математического аппарата конформационного анализа полисахаридов, интерпретации результатов исследований, подготовке докладов и публикаций.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах:
- V Съезд гематологов и трансфузиологов республики Беларусь «Актуальные
проблемы гематологии и трансфузиологии. (Минск, 2003);
Съезд международной инженерной академии (Париж, 2004);
Международная конференция "Биотехнология и Медицина" Москва, 2006);
Международная конференция "Органическая химия от Бутлерова и Белыптейна до современности " (Санкт-Петербург, 2006);
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованном ВАК, 1 патент РФ, а также 4 тезиса докладов, представленных на отечественных и международных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы (173 наименования). Работа изложена на 152 страницах, включая 46 рисунков и 36 таблиц.
Определение величины молекулярной массы (ММ) и 23 молекулярно-массового распределения (ММР)
Введение 0,05-0,1 гидроксиэтильных групп на глюкозный остаток существенно влияет на свойства крахмальных клейстеров и пленок [22,23], особенно у крахмалов, в естественном виде дающих опалесцирующие гели и денатурирующих при старении. Введение гидроксиэтильных групп в крахмал приводит, к снижению температуры клейстеризации [24], увеличению скорости набухания и диспергирования гранул при нагревании [25], повышению прозрачности и когезии клейстера, а таюке к значительному снижению тенденции клейстеров к студнеобразованию или денатурации при охлаждении и старении.
Гидроксиэтилирование неклейстеризованного крахмала этиленоксидом вызывает прогрессирующее снижение температуры клейстеризации по мере увеличения степени замещения от 0,1 до 0,4 гидроксиэтильных групп на глюкозный остаток. При повышении степени замещения от 0,4 до 1 эфиры нативного крахмала начинают лучше растворяться в холодной воде. Замещение более 1 гидроксиэтильной группы на глюкозный остаток приводит к увеличивающейся сольватации низшими спиртами типа метанола и этанола. ГЭК со степенью замещения около 3 гидроксиэтильных групп на глюкозный остаток растворяется в спиртах и воде, и являются термопластичными, а в холодной воде образуют прозрачные бесцветные коллоидные растворы, не проявляющие тенденций к ретроградации и исключительно стабильные к действию замораживания-оттаивания.
Коммерческую привлекательность данный продукт приобрел после того, как на рынке в 1940-х годах появился недорогой этиленоксид. Первый коммерческий низкозамещенный продукт был запатентован в начале 1950-х годов [26]. Полученный таким образом ГЭК имел низкую стоимость, обеспечивал стабильные вязкостные характеристики и гидролитическую стабильность в широком диапазоне рН.
Низкозамещенные ГЭК нашли широкое применение в бумажной промышленности [27], особенно при поверхностной проклейке и покрытии бумаги. Повышенная водоудерживающая способность и когезия ГЭК снижают тенденцию влажной пленки проникать в бумагу, обеспечивая получение более ровной пленки на поверхности. Свойства низкозамещенных ГЭК делают их идеальными связующими при отделке цветной бумаги [28], а покрытия, содержащие ГЭК, отличаются хорошими восприимчивостью к краске [29] и печатными свойствами [30].
В текстильной промышленности низкозамещенный ГЭК применяют главным образом для шлихтования основы [31]. Сильно сниженная способность к студнеобразованию этого продукта сводит к минимуму затвердевание шлихты, а повышенная гладкость и гибкость пленки способствует росту абразивной устойчивости нитей и повышению эффективности изготовления ткани.
Полученные из ГЭК декстрины образуют клейстеры повышенной устойчивости при более высоких концентрациях, чем обычные декстрины. Их используют в качестве клеев для коробок, этикеток, конвертов [32,33].
Высокозамещенные крахмалы обладают достоинствами дешевых растворимых в холодной воде загустителей и пленкообразователей.
ГЭК с относительно высокой степенью замещения устойчивы к воздействию микроорганизмов.
