Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 10
1.1. Векторы доставки генетического материала 10
1.2. Векторы доставки на основе липосом 12
1.3. Экспериментальные исследования цвиттерионных липидов и молекул ДНК 14
1.4. Компьютерное моделирование ДНК и липидного бислоя . 22
ГЛАВА 2. Используемые методы и подходы 28
ГЛАВА 3. Взаимодействие ДНК с липидным бислоем ПОФХ 36
ГЛАВА 4. Взаимодействие ДНК с липидным бислоем ПОФХ в присутствии ионов кальция 40
4.1. Липидный бислой ПОФХ - Ca2+ 40
4.2. ДНК-липидный комплекс. Энергия связывания комплекса . 44
4.3. Молекулярный механизм образования ДНК-липидного комплекса в присутствии ионов кальция. 47
4.4. Связывание ДНК с бислоем с пред-адсорбированными ионами кальция 65
Заключение 71
Список литературы
- Векторы доставки на основе липосом
- Компьютерное моделирование ДНК и липидного бислоя
- ДНК-липидный комплекс. Энергия связывания комплекса
- Связывание ДНК с бислоем с пред-адсорбированными ионами кальция
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Исследование взаимодействий молекул ДНК с цвиттерионными липидными мембранами является важной задачей как с точки зрения практического применения ДНК-липидных комплексов в генной терапии, ДНК-нанотехнологиях, так и для более глубокого понимания биологических процессов, происходящих внутри клетки.
В последние 15-20 лет наблюдается большой интерес к использованию синтетических невирусных средств доставки ДНК (генных векторов). Молекула ДНК является полианионом и, следовательно, способна образовывать стабильные комплексы с положительно заряженными (катионными) молекулами за счет электростатических взаимодействий. Одним из наиболее изученных классов таких молекул являются катионные липиды. Однако клеточные мембраны не содержат в своём составе катионные липиды, только цвиттерионные (нейтральные) и анионные липиды. Поэтому генные векторы на основе катионных липидов являются достаточно токсичными для клеток и организма в целом, и в настоящее время ведутся исследования по возможной замене катионных липидов на цвиттерионные липиды, входящие в состав клеточных мембран и, следовательно, не обладающие токсичностью для организма. В частности, экспериментально было показано, что нейтральные (цвиттерионные) липиды в присутствии двухвалентных ионов металлов ведут себя подобно катионным. Таким образом, одним из возможных безопасных средств доставки ДНК в клетку могут быть векторы на основе цвиттерионных липидов (вместо токсичных катионных липосом).
Помимо использования цвиттерионных липосом в качестве векторов доставки ДНК в клетки исследование взаимодействий ДНК с липидами (в том числе и с цвиттерионными) представляет интерес также и с точки зрения бионанотехнологических применений. Для исследования сложных клеточных механизмов и межклеточных взаимодействий часто используют модельные липидные везикулы и комплементарные свойства ДНК для создания гибридных систем. Взаимодействие с биосистемами наноструктур на основе ДНК неизбежно включает в себя взаимодействие ДНК с липидным бислоем клеточной мембраны, что подчеркивает важность ДНК-липидных взаимодействий для понимания влияния наноматериалов на клеточную поверхность.
В целом, несмотря на большое значение, которое играют ДНК-липидные взаимодействия, точный молекулярный механизм адсорбции ДНК на цвиттерионную мембрану в присутствии двухвалентных ионов и детальная структура получившегося ДНК-липидного комплекса остаются малоизученными. Более того, детальная микроскопическая структура комплекса “ДНК-цвиттерионные липиды” является труднодоступной для
экспериментальных методик, а существующие немногочисленные теоретические работы не описывают полную картину процесса комплексообразования.
Таким образом, несмотря на большой интерес с точки зрения генной терапии, медицины и биотехнологий, микроскопические механизмы, лежащие в основе образования ДНК-липидных комплексов, являются на данный момент все еще малоизученными, что говорит о безусловной актуальности данной работы.
Цель работы:
Исследование механизма адсорбции ДНК на цвиттерионные липидные мембраны, состоящие из молекул фосфатидилхолина, с помощью атомистического молекулярно-динамического компьютерного моделирования. Изучение взаимодействий молекул ДНК с липидными молекулами фосфатидилхолина на микроскопическом уровне и детальный анализ структуры получившихся комплексов.
Задачи исследования
В рамках данной работы были поставлены следующие задачи:
-
Получение профиля свободной энергии для систем “ДНК-липидный бислой” и “ДНК-липидный бислой с пред-адсорбированными ионами кальция”.
-
Проведение компьютерного моделирования адсорбции ДНК на поверхность цвиттерионного липидного бислоя в присутствии ионов кальция. Изучение структурных и динамических характеристик образовавшегося комплекса "ДНК – липидный бислой". Установление молекулярного механизма, лежащего в основе образования комплекса.
Методология и методы исследования
Для достижения поставленных задач было применено компьютерное моделирование методом молекулярной динамики с использованием вычислительных ресурсов суперкомпьютера МГУ “Ломоносов” и компьютерного кластера ИВС РАН.
Научная новизна работы
-
Впервые было проведено атомистическое молекулярно-динамическое моделирование системы ДНК-цвиттерионный липидный бислой, состоящий из молекул фосфатидилхолина (ФХ). В работе были использованы современные модели атомистического разрешения для ДНК (AMBERparmbsc0) и фосфолипидов (AMBER Lipid14).
