Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Монодисперсные полимерные частицы 12
1.1.1 Однородность по размеру (монодисперсность частиц) 12
1.1.2 Агрегативная устойчивость частиц 13
1.1.3 Электростатическая стабилизация поверхности частиц 15
1.1.4 Природа и концентрация поверхностных функциональных групп
1.2 Механизм безэмульгаторной эмульсионной полимеризации 17
1.3 Методы формирования катионных полимерных частиц 22
1.3.1 Эмульсионная полимеризация 23
1.3.2. Безэмульагаторная эмульсионная полимеризация 32
1.3.3 Микро- и миниэмульсионная полимеризации 38
1.3.4 Дисперсионная полимеризация 42
1.3.5 Осадительная полимеризация 1.4 Применение катионных частиц в медицине и биотехнологии 46
1.5 Выводы по главе 1 50
Глава 2 Экспериментальная часть 52
2.1 Основные реагенты 52
2.2 Методы гетерофазной полимеризации
2.2.1 Общая методика синтеза частиц 55
2.2.2 Синтез частиц П(ММА-ВФА) 55
2.2.3 Синтез частиц П(ММА-АМГХ) 56
2.2.4 Синтез частиц П(ММА-ВФА-ДМЭГ) 56
2.2.5 Синтез частиц П(ММА-АМГХ-ДМЭГ) 56
2.2.2 Синтез частиц П(ММА-АМГХ-МБА) 57
2.3 Формирование алифатических аминогрупп на поверхности частиц 57
2.4 Определение характеристик полимерных частиц з
2.4.1 Определение диаметра полимерных частиц методом электронной микроскопии 58
2.4.2 Определение диаметра методом динамического светорассеяния 58
2.4.3 Определение -потенциала частиц 59
2.4.4 Определение молекулярной массы водорастворимых олигомеров 59
2.4.5 Определение конверсии мономеров 60
2.4.6 Определение удельной поверхности частиц 60
2.4.7 Определение концентрации функциональных групп методом кондуктометрического титрования
2.4.1 Соотношение золь/гель фракции полимерных частиц 61
2.4.2 Контактный угол смачивания пленок на основе частиц 62
2.4.3 Твердофазная 13C ЯМР-спектроскопия 62
2.4.4 Определение агрегативной устойчивости частиц П(ММА-ВФА-ДМЭГ)
методом поточной ультрамикроскопии 62
2.5 Определение специальных свойств полимерных частиц 63
2.5.1 Хемосорбция люминофора на поверхность частиц 63
2.5.2 Связывание белка с поверхностью частиц 65
2.5.3 Реакция латекс-аглютинации для определения вируса клещевого энцефалита 67
Глава 3 Результаты и их обсуждение 70
3.1 Монодисперные катионные частицы на основе полиметилметакрилата 70
3.1.1 Синтез частиц методом безэмульгаторной эмульсионной сополимеризации 70
3.1.2 Молекулярная масса водорастворимых олигомеров 81
3.1.3 Определение удельной поверхности полученных частиц 83
3.2 Агрегативная устойчивость полимерных частиц 86
3.2.1 Агрегативная устойчивость частиц П(ММА-ВФА-ДМЭГ) 87
3.2.2 Агрегативная устойчивость частиц П(ММА-АМГХ-ДМЭГ) 92
3.2.3 Агрегативная устойчивость частиц П(ММА-АМГХ-МБА) 95
3.3 Модификация монодисперсных полимерных частиц 97
3.3.1 Модификация бычьим сывороточным альбумином частиц П(ММА-ВФА-ДМЭГ) 98
3.3.2 Модификация бычьим сывороточным альбумином частиц П(ММА-АМГХ-ДМЭГ) 104
3.3.3 Модификация бычьим сывороточным альбумином частиц П(ММА-АМГХ-МБА) 106
3.3.4 Определение вируса клещевого энцефалита методом реакции латекс-агглютинации с использованием частиц П(ММА-АМГХ-МБА) 110
Заключение 123
Список сокращений 124
Списоклитературы 127
- Механизм безэмульгаторной эмульсионной полимеризации
- Синтез частиц П(ММА-ВФА)
- Определение концентрации функциональных групп методом кондуктометрического титрования
- Определение удельной поверхности полученных частиц
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В последние десятилетия значительно возрос интерес к полимерным латексным дисперсиям, которые образуются в процессе гетерофазных полимеризаций. Основными преимуществами таких полимерных частиц является возможность направленного регулирования их размера, узкое распределение по размерам и локализация в поверхностном слое реакционноспособных функциональных групп. Благодаря вышеупомянутым свойствам они нашли широкое применение во многих областях науки и техники. Эти частицы используются как адгезивы, покрытия на водной основе, аддитивы, флокулянты, материалы для калибровки высокоточных приборов и при производстве тканей и бумаги.