Способность ГЭКа к образованию коллоидных растворов привело к использованию его в качестве суспендирующего агента для приготовления дерматологических лосьонов [34]. Тогда и было установлено, что гидроксиэтилированный крахмал нетоксичен для животных и эффективен для поддержания кровяного давления. В начале 1960-х годов, после проведенных исследований [35,36], ГЭК начал использоваться в качестве кровезаменителя объеморасширяющего действия [37,38]. Следует отметить, что гидроксиэтилированию в данном случае подвергался крахмал восковидной спелости, с содержанием амилопектина (разветвленного полимера крахмала) более 95%. При использовании в качестве заменителя плазмы амилопектина было обнаружено, что он сильно подвержен действию гидролитического фермента амилазы. Амилаза мгновенно расщепляет амилопектин и, будучи низкомолекулярным, он быстро выводится из организма. Для защиты гликозидной связи от действия амилазы, Вейдершейм [39] предложил использовать модифицированный крахмал, а именно, ГЭК. В результате проделанной работы подтвердились его предположения, и, при этом, была установлена относительно низкая токсичность ГЭК.
Валтон с сотрудниками последовательно подтвердили полученные Вейдершеймом результаты и продолжили работу в этом направлении [40-42].
Влияние молекулярной массы на физико-химические и биологические свойства полученных плазмоэспандеров было изучено в работе Тамады [43].
Ирикура и Кудо в своих работах показали влияние различных величин степени замещения на поддержание кровяного давления у животных [44-50].
Позднее, значительный интерес был привлечен к ГЭКу в качестве криопротектора при замораживании эритроцитов для хранения [51]. В рамках данной процедуры, эритромассу суспендировали в растворе ГЭК и замораживали в жидком азоте. После оттаивания, массу промывали от ГЭК раствором соли. Клетки при этом не разрушались.
В настоящее время ГЭК с молекулярными массами 70 - 500 кДа и со степенями замещения от 0,3 до 0,7 широко используются в качестве заменителя плазмы крови человека, и в качестве гемоконсерванта.
Особо следует отметить, что ГЭК показал себя наиболее перспективным гемодинамическим компонентом кровезаменителя — переносчика кислорода на основе перфторуглеводородной эмульсии [52]. Использование с этой целью декстранов (40 и 70 кДа) вызывало разложение эмульсии уже при концентрации 1,5%. Альбумин при массивных кровопотерях не обеспечивал в составе эмульсии необходимого онкотического давления
Гидроксиэтилирование крахмала этиленхлоргидрином в присутствии NaOH обратным способом
Схожим способом определения характера замещения воспользовалась также группа Меркуса [141]. В своей работе [142] они проанализировали характер замещения ряда образцов ГЭК с диапазоном МЗ 0,03-1,9 и сопоставили собственные результаты с данными других авторов. Было показано, что отношение замещения СЗ:С6 зависит от степени молярного замещения и от способа синтеза ГЭК. В случае низкой величины МЗ, достигаемой путем проведения реакции в водной суспензии, отношение СЗ:С6 стремится к 2. При высоких степенях МЗ, полученных синтезом в водном растворе, это отношение снижается в десять раз и составляет 0,2. Авторы объяснили этот эффект тем фактом, что при высоких значениях МЗ атом СЗ является более предпочтительным для полизамещения, чем Сб.
Де Белдер использовал для анализа гидролизата ГЭК метод газожидкостной хроматографии [143]. Кроме пиков, относящихся к основным продуктам гидролиза, авторы обнаружили в смеси изомеров продукты внутримолекулярной циклизации 2-0-гидроксиэтил-Б-глюкопиранозы: 1,2-0-этилен-а-В-глюкофуранозу, описанную ранее, а также 1,2-0-этилен-а-0-глюкопиранозу, возможно в присутствии их Р-изомеров. Разделение а- и р- изомеров на данном типе колонок не представлялось возможным. Было показано, что относительное количество этих изомеров растет с длительностью проведения исчерпывающего гидролиза.
