Введение к работе
Актуальность проблемы. Взаимодействие синтетических полиэлектролитов с поверхностью клеток и модельных объектов -бислойных липидных везикул (липосом) является предметом интенсивного исследования на протяжении последних 30 лет. Как известно, поверхность большинства клеток несет суммарный отрицательный заряд. Поэтому интерес исследователей был сконцентрирован на изучении поведения поликатионов на поверхности натизных и фиксированных клеток либо отрицательно заряженных липосом. Обсуждаемые вопросы касаются различных аспектов такого взаимодействия и включают состав и строение межфазных комплексов; структурные перестройки в липосомальной мембране; конформационные переходы в адсорбированном полиэлектролите; а также агрегацию, слияние и разрушение липосом. Эти проблемы являются предметом многочисленных публикаций, им посвящен ряд обстоятельных обзоров. Полученные результаты представляют интерес с точки зрения прогнозирования возможных последствий контакта полиэлектролитов и биологически активных веществ на их основе с клеточной поверхностью.
Гораздо меньше внимания уделено исследованию взаимодействия поликатионов с клеточными и искусственными биологическими мембранами в условиях конкуренции со стороны отрицательно заряженных макроионов. На это счет имеются отдельные, весьма отрывочные сведения. Между тем этот вопрос представляется чрезвычайно важным. Действительно, оказавшийся в биологическом окружении поликатион неминуемо должен вступать в электростатическое взаимодействие с различными отрицательно заряженными объектами -полисахаридами, ДНК, белками, фрагментами разрушенных клеточных мембран, концентрация которых в любой биологической жидкости достаточно велика. Включение поликатиона в комплекс с этими полианионами может серьезно осложнить и даже полностью подавить его связывание с клеточной поверхностью.
Кроме того, говоря о взаимодействии полиэлектролитов и, в частности, поликатионов с клетками, следует иметь в виду, что на внешней стороне клеточной мембраны располагается гидрофильный слой, гликокаликс, сформированный полисахаридными фрагментами, ковалентно присоединенными к липидным молекулам и мембранным
белкам. Этот слой может оказывать существенное влияние на результат взаимодействия клеток с полиэлектролитами.
Повысить аффинность поликатиона к биологической мембране можно, (1)гидрофобизуя основную цепь полимера либо (2)модифицируя ее боковыми гидрофобными радикалами. Строение таких поликатионов схематически может быть представлено следующим образом (гидрофобные участки изображены заштрихованными прямоугольниками):
0 0 0 00 @0 0 0 о
(1) (2)
Адсорбция таких модифицированных поликатионов на поверхности мембраны может сопровождаться встраиванием гидрофобных фрагментов в гидрофобную часть липидного бислоя, что должно приводить к повышению устойчивости комплексов поликатион-мембрана в присутствии отрицательно заряженных конкурентов.
Цель работы состояла в изучении взаимодействия гидрофобизованных поликатионов, кватернизованных производных поли-4-аинилпиридина (ПВП), с отрицательно заряженными липосомами, а также состава и сбойств полученных комплексов поликатион-липосома. В работе исследованы:
адсорбция поликатионов на поверхности смешанных липосом, приготовленных из отрицательно заряженного дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ) и электронейтрального фосфатидилхолина (яичного лецитина, ЯЛ);
взаимодействие поликатионоэ с КЛ/ЯЛ липосомами, поверхность которых дополнительно гидрофилизована включением в липидный бислой молекул неионогенного ПАВ (Бридж 58) - эфира полиоксиэтилена (ПОЭ) и цетилового спирта. Создаваемая на поверхности липосом гидрофильная "опушка" из коротких цепочек ПОЭ моделировала клеточный гликокаликс;
устойчивость комплексов поликатион-липосома в водно-солевых средах; и
- конкурентные реакции в тройной системе липосома-поликатион-полианион.
Научная новизна. В работе показано, что адсорбция полностью кватернизованного ПВП, содержащего только боковые этильные радикалы, на поверхности КЛ/ЯЛ липосом определяется в основном электростатическим взаимодействием положительно заряженных звеньев поликатиона с отрицательно заряженными группами КЛ. Такой поликатион может быть практически полностью удален с липосомальной мембраны при увеличении ионной силы раствора или в результате добавления избытка полианиона, образующего с поликатионом более прочный отрицательно заряженный нестехиометричный интерполиэлектролитный комплекс (ИПЭК). Модификация поликатиона боковыми цетильными фрагментами (не более 3 мол.%) обеспечивает дополнительную стабилизацию комплекса поликатион-липосома в водно-солевых растворах и в присутствии отрицательно заряженных макроионов за счет встраивания боковых алкильных радикалов в гидрофобную часть липидного бислоя. Целостность липосомальной мембраны при этом сохраняется. Более того, отрицательно заряженные ИПЭК, сформированные гидрофобизованными поликатионами и линейными полианионами, способны адсорбироваться на отрицательно заряженной липосомальной мембране без ее разрушения.
Взаимодействие этилированного ПВП с КЛ/ЯЛ липосомами сопровождается их агрегацией. Агрегаты наибольшего размера формируются при полной нейтрализации поверхностного заряда липосом адсорбированным поликатионом. В отличие от этого гидрофилизованные КЛ/ЯЛ/Бридж липосомы с мольной долей полиоксиэтиленовых "головок" равной 30% сохраняют свой размер даже при полной нейтрализации их поверхностного заряда адсорбированным поликатионом.
При адсорбции гидрофобизованного поликатиона на поверхности КЛ/ЯЛ/Бридж липосом его боковые цетильные радикалы способны проникать сквозь экспонированный в водную фазу слой ПОЭ цепочек и заглубляться в гидрофобную область липосомальной мембраны.
Практическая значимость. Результаты, полученные при
исследовании модельной системы поликатион-липосома, имеют
принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия
синтетических поликатионов и биологически активных веществ на их
основе с клеточной мембраной. Проведенная в работе сравнительная
оценка способности гидрофобизованных поликатионов
взаимодействовать с поверхностью отрицательно заряженных липосом позволяет предложить эффективный способ повышения стабильности комплексов поликатион-биомембрана в водно-солевых средах и в условиях конкуренции со стороны отрицательно заряженных макроионов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международном симпозиуме по мицеллам, микроэмульсиям и монослоям (США: Гайнесвил, 1995); 9 Международной конференции по поверхностным явлениям и коллоидам (Болгария: София 1997); 6 Международном совещании по биокапсулированию (Испания: Барселона, 1997); 212, 213 и 214 Национальных конференциях Американского химического общества (США: Орландо, 1996; Сан-Франциско, 1997; Лас-Вегас, 1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 99 страницах машинописного текста и включает Введение, Литературный обзор, Экспериментальную часть, Обсуждение результатов, Основные выводы и Список цитируемой литературы из 145 ссылок. Работа содержит 39 рисунков и 1 таблицу.