Немаловажную роль полимерные латексы играют в медицине и биотехнологии, где
применяются как носители биологически активных веществ, при инкапсуляции ферментов, а
также при идентификации и разделении клеток. Применение полимерных частиц,
синтезированных с помощью эмульсионной полимеризации, в качестве носителей
биологически активных веществ впервые показано в 1956 году, где полимеры были
использованы в качестве серологического диагностикума ревматоидного артрита in vitro.
После этого появились публикации по применению полистирольных и
полиметилметакрилатных частиц в биомедицинском направлениив комбинации с другими биотехнологическими разработками.
В иммуноанализе частицы применяются в качестве тест-систем при проведении реакции латекс-аглютинации. Основными преимуществами этого метода диагностики инфекционных заболеваний перед другими методами является высокая чувствительность, относительная дешевизна эксперимента, воспроизводимость и специфичность теста, а также возможность проведения анализа практически в любых условиях.
Большинство представленных публикаций и обзорных статей рассматривают
применение в иммуноанализе отрицательно заряженных частиц. Это связано как с большим
разнообразием реакционноспособных функциональных групп: карбоксильных,
гидроксильных, сульфогрупп и хлорсульфоновых, так и с относительной легкостью их получения. Однако в последнее время особый интерес представляют частицы с положительным поверхностным зарядом - катионные частицы.
Интерес к таким частицам обусловлен их уникальными свойствами, такими как положительный заряд, хорошие химические и механические свойства, низкое поверхностное натяжение. Кроме того, была отмечена перспективность использования катионных частиц за счет лучшей стабильности при постановки тестов латекс-агглютинации в результате большей сорбции биологически активных веществ.
В литературе существуют работы по двухстадийным методам синтеза катионных частиц, по созданию частиц с вторичными или третичными аминогруппами. Нашей группой был разработан метод синтеза частиц с алифатическими аминогруппами. Однако для их стабилизации были использованы производные декстрана, что не позволяет локализовать в поверхностном слое достаточное количество реакционно способных функциональных групп.
В связи с вышесказанным является актуальной разработка одностадийного метода синтеза монодисперсных частиц с алифатическими аминогруппами, локализованными в поверхностном слое. При этом концентрация поверхностных групп должна быть такой, чтобы, с одной стороны, частицы оставались агрегативно устойчивы в физиологических растворах в течение длительного времени. С другой стороны, частицы должны быть способны к физическому или химическому присоединению биологически активных веществ.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ «Исследование самоорганизации монодисперсных люминофор-содержащих полимерных частиц в полимерные или гибридные трехмерные структуры, проявляющие свойства фотонных кристаллов» (№13-03-00741 А), гранта «УМНИК» «Разработка полимерных монодисперсных катионных частиц на основе сополимеров метилметакрилата, перспективные в качестве носителей биолигандов» Фонда содействия развитию малых предприятий в научно-технической сфере (№ 1606ГУ1/2014 и № 6925ГУ2/2015), грантов Правительства города Санкт-Петербург за 2014, 2015 и 2016 года (серия ПСП № 14028, №15318 и № 16490).
Цель работы состояла в разработке одностадийного метода синтеза монодисперсных катионных частиц на основе сополимеров метилметакрилата с JV-винилформамидом или 2-аминоэтилметакрилата гидрохлоридом в присутствии сшивающих агентов - диметакрилата этиленгликоля или #Д-метилен-бис-акриламида, а также создании на основе синтезированных частиц носителей биологически активных веществ. В ходе исследования решались следующие задачи:
Синтез монодисперсных частиц методом безэмульгаторной эмульсионной сополимеризацией на основе сополимеров метилметакрилата с #-винилформамидом или 2-аминоэтилметакрилата гидрохлоридом в присутствии сшивающих агентов -диметакрилата этиленгликоля или #Д-метилен-бис-акриламида.
Выявление влияния концентрации сшивающих агентов на характеристики синтезированных частиц и кинетику реакции сополимеризации.
Определение физико-химических характеристик полимерных частиц, таких как размер, распределение частиц по размерам, концентрация поверхностных функциональных групп, электрокинетический потенциал, удельная поверхность.
Изучение молекулярной массы и содержания олигомерных цепей, обеспечивающих стабилизацию частиц в реакционной системе.
Исследование агрегативной устойчивости частиц в физиологических растворах в диапазоне рН от 2 до 10.
Исследование влияния сорбции люминофора флуоресцеин 5(6)-изотиоцианата и модельного биолиганда - бычьего сывороточного альбумина на агрегативную устойчивость частиц.
Применение синтезированных частиц при постановке тестов реакции латекс-агглютинации для выявления антител вируса клещевого энцефалита.
Научная новизна.