Метод анализа распределения гидроксиэтильных групп в образцах полностью гидролизованного ГЭК с последующим разделением замещенных и незамещенных глюкозных остатков впервые с помощью ВЭЖХ на колонках типа Zorbax NH2 в системе MeCN-H20, был предложен Юриным с сотрудниками [144]. Отнесение пиков на хроматограмме было проведено с использованием хромато-масс-спектрометрии в режимах химической ионизации и электронного удара. Из сравнения хроматографических профилей образцов ГЭК с диапазоном МЗ 0,28-1,13, с учетом неизменности отношения С2/С6 было показано [145], что характер распределения гидроксиэтильных групп в глюкозных остатках существенно не меняется. Было также проведено изучение характера распределения гидроксиэтильных групп в образцах ГЭК с различной молекулярной массой. Авторами было установлено, что алкилирование амилопектина идет равномерно, так как доля незамещенной глюкозы и профили хроматограмм фракций близки и не зависят от молекулярной массы.
Указанные выше способы определения характера замещения не достаточно информативны, поскольку ничего не говорят о степени разветвления макромолекул амилопектина и о замещении гидроксиэтильных групп в остатки глюкопиранозы, при которых происходит ветвление. Упущенная информация очень важна, поскольку разветвление значительно влияет на свойства полимера.
С целью создания более информативного метода, содержащего данные как о характере и степени замещения, так и о характере и степени разветвления, Соммермайер впервые для ГЭК предложил [146] следующую схему: исчерпывающее метилирование (перметилирование) метилйодидом в DMSO в присутствии NaOH; полный гидролиз 2М трифторуксусной кислотой; восстановление боргидридом натрия; ацетилирование уксусным ангидридом в присутствии пиридина; и газохроматографический анализ полученной смеси.
После полного гидролиза продуктов перметилированного ГЭК, в точке ветвления остается незамещенная гидроксильная группа, которую защищают на стадии ацетилирования. Поэтому, по положению ацетильной группы в остатке глюкозы можно судить о том, какими гликозидными связями он был связан до гидролиза, а по их количеству - о степени разветвления. Следует отметить, что метилированию подвергаются все свободные гидроксильные группы, в том числе, относящиеся к гидроксиэтильным группам. Благодаря этому, среди продуктов полного гидролиза будут отсутствовать продукты внутримолекулярной циклизации, образующиеся при взаимодействии гидроксильных групп заместителя с полуацетальным атомом углерода. С целью сокращения вдвое количества изомеров, и как следствие, количества пиков на хроматограмме, после полного гидролиза проводят восстановление полуацетального атома углерода боргидридом натрия до первичного спирта (сорбита). Таким образом, на газохроматографической колонке проводят разделение метилированных, гидроксиэтилированных и ацетилированных производных сорбита, а по их количеству и характеру замещения вышеуказанными группами, делают вывод о характере и степени замещения и разветвления.
Благодаря данной схеме, авторы установили, что образцы ГЭК, полученные из гидролизованного а-амилазой амилопектинового крахмала, имели степень разветвления намного выше, чем полученные путем кислотного гидролиза. По их мнению, а-1-6-гликозидная связь гидролизуется в присутствии кислоты и не подвержена ферментативному гидролизу. С другой стороны, намного ранее, Бэнкс с сотрудниками [147] по наличию в гидролизатах разветвленных полимеров амилопектина и гликогена изомальтозы показали, что а-1-6-гликозидная связь гораздо более устойчива к кислотному гидролизу, чем а-1-4. Для полного гидролиза 0,75М раствором серной кислоты при 100С полимеров, содержащих а-1-6-гликозидную связь, авторам потребовалось 3 часа, в отличие от гидролиза для а-1-4 связи, который протекает полностью в этих условиях за 2 часа.
Данные факты следует учитывать как при производстве, так и при анализе субстанций, поскольку, как уже было ранее отмечено, степень разветвления сильно влияет на свойства данного полимера.
Сравнительный анализ характера распределения гидроксиэтильньгх групп в ГЭК методами ГЖХ с масс-детектированием и 13С ЯМР спектроскопией провели китайские специалисты [148]. Отнесение сигналов в спектре 13С ЯМР проводили путем сопоставления данных спектров не модифицированного крахмала, а также данных спектра гидроксиэтилцеллюлозы. Следует отметить, что данный вид анализа имеет невысокую точность из-за широких перекрывающихся сигналов в спектре, а также из-за различий интегральных интенсивностеи сигналов вследствие различия эффектов Оверхаузера на данных ядрах.
В качестве альтернативного способа ЯМР исследования характера замещения, Рубен предложил анализировать не раствор гидроксиэтилированного крахмала, а его гидролизат [149]. Гидролиз ГЭК проводили описанным ранее способом [150].
Обоснование выбора критериев для оценки свойств ГЭК и оптимальных условий проведения реакции гидроксиэтилирования
При концентрации катализатора 0,1 М наблюдаются низкие значения основных показателей реакции. В диапазоне концентраций 0,3-0,5М при незначительном росте степени замещения и степени превращения этиленоксида наблюдается рост удельной оптической плотности. На основании этих данных, для дальнейших экспериментов с этиленоксидом использована наиболее пригодная для получения ГЭК концентрация гидроксида натрия в щелочном растворе крахмала, равная 0,3 М.
Как видно из предыдущего эксперимента, в случае катализа гидроксидом натрия при 40С наблюдаются более высокие степени превращения по сравнению с хлоридом натрия, где было показано, что при более низкой температуре реакция практически не идет. Ввиду этого, а также из-за достаточно высокой интенсивности Ауд реакционной массы при 40С была проведена серия экспериментов при более низких температурах. Результаты представлены в таблице 3.9. Таблица 3.9
Как видно из графиков, представленных на рис. 3.9, несмотря на низкое значение Ауд реакционной массы после гидроксиэтилирования при температуре 20С, реакция характеризуется низкими степенями превращения. В диапазоне температур 30-40С наблюдается высокая степень конверсии как по крахмалу, так и по этиленоксиду. Однако, при температуре 30С значительно ниже интенсивность Ауд, чем при 40С.
Последнее обстоятельство стало решающим для выбора условий реакции гидроксиэтилирования крахмала этиленоксидом при щелочном катализе. Как наиболее оптимальная, в этих условиях была выбрана температура 30С. 3.2.2.2.3. Определение оптимального соотношения реагентов -крахмал / этиленоксид при щелочном катализе.
С целью изучения условий получения гидроксиэтилированного крахмала с заданной степенью замещения была проведена серия экспериментов при фиксированных значениях оптимальных показателей: температуры, концентрации катализатора и крахмала, и варьируемых соотношениях крахмал/этиленоксид.
Пробы каждой серии отбирали через 2, 4, 8, 16 и 24 часа от начала загрузки этиленоксида. Результаты представлены в таблице ЗЛО.
Время, ч Рис.3.11. Зависимость 1п(МЗК0Н — МЗТ) от времени для реакции гидроксиэтилирования крахмала этиленоксидом в присутствии NaOH. Аппроксимацией значений графиков (рис. 3.11) были получены уравнения линейных зависимостей вида у = ах + Ь. Коэффициенты при х, взятые с противоположным знаком равны кажущимся константам скоростей к реакций при различных соотношениях крахмал : этиленоксид.
Рассмотренное ранее применение этиленоксида в качестве алкилирующего агента имеет ряд недостатков [58].
Во-первых, этиленоксид - газообразное вещество при комнатной температуре и атмосферном давлении. Этот факт в значительной мере усложняет аппаратурное оформление процесса, поскольку требует проводить его под избыточным давлением, применяя более сложную систему дозировки агентов.
Во-вторых, этиленоксид является взрыво- и пожароопасным соединением, что накладывает особые требования к его перевозке, хранению и использованию.
В-третьих, этиленоксид обладает высокой коррозионной активностью, что предполагает для изготовления аппарата, соединений и уплотнений использовать нержавеющую сталь и фторопласт. В-четвертых, этиленоксид является высокотоксичным и канцерогенным веществом, что отражается на специальных требованиях к рабочей зоне.
С учетом перечисленных недостатков этиленоксида, с целью повышения безопасности процесса, было предложено использовать альтернативный гидроксиэтилирующий агент — этиленхлоргидрин. Данное соединение в промышленных масштабах получают из этиленоксида. Оно является гораздо более безопасным, имеет высокую температуру кипения и поэтому находится в жидком состоянии при нормальных условиях.