Разработан новый метод получения субмикронных монодисперсных положительно заряженных частиц на основе сополимеров метилметакрилата с JV-винилформамидом или 2-аминоэтилметакрилата гидрохлоридом в присутствии сшивающих агентов - диметакрилата этиленгликоля или #Д-метилен-бис-акриламида под действием азоинициатора - 2,2’-азобис[2-(2-имидозалин-2-ил)пропан] дигидрохлоридом с поверхностными алифатическими аминогруппами. Впервые проведено комплексное исследование влияния состава реакционной системы и условий синтеза на агрегативную устойчивость частиц в физиологических растворах в диапазоне рН от 2 до 10. Продемонстрированы основные закономерности влияния хемосорбции люминофора флуоресцеин 5(6)-изотиоцианата на физическую адсорбцию биолиганда белковой природы - бычьего сывороточного альбумина. Впервые показана принципиальная возможность разработанных частиц выступать в качестве носителей биологически активных веществ при выявлении антител вируса клещевого энцефалита методом реакции латекс-агглютинации в условиях как индивидуального анализа, так и масштабного скрининга.
Теоретическая и практическая значимость работы.
В рамках работы разработан одностадийный метод синтеза положительно заряженных монодисперсных частиц с поверхностными алифатическими аминогруппами. Выявлены факторы, позволяющие регулировать в процессе синтеза размер, распределение по размерам частиц, концентрацию поверхностных функциональных групп, а также агрегативную устойчивость частиц в физиологических растворах. Разработанные катионные частицы перспективны при использовании в медицине и биотехнологии. Так, частицы на основе сополимеров метилметакрилата с 2-аминоэтилметакрилата гидрохлоридом и сшивающим агентом ІУД-метилен-бис-акриламидом могут быть применены как носители биологически активных веществ в диагностических лабораториях и медицинских учреждениях для выявления антител вируса клещевого энцефалита методом реакции латекс-агглютинации.
Положения, выносимые на защиту:
Варьирование состава реакционной смеси и условий синтеза в процессе безэмульгаторной эмульсионной сополимеризации метилметакрилата с Д-винилформамидом или 2-аминоэтилметакрилата гидрохлоридом в присутствии сшивающих агентов -диметакрилата этиленгликоля или ЖД-метилен-бис-акриламида, позволяют регулировать концентрацию алифатических аминогрупп в поверхностном слое частиц.
Введение в реакционную систему 2-аминоэтилметакрилата гидрохлорида, содержащего в своей структуре алифатическую аминогруппу, и гидрофильного сшивающего агента N,N-метилен-бис-акриламида приводит к образованию таких водорастворимых олигомеров, которые обеспечивают эффективную стерическую и электростатическую стабилизацию частиц в физиологических растворах в широком диапазоне pHдисперсионной среды.
Локализованные в поверхностном слое алифатические аминогруппы позволяют проводить ковалентное присоединение люминофора флуоресцеин 5(6)-изотиоцианата, при этом его локализация незначительно уменьшает адсорбцию бычьего сывороточного альбумина на поверхность частиц.
Только при физической сорбции антигенов вируса клещевого энцефалита на поверхность частиц на основе сополимеров метилметакрилата с 2-аминоэтилметакрилата гидрохлоридом и сшивающим агентом ДД-метилен-бис-акриламидом происходит такая ориентация белковых молекул, которая позволяет эффективно определять антитела вируса клещевого энцефалита методом реакции латекс-агглютинации.
Степень достоверности и апробация результатов.
Результаты исследований представлены на следующих конференциях и симпозиумах: 8ой,
9ой и 10ой конференции «Cовременные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург,
2012, 2013 и 2014) и 11th and 12th «Modern problems of polymer science» conferences (Санкт-
Петербург, 2015 и 2016), на Шестой Всероссийской Каргинской Конференции «Полимеры —
2014» (Москва, 2014), на IX International conference of young scientists on
chemistry«Mendeleev-2015» (Санкт-Петербург, 2015), на 8th International
Symposium«Molecular mobility and order in polymer systems» (Санкт-Петербург, 2014), на конференциях, посвященных 184ой, 185ой, 186ой, 187ой, 188ой годовщине образования Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) (Санкт-Петербург, 2012, 2013, 2014, 2015, 2016), на III, IV, Vи VI конференциях «Неделя науки» (Санкт-Петербург, 2013, 2014, 2015, 2016), на Iфоруме молодых ученых U-Novus(Томск, 2014), а также на ХXI Всероссийской конференции Яльчик-2014 «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2014).
Список работ, опубликованных автором по материалам диссертации
По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, при этом 4 статьи входят в список ВАК, 3 из них – индексированы в системах Web of Science и Scopus, а также 15 тезисов по материалам докладов, представленных на научно-практических конференциях и симпозиумах.
Структура и объем работы
Механизм безэмульгаторной эмульсионной полимеризации
Силы отталкивания обусловлены, прежде всего, столкновением дисперсных частиц, двойные электрические слои (ДЭС) которых при этом перекрываются.
Строение ДЭС в своей работе описал Штерн [18], основываясь на теориях строения ДЭС Гуи-Чэпмена и Гельмгольца-Перрена. Согласно теории Штерна в реальных условиях ДЭС находится постоянно в динамическом состоянии и имеет размытую структуру, состоящую из двух слоев:
Слоя Гельмгольца (иногда называют слой Штерна) или адсорбционного слоя, примыкающего непосредственно к межфазной поверхности. Толщина этого слоя равна радиусу потенциалопределяющих ионов в несольватированном состоянии. Слоя Гуи или диффузного слоя, в котором расположены противоионы. Толщина этого слоя (А) зависит от свойств системы, и рассчитывается по формуле 1.5. „ Is.sRT 1 Л = \НЬїГ = - (1.5) V lb 1 % где є - диэлектрическая проницаемость среды, s0 - диэлектрическая проницаемость в вакууме, R - универсальная газовая постоянная, равная 8,314 Дж/мольК, F - постоянная Фарадея, равная 96458,33 Кл/моль, / - сила тока, А. Основываясь на теории строения ДЭС, Дерягиным, Ландау, Вервеем и Овербиком [19-21] были рассмотрены вопросы устойчивости заряженных гидрофобных золей. Эта теория впоследствии получила название теория ДЛВО.
Авторы показали, что с увеличением полидисперсности частиц уменьшается их устойчивость, увеличение электрического потенциала поверхности частиц способствует повышению устойчивости, а изменение поверхностного потенциала между отдельными частицами имеет противоположный эффект.
Влияние размера частиц на энергию их взаимодействия неоднозначно. Так, если частицы имеют размер меньше толщины двойного электрического слоя, т.е. г 1, то устойчивость возрастает с увеличением размера частиц, поскольку отталкивание ДЭС действует вне области распространения дисперсионных сил. Однако влияние размера частиц может быть и противоположным - при концентрации электролита, близкой к критической концентрации коагуляции (ККК). При увеличении размера частиц Кэрол в работе [17] указал на необходимость модификации теории ДЛВО, в частности модифицировать выражение для электростатических сил отталкивания VR, и тогда выражение 1.5 становится применимо для частиц, у которых размер велик по сравнению с толщиной ДЭС (формула 1.6). ЄТЦ/ О t Г1 -УНГ. -\ VR= Щ\ + Є J (1.6) где г - радиус частицы, мкм; у/ - электрический потенциал частицы на расстоянии 3 от поверхности, В; X - величина, обратная толщине ДЭС, мкм-1; Н0- расстояние между поверхностями частиц, мкм. 1.1.4 Природа и концентрация поверхностных функциональных групп Использование гидрофильных функциональных сомономеров и/или ионогенных инициаторов в процессе синтеза монодисперсных полимерных частиц обусловливает существование на их поверхности различных функциональных групп [22]. При ионизации этих групп изменяется поверхностный заряд частиц, который способствует повышению агрегативной устойчивости полимерных систем. В настоящее время хорошо изучены способы получения частиц с отрицательно заряженными функциональными группами, такими как карбоксильные, гидроксильные, сульфогрупп и хлорсульфоновые. Однако в последнее время особый интерес представляют частицы с положительным поверхностным зарядом, поскольку обладают более сильной склонностью к взаимодействию с биологически активными веществами (БАВ)[5].
Безэмульгаторная эмульсионная полимеризация (БЭП) является частным случаем традиционной эмульсионной полимеризации (ЭП). Главным преимуществом БЭП является отсутствие эмульгаторов, которые непременно приводят к экранированию поверхностно-функциональных групп. Безусловно, отсутствие эмульгатора в системе меняет теорию образования частиц по сравнению с ЭП.
Стадии, которые присутствуют в ЭП, также присущи и БЭП, но прохождение и длительность зависят от мономеров, состава реакционной среды и условий полимеризации. Можно выделить следующие стадии:
1. Инициирование – зарождение активных центров полимеризации за счет взаимодействия радикалов инициатора с первичной молекулой мономера;
2. Рост цепи – присоединение молекул мономера к растущему макрорадикалу, характеризующееся постоянством скорости полимеризации вплоть до исчезновения мономерной фазы, что связано с постоянной концентрацией мономера и радикалов в частицах малого размера (в среднем 0,5 радикала на одну частицу);
3. Обрыв цепи – взаимодействие макрорадикалов, при котором происходит уменьшение скорости процесса, зависящее от баланса между концентрациями мономера и радикалов в частицах. Таким образом, для БЭП сохраняются основные закономерности, характерные для ЭП, а наиболее важные отличия касаются стадии инициирования полимеризации, а также формирования частиц и механизма их стабилизации.
Впервые о БЭП упомянуто в статье Баксендела и Эванса [23], где они продемонстрировали возможность проведения полимеризации метилметакрилата (ММА) в отсутствии катионных ПАВ. Авторы объясняют образование стабильных латексных частиц механизмом гомогенной нуклеации. Одним из наиболее важных отличий БЭП от ЭП являетсяпротекание стадии инициирования – полимеризация протекает в полимер-мономерных частицах (ПМЧ), а не в мицеллах эмульгатора.