Реакция, вероятно, протекает по следующей схеме: он
Следует отметить, что в водном растворе в присутствие щелочного агента наблюдается равновесие между этиленхлоргидрином и этиленоксидом. Поэтому, при использовании этиленхлоргидрина в качестве альтернативного алкилирующего агента, этиленоксид образуется в ректоре in situ. В связи с этим, требования к основному аппарату остаются прежними, а дозирование этиленхлоргидрина может осуществляться обычным способом под небольшим избыточным давлением.
В качестве щелочного агента выбран гидроксид натрия, как наиболее доступный и позволяющий создать необходимые условия для протекания реакции. Как и в реакции гидроксиэтилирования этиленоксидом, щелочной агент необходим для образования алкокси производных крахмала с целью повышения нуклеофильности гидроксильных групп, однако в данном процессе он будет расходоваться как на образование этиленоксида, так и на нейтрализацию соляной кислоты, которая содержится в этиленхлоргидрине в качестве примеси.
Определение оптимального соотношения реагентов— крахмал / этиленоксид при щелочном катализе
В потенциальную энергию модельных соединений и фрагментов цепей ГЭК, как функцию их геометрических параметров, включали энергию невалентных и электростатических взаимодействий, энергию внутримолекулярных водородных связей, деформационную и торсионную составляющие [169]. Невалентные взаимодействия атомов рассчитывали с помощью потенциалов Скотта—Шераги [170], при моделировании взаимодействия боковых заместителей друг с другом и остальными валентно несвязанными атомами использовали также эффективные потенциалы [171]. Электростатические взаимодействия избыточных зарядов на атомах рассчитывали в монопольном приближении при є3ф-4; парциальные заряды заимствованы из работы [172]. Энергии водородных связей оценивали исходя из потенциалов типа 12—10 [173]. Заторможенное внутреннее вращение групп атомов учитывали посредством потенциалов Питцера (Uc-c=3,0 и Uc-о=1,0 ккал/моль). Энергию деформации валентных углов рассчитывали в приближении Гука (Сс=30 и Со=70 ккал/моль-рад). Длины валентных связей в фрагментах цепей ГЭК взяты из усредненных рентгеноструктурных данных [169]. Устойчивую конформацию выбранного фрагмента ГЭК определяли минимизацией его потенциальной функции по заданному числу независимых переменных с использованием процедуры [169]. Зависимые углы вычисляли по формулам [169], формирование пиранозного цикла осуществляли с помощью "стягивающего" потенциала. Торсионные углы боковых привесков отсчитывали согласно предложенной ранее унифицированной системе [169]. Нулевым значениям углов ц \—ф4 отвечает антипараллельное или трансрасположение С—Н- и О—R-связей соответственно, а нулевым значениям углов ф5 и фб — антипараллельное расположение связей С-5—Н-5 и С-6—0-6, С-5—С-6 и 0-6—R (R=H, гидроксиэтильная группа). Устойчивые значения углов ф; в областях 0, +120 и —120 (при отсчете по часовой стрелке по направлению вдоль связей 0- С и С-6— С-5) обозначены буквами Т, G+ - и G (i=l,-.,6).
По данным ЯМР-спектроскопии углеводы на основе пираноз, их моноциклические производные существуют в двух креслообразных конформациях цикла 4Ci и !С4 [169]. Конформационный анализ молекул производных a-D-глюкопиранозидов показал, что независимо от способа замещения, числа боковых групп при любых пространственных ориентациях боковых привесков энергии предпочтительных конформеров с -формой цикла превышают более чем на 2 ккал/моль энергии предпочтительных конформеров с формой цикла 4С\. Поэтому в конформационном анализе фрагментов ГЭК структуры с конформацией цикла !С4 были исключены из рассмотрения как маловероятные. В оптимальных конформациях молекул полностью замещенных D-глюкопираноз отклонения торсионных и валентных углов пиранозного цикла от соответствующих значений в молекулах незамещенной D-глюкопиранозы не превышают 3, т.е. не наблюдается существенных искажений пиранозного цикла при замещении ОН групп. Аналогичная картина фиксирована нами при проведении предварительного анализа геометрических параметров пиранозного цикла в мономерных единицах ГЭК с транс-расположением гидроксиэтильных групп у С-2, С-3 и С-6. Двугранные углы пиранозных циклов находились в пределах 54—63, что сопоставимо с 56—62 для идеализированной формы пиранозного цикла. В последующих расчетах потенциальной энергии фрагментов цепей ГЭК геометрия пиранозных циклов оставалась фиксированной.