Отсутствие однозначных данных о механизме образования ПМЧ связано с тем, что исследование начальной стадии гетерофазной полимеризации затруднено, так как одновременно происходят эмульгирование мономера, инициирование полимеризации, зарождение ПМЧ и формирование межфазных адсорбционных слоев, определяющих стабильность ПМЧ. Изучение каждой стадии отдельно не дает полноценного представления о реальном механизме процесса [24].
Фитчем [25] и Флори [26] было установлено, что среднее значение времени жизни первичного радикала в водной фазе очень мало, чтобы ожидать, что он присоединит растворенную мономерную молекулу, прежде чем сам войдет в частицу. Однако если маслорастворимые инициаторы могут диффундировать в ПМЧ также легко, как и мономер, то водорастворимым инициаторам термодинамически невыгодно выделяться из полярной фазы.
Синтез частиц П(ММА-ВФА)
Определение концентрации поверхностных функциональных групп был проведено методом обратного кондуктометрического титрования. Титрование проводили для очищенной от водорастворимых примесей полимерной дисперсии на кондуктометре SevenMulti (Metler Toledo, IШвейцария).
Для определения слабоосновных амино-, имидазолиновых и алифатических аминогрупп, добавляли избыток HCl известной концентрации, определяя проводимость, и затем последовательно оттитровывали его и функциональные поверхностные группы 0,01 М раствором NaOH [136].
Концентрацию поверхностных альдегидных групп, после ковалентного связывания алифатических аминогрупп с ГА, определяли по избытку выделившейся HCl путем последовательного титрования 0,01 М раствором NaOH.
Для определения гель-фракции полимерных частиц был использован метод непрерывной экстракции Сокслета [137]. Экстракцию проводили в среде дихлорметана при 60 С. Окончание экстрагирования определяли путем измерения коэффициента преломления чистого растворителя перед экспериментом и экстракта (ИРФ-22, Россия). 2.4.2 Контактный угол смачивания пленок на основе частиц
Определение угла смачивания пленок, полученных на основе частиц, проводили на приборе DSA 30 (KRUSS, Германия). Пленки из дисперсий частиц получали с помощью пистолетадля распыления MiniJet 4 HVLP (SATA, США) при давлении 2,5 атм. на поверхность обеспыленных предметных стекол (BioVitrum, Россия). Проводили измерение угла смачивания, затем пленки обрабатывали хлористым метиленом, высушивали образцы до полного удаления растворителя и снова измеряли угол (рисунок 2.4).
Для установления структуры полимерных частиц была использована твердофазная 13C ЯМР-спектроскопия. Синтезированные и очищенные от водорастворимых соединений полимерные дисперсии сначала были высушены на роторном испарителе "Laborota4011 (Heidolph, Германия) при пониженном давлении и температуре 40 C. Затем были получены ЯМР-спектры полимеров на приборе Bruker CP/MAS (США). Скорость вращения образца составляла 10 кГц, угол вращения 52 , в качестве реперного образца был использован глицин.
Для определения агрегативной устойчивости частиц П(ММА-ВФА-ДМЭГ), модифицированных как ФИТЦ, так и ФИТЦ+БСА был использован метод поточной ультрамикроскопии [194-198]. В работе применен прибор ВДК-4, модифицированный для работы с гидрозолями. В качестве источника поляризованного света использовали красный лазер с длиной волны 620 нм и зеленый лазер с длиной волны 532 нм. результаты изучения кинетики коагуляции частиц были представлены в виде зависимости степени их агрегации от времени. Степень агрегации определяли по формуле 2.2: ant n = — (2.2) где a - константа диафрагмы микроскопа; nt - число частиц, наблюдаемое в течение времени t, частиц; w - скорость протекания золя через кювету, см3/мин; t - время наблюдения, мин. При таком методе определения численной концентрации отпадают почти все источники ошибок, возможные при других методах счета, кроме того, значительно сокращается время исследования. Для удобства сравнения полученных данных с теорией быстрой коагуляции Смолуховского результаты изучения кинетики коагуляции частиц были представлены в виде зависимости степени их агрегации от времени. Степень агрегации определяли по формуле 2.3: n m = (2.3) nt где т - степень агрегации; щ - начальная концентрация частиц, частиц/см3; пТ– текущая концентрация частиц, частиц/см3. Ковалентное связывание ФИТЦ по алифатическим аминогруппам, локализованным в поверхностном слое полимерных частиц, проводили в водно-спиртовой дисперсии (рисунок 2.5). К водной дисперсии объемом 1.0 мл с С.О. 3,9 мас. 0,05-4,0 мг/мл. % добавляли спиртовой раствор ФИТЦ концентрацией Полученную дисперсию выдерживали 2 часа, при комнатной температуре и непрерывном перемешивании, после чего центрифугировали в течение 30 минут при 10000 об/мин (Centrifuge 5804, Eppendorf, Германия), и частицы заново редиспергировали в водно-спиртовом растворе (соотношение H2O:EtOH составляло 2:3 об.ч.). Процедуру повторяли несколько раз до исчезновения окраски в окраски надосадочной жидкости. Измерение максимумов спектров пропускания надосадочной жидкости (=478 нм) на спектрофотометре Ocean Optics QE6500 (США) позволило определить количество ковалентно связанного ФИТЦ на поверхности частиц (рисунок 2.6а). При этом предварительно была построена калибровочная зависимость концентрации ФИТЦ в смеси растворителей (H2О+C2H5OH)(рисунок 2.6б). Способность частиц сорбировать БАВ была исследована на примере бычьего сывороточного альбумина (БСА) и антигенов ВКЭ. Связывание антигенов ВКЭ с частицами проводили как за счет физической, так и за счет химической сорбции. Связывание БСА с частицами изучена только для физической сорбции. Физическую сорбцию белков проводили в фосфатном и фосфатно-солевом буферных растворах, химическое связывание антигенов ВКЭ происходило в карбонатном буферном растворе.
В случае физической сорбции к водной дисперсии полимерных частиц с С.О. 5 мас. % и объемом 200 мкл добавляли раствор белка концентрацией от 1 нг/мл до 1 мг/мл. Далее перемешивали в ультразвуковой ванне в течение 15 минут и инкубировали при комнатной температуре еще в течение 2 часов при постоянном перемешивании. Полученные коньюгаты оставляли в холодильнике на 20 часов при температуре 5 С. Затем центрифугировали в течение 30 минут при 10000 об/мин и отбирали по 0.5 мл надосадочной жидкости.
Для химического связывания полимерных частиц с антигенами ВКЭ было использовано два подхода. Первый подход заключался в предварительной модификации ГА алифатических аминогрупп частиц, с последующим присоединением антигенов ВКЭ.
Присоединение ГА проводили к частицам с С.О. 5 мас. % в фосфатно-солевом буферном растворе разбавленном в 2 раза при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Концентрация ГА варьировалась от 1 до 5-кратного избытка по отношению к поверхностным функциональным группам частиц. Затем частицы были трехкратно отцентрифугированы в течение 30 минут при 10000 об/мин и редиспергированы в бидистиллированной воде.
Второй подход состоял в предварительной модификации ГА аминогрупп лизина и аргинина, входящих в структуру антигенов ВКЭ. Модификация была проведена в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе при pH 9 при 10-кратном избытке ГА по отношению к количеству аминогрупп антигенов. Модифицированные антигены были очищены с помощью диализной мембраны Cellu-Sep T1 с номинальным отсечением по молекулярной массе равной 3500 Да. Далее хемосорбцию антигенов ВКЭ проводили по такой же методике, как и при физическом связывании.
Содержание белковых компонентов определяли по методу Лоури [138, 139]. Для этого использовались следующие реагенты:
Реактив Лоури-Фолина. В 2-литровой колбе растворяли 100 г вольфрамата натрия и 25 мг молибдата натрия в 700 мл дистиллированной воды. К раствору добавили 50 мл 80 % раствора фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Кипятили с обратным холодильником 10 часов, прибавили 150 г сульфата лития, 50 мл воды и несколько капель брома. Кипятили без холодильника 15 минут для удаления избытка брома. После охлаждения до комнатной температуры довели объем раствора до 1 литра.
Определение концентрации функциональных групп методом кондуктометрического титрования
Поскольку в биомедицинских приложениях также применимы частицы диаметром 100-200 нм [156-158] был проведен синтез катионных частиц П(ММА-АМГХ-ДМЭГ) в условиях опыта 6а при температуре реакции 80 С (опыт 9а, таблица 3.1). Повышение температуры реакционной системы закономерно привело к уменьшению диаметра частиц до 205 нм. Такое изменение обусловлено тем, что в начальный момент времени при увеличении температуры образуется большее количество олигорадикалов, что приводит к возрастанию скорости полимеризации и формированию большего числа ПМЧ. Таким образом, использование ДМЭГ и АМГХ позволило получить частицы П(ММА-АМГХ-ДМЭГ) диаметром 205-410 нм, и уменьшило количество точечного коагулюма, образующегося в ходе синтезов, до 1,6 мас. %.
Другим фактором, позволяющим регулировать размер и структуру поверхностного слоя полимерных частиц является смена сшивающего агента [159-161]. Использование ДМЭГ не позволило получить катионные частицы П(ММА-АМГХ-ДМЭГ) диаметром менее 200 нм. Поэтому был использован другой сшивающий агент – МБА, который обладает большей растворимостью в водепо сравнению с ДМЭГ, а, следовательно, более гидрофильными свойствами. С одной стороны, повышение гидрофильных свойств системы обеспечивает меньший размер частиц, а с другой - уменьшает неспецифические гидрофобные взаимодействия на поверхности полимерных частиц с БАВ при их дальнейшем использовании в биомедицине.