В мономерных звеньях амилозы (a-D-глюкан) каждый из торсионных углов ф2, фз, ф5, фб в максимальном случае может принимать три устойчивых значения, т.е. при фиксированной форме пиранозного цикла возможное число конформационных состояний с разным значением энергии, обусловленных различной пространственной ориентацией боковых групп, составляет 3 =81. В линейных участках амилопектина сохраняется та же ситуация, в разветвленных участках число конформационных состояний ограничивается. При гидроксиэтилировании амилопектина общее число возможных конформационных состояний замещенных звеньев ГЭК существенно возрастает вследствие вклада разрешенных ротамеров гидроксиэтильных групп. В фрагментах цепей ГЭК каждый из торсионных углов ф, боковых -ОН и -СН2ОН групп также может принимать не более трех устойчивых значений, максимальное число ротационных состояний гидроксиэтильной группы, присоединенной к глюкопиранозному остатку, не превышает 34=81.
Согласно [169] моно-, ди-, три- и тетра-О-метил-сс-О-глюкопиранозиды являются наиболее простыми модельными соединениями, на которых можно. проследить основные пространственные эффекты и закономерности, связанные с замещением атомов водорода ОН-групп на глюкопиранозные остатки при построении макромолекул a-D-глюканов. При этом ди-О-метил-а-1,4-Б-глюкопиранозу можно рассматривать как простейший аналог линейного полисахарида - амилозы, три-О-метильные производные — как аналоги разветвленных a-D-глюканов (декстран, крахмал), тетра-О 128 метальные производные — как модели производных декстрана и крахмала. Минимизация потенциальных функций указанных модельных соединений по углам ф и а, определяющим геометрию боковых групп, показала, что в каждом случае имеет место большое число конформеров с близкими значениями энергии и торсионными углами, характерными для Т, G+ и G" областей. Ряд состояний из максимально возможного числа энергетически невыгоден, так как невалентные взаимодействия оказывают запрет на отдельные значения торсионных углов боковых групп. Исходя из больцмановского распределения, при 298 К доля каждого запрещенного состояния в равновесной смеси конформеров оценена нами на уровне 0,02%.
Ранее [169] были найдены ротационные запреты для замещенных D-глюкопираноз и их связь с конфигурацией асимметрических центров молекулы, числом и местом локализации боковых заместителей, наличием внутримолекулярных водородных связей. Выведена общая формула расчета числа разрешенных ротационных состояний (Np) молекулы D-глюкопиранозы и всех ее ОМе-производных.
В рамках вышеуказанного подхода нами исследованы конформационные состояния мономёрных единиц ГЭК, за аналоги которых были приняты молекулы моно-, ди-, три-ОМе-О-гидроксиэтил-ос-О-глюкопиранозидов. Конформационный анализ этих модельных соединений показал, что в них полностью сохранились ротационные запреты, типичные для моно-, ди-, три-OMe-oo-D-глюкопиранозидов. Появление гидроксиэтильных групп у С-2, С-3 и С-6 приводит к появлению дополнительных одиночных и парных запретов на отдельные значения торсионных углов, характеризующих их геометрию. Геометрические параметры боковых привесков, участвующих в запрете, существенно отличаются от параметров для оптимальных конформаций. Тестом сильно перегруженных структур по-прежнему служат высокие значения валентных углов (ос 120) и большие отклонения торсионных углов ОМе и гидроксиэтильных групп от идеальных значений (вплоть до 30).