По аналогии с синтезом частиц П(ММА-АМГХ-ДМЭГ) первоначально МБА был использован при концентрации 5 мас. % (таблица 3.1,опыт 5м). Однако оказалось, что такая концентрация МБА приводила к образованию коагулюма до 75 мас. %. Образование большого количества коагулюма происходило за счет высокой реакционной способности МБА, который сшивал не только полимерные цепи, но и ПМЧ между собой. Поэтому с целью предотвращения агрегации системы концентрация сшивателя была уменьшена до 0,1-1,0 мас. %. В результате во всех синтезах частиц П(ММА-АМГХ-МБА) образование коагулюма не наблюдалось (таблица опыты 1м-4м). Отсутствие точечного коагулюма, скорее всего, связано с более быстрым расходованием МБА в процессе сополимеризации, в связи с чем в дисперсионной среде происходило образование большего количества олигомерных ПАВ, которые адсорбировались на поверхность ПМЧ и обеспечивали их дополнительную электростатическую стабилизацию.
Варьирование концентрации МБА приводило к образованию катионных частиц П(ММА-АМГХ-МБА) меньшего размера по сравнению с частицами сравнения П(ММА-АМГХ), размер которых составил 240 нм (таблица 3.1, опыт 1а). Так, введение 0,1-1,0 мас. % сшивателя, с одной стороны, привело к снижению размера частиц до 155-200 нм (таблица 3.1, опыт 1м-4м), а с другой стороны, позволило уменьшить индекс полидисперсности частиц до 0,01-0,04 по сравнению с частицами 1а, где PDI составил 0,12. Данные ПЭМ во всех случаях также подтверждали формирование частицс ферической формы с гладкой структурой поверхностного слоя (рисунок 3.1(в)). Кроме того, увеличение концентрации сшивателя в синтезе частиц закономерно способствовало увеличению гель-фракции с 5 до 57 мас. % при 0,1 и 1,0 мас. % МБА соответственно (таблица 3.1, опыт 1м и 4м). Таким образом, введение МБА при синтезе частиц П(ММА-АМГХ-МБА), как и в случае синтеза частиц П(ММА-АМГХ-ДМЭГ), практически не влияло на форму и размер частиц. Однако, добавление сшивающего агента позволило исключить образование точечного коагулюма в ходе реакции и уменьшило индекс полидисперсности частиц за счет образования большего количества олигомерных ПАВ и эффективной электростатической стабилизации ПМЧ. При синтезе катионных частиц П(ММА-ВФА-ДМЭГ), П(ММА-АМГХ-ДМЭГ) и П(ММА-АМГХ-МБА) также во всех случаях было исследовано влияние концентрации сшивающих агентов ДМЭГ и МБА на скорость реакции и общую конверсию мономеров (рисунок 3.3 а-в). Оказалось, что добавление ДМЭГ и МБА в синтезе частиц приводило к увеличению скорости реакции. Так, увеличение скорости реакции при синтезе частиц П(ММА-ВФА-ДМЭГ) наблюдалось при добавлении до 4 мас. % ДМЭГ, а при синтезе частиц П(ММА-АМГХ-ДМЭГ) до 3 мас. % ДМЭГ (рисунок 3.3а, б соответственно). Однако добавление 5 мас. % ДМЭГ при синтезе частиц П(ММА-ВФА-ДМЭГ) и 4 и 5 мас. % ДМЭГ при синтезе частицП(ММА-АМГХ-ДМЭГ) снижало скорость реакции. Такая же тенденция наблюдалась при добавлении МБА в синтезе частицП(ММА-АМГХ-МБА): увеличение скорости реакции при введении до 0,6 мас. % МБА, а затем понижение при использовании 1,0 мас. % МБА (рисунок 3.3в). Такое поведение полимеризационной системы очевидно связано с возрастанием вязкости и ограничением диффузии мономеров в растущих ПМЧ [55].
Стоит отметить различие в размерах частиц, полученных методом ПЭМ и ДСР. Размеры всех частиц, полученные методом ДСР, оказались больше в среднем на 30-100 нм по сравнению с размерами, полученными ПЭМ. Это связано с различием в методиках проведения измерений. Определение размера частиц методом ДСР происходит в водных дисперсиях, в то время как в ПЭМ – в высушенном состоянии. Поэтому увеличение размеров полимерных частиц в водной среде связано, с одной стороны, с образованием гидратных оболочек вокруг полимерных частиц, а с другой, с набуханием поверхностного слоя и выдвижением гидрофильных полимерных цепей в водную фазу.
Определение удельной поверхности полученных частиц
Измерение размера частиц 2м+ГА 1 и 2м+ГА 2 при pH 7.4, модифицированных антигенами ВКЭ, показал, что частицы теряли агрегативную устойчивость после модификации БАВ благодаря уменьшению концентрации положительно заряженных групп в поверхностном слое частиц. При этом диаметр частиц во всех случаях достигал (900-2640) нм при PDI (0,19-0,34), что свидетельствовало о неприменимости частиц для исследования РЛА для определения антител ВКЭ in vitro. Алифатические аминогруппы присутствуют в структуре антигенов ВКЭ [174, 175]. Поэтому другим возможным подходом к ковалентному присоединению антигенов ВКЭ по поверхностным аминогруппам частиц, является первоначальная модификация белковых молекул ГА с последующим присоединением к полимерным частицам.
В связи с этим было проведено присоединение ГА к антигенам ВКЭ в 0,05 М КББ растворе при pH 9,6. Связывание ГА проводили по алифатическим аминогруппам аминокислот лизина и аргинина, составляющими 21,4 % от общего количества аминокислотных остатков антигена ВКЭ [176]. При этом для предотвращения сшивки белковых молекул ГА был использован в 10-кратном избытке по отношению к алифатическим аминогруппам антигена. Очистку от непрореагировавшего ГА проводили при помощи диализной мембраны с номинальным отсечением по молекулярной массе 3500 Да.
На следующем этапе была проведена хемосорбция антигенов ВКЭ, модифицированных ГА, по поверхностным аминогруппам частиц 2м в условиях, описанных в разделе 2.5.2. В результате была получена кривая хемосорбции с выходом на плато (рисунок 3.26). Оказалось, что значение хемосорбции антигенов ВКЭ составляет 2,4 мг/м2, при этом хемосорбция белковых компонентов оказалась выше относительно случая, когда антигены присоединяли к частицам 2м+ГА 1 и 2м+ГА 2 (рисунок 3.25). По-видимому, высокое значение хемосорбции антигенов связано, с одной стороны, с большей концентрацией ГА, присоединенного к БАВ, что способствовало ковалентному связыванию большего числа поверхностных аминогрупп частиц. А с другой стороны, за счет физической адсорбции антигенов ВКЭ на поверхность частиц, происходящей параллельно хемосорбции. При этом размер частиц возрастал до (525-4350) нм при PDI 0,33-0,69, а значения -потенциала частиц варьировались от -18,9 до 14,3 мВ, что свидетельствует об отсутствии агрегативной устойчивости частиц и невозможности дальнейшего их использования. Таким образом, ковалентное присоединение антигенов ВКЭ к алифатическим аминогруппам образца 2м является не перспективным подходом для модификации частиц и их последующего использования в РЛА за счет уменьшения их агрегативной устойчивости.
Хемосорбция антигенов ВКЭ, модифицированных глутаровым альдегидом, на частицы 2м Другим способом модификации частиц БАВ является физическая адсорбция на поверхность полимерных частиц белковых компонентов. В опубликованной литературе [4] в качестве полимерных частиц, выступающих как носители БАВ при проведении РЛА, преимущественно применяются полистирольные частицы с отрицательно заряженными поверхностными группами. В связи с чем в качестве образцов сравнения были использованы частицы 1ст на основе полистирола размером 400 нм, PDI 0,02 и -потенциалом -48,1 мВ (NaCl 10-3 M, pH=7,3). Кроме того, для того чтобы установить влияние функционального сомономера АМГХ и сшивающего агента МБА на сорбцию антигенов ВКЭ также были применены катионные частицы 1пм на основе полиметилметакрилата диаметром 260 нм, PDI 0,03 и -потенциалом 24,3 мВ (NaCl 10-3 M, pH=7,3), полученные в присутствии азоинициатора АИП. Все образцы сравнения были синтезированы в лаборатории № 9 «Синтез пептидов и полимерных микросфер» Института Высокомолекулярных Соединения РАН.
Адсорбция антигенов ВКЭ была проведена в ФСБ при pH 7,4 в таких же условиях, которые применялись при сорбции БСА (раздел 2.5.2). В результате были получены кривые адсорбции с выходом на плато для всех исследуемых образцов (рисунок 3.27). Оказалось, что для частиц сравнения 1ст и 1пм максимальное значение сорбции составило (3,3-3,4) мг/м2. Использование частиц 2м привело к уменьшению значения максимальной сорбции антигенов на поверхность частиц до 1,6 мг/м2. Значительная разница между значениями сорбции образца 2м и образцов сравнения связана с гидрофобными свойствами поверхности последних частиц. Так, у ПММА- и ПСт-образцов сравнения угол смачивания составил 83 и 94 соответственно. В то время как угол смачивания частиц 2м равнялся 58 (таблица 3.6). Поэтому за счет более гидрофобных свойств поверхностного слоя частиц наблюдалась большая сорбция антигенов ВКЭ на образцы 1ст и 1пм. Однако, размер ПММА-частиц сравнения 1пм после модификации во всей области исследования составил 850-2500 нм при PDI 0,28-0,41, что свидетельствовало о неустойчивости частиц в ФСБ и невозможности их дальнейшего применения. ПСт-частицы 1ст оказались устойчивы при всех концентрациях антигенов ВКЭ, при этом размер частиц увеличился до 420-435 нм и PDI составил не более 0,06. Частицы 2м при максимальных значения адсорбции также агрегировали, и их диаметр возрастал до 1400 нм при PDI 0,17. Однако, при минимальной адсорбции 0,081 мг/м2 частицы оставались агрегативно устойчивыми и имели размер 260 нм и PDI 0,03.