-
Впервые был рассчитан профиль свободной энергии для системы “ДНК -цвиттерионный липидный бислой” методом молекулярной динамики с использованием моделей атомистического разрешения. Получен потенциальный барьер для взаимодействия ДНК с липидным цвиттерионным бислоем, указывающий на отсутствие взаимодействий ДНК с ФХ бислоем в водном растворе. В то же время показано, что
ионы кальция, адсорбированные на поверхность фосфолипидного бислоя, способствуют адсорбции ДНК на бислой. 3. Впервые в работе показано, что ионы кальция играют ключевую роль в стабилизации ДНК-липидного комплекса посредством связывания фосфатных групп ДНК и липидных молекул. В противовес существующим гипотезам результаты исследования показали, что взаимодействия между холиновыми группами фосфолипидов и фосфатными группами ДНК несущественны для стабилизации комплекса.
Практическая значимость работы
Исследование взаимодействий ДНК с цвиттерионными фосфолипидными молекулами представляет значительный интерес с точки зрения создания генных векторов доставки на основе липосом. К настоящему моменту экспериментально установлено, что ДНК может образовывать с фосфолипидами стабильные комплексы в присутствии двухвалентных ионов, однако молекулярный механизм, лежащий в основе образования комплексов, оставался неизвестным. Для исследования этого механизма в данной работе было использовано атомистическое молекулярно-динамическое компьютерное моделирование. Такой подход позволил детально изучить кинетику адсорбции ДНК на цвиттерионную фосфатидилхолиновую мембрану в присутствии ионов кальция, также структуру и стабильность образовавшегося комплекса. Установленный в работе механизм образования стабильного ДНК-липидного комплекса в присутствии ионов кальция может быть использован для оптимизации существующих генных векторов на основе липосом. Результаты данной работы важны также для более глубокого понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе нековалентных взаимодействий ДНК и наноструктур на основе ДНК с поверхностями сложной структуры, такими как клеточные мембраны.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Цвиттерионный фосфолипидный бислой представляет собой энергетический барьер для
молекулы ДНК. Отсутствие локальных минимумов в профиле свободной энергии
свидетельствует об отсутствии притяжения между ДНК и соответствующим липидным
бислоем.
2. В присутствии ионов кальция наблюдается электростатическое притяжение между
молекулой ДНК и липидным бислоем. Адсорбированные на поверхность бислоя ионы
кальция приводят к появлению минимума в профиле свободной энергии.
3. Впервые установлен молекулярный механизм образования ДНК-липидного комплекса в
присутствии ионов кальция. Адсорбция ионов кальция на цвиттерионную липидную
мембрану приводит к адсорбции ДНК и образованию контактов между фосфатными
группами ДНК и холиновыми группами липидов и формированию кальциевых мостиков
между фосфатными группами липидов и ДНК. Данные кальциевые мостики являются
доминирующим фактором в стабилизации комплекса ДНК-мембрана, так как их время
жизни почти на 2 порядка больше, чем соответствующие времена для контактов между
холиновыми группами липидов и ДНК.
Личный вклад автора заключался в адаптации моделей ДНК и липидного бислоя для
программного пакета Gromacs, построении систем моделирования, проведении
большинства компьютерных экспериментов методом молекулярной динамики, анализе
полученных результатов и непосредственном участии в написании статей под
руководством научного руководителя.
Апробация работы и публикации: результаты данной работы были опубликованы в двух
статьях в международных рецензируемых журналах и в виде тезисов докладов на
международных конференциях.
По материалам диссертации были сделаны доклады на следующих конференциях:
1. 8th international symposium “Molecular order and mobility in polymer systems”, Санкт-
Петербург, 2014
-
IX International conference of young scientists on chemistry „Mendeleev-2015”, Санкт-Петербург, 2015
-
11-th International Conference on Diffusion in Solids and Liquids-DSL 2015, Мюнхен, Германия, 2015
-
3rd European Joint Theoretical/Experimental Meeting on Membranes, Стокгольм, Швеция, 2015
-
11th International Saint-Petersburg Conference of Young Scientists “Modern problems of polymer science”, Санкт-Петербург, 2015
6. International Student Conference “Science and Progress”, Санкт-Петербург, 2015
(отмечено дипломом за лучший устный доклад)
Структура работы
Векторы доставки на основе липосом
Катионные липиды являются амфифильными соединениями, которые хорошо растворяются в водной среде и образуют положительно заряженные мицеллярные структуры (липосомы). Все катионные липиды имеют общую структуру, состоящую из катионной (гидрофильной) головной группы и гидрофобного хвоста, которые соединены линкером. Положительно заряженная голова служит для связывания с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот. Комплексы, образованные самосборкой ДНК с липосомами принято называть липоплексами. Существует ряд экспериментальных работ, которые показывают, что липиды могут влиять на свойства нуклеиновых кислот, в частности, превращая ДНК из обычной В-формы в А и С-формы. [31, 32]. Тем не менее, впервые в 1987 было показано, что использование комплекса ДНК с липосомами [33] улучшает трансфекцию (перенос ДНК в клетку с последующей экспрессией), что привлекло повышенное внимание ученых к изучению липоплексов. Эффективность трансфекции при помощи липо-плексов значительно зависит от структуры катионного липида (длины липида, геометрического соотношения гидрофобного конца и гидрофильной головной группы), свойств дополнительных нейтральных (цвиттерионных) липидов-помощников и их соотношения с катионными липидами [34].
Наиболее известные липиды-помощники, холестерол и диолеилфосфатидилэтаноламин (ДОФЭ), добавляют к катионным ли-посомам для улучшения трансфекции и уменьшения токсичности липоплекса. В зависимости от формы входящего в состав липоплекса липидов разделяют слоистую (ламинарную) и гексагональную структуру липоплекса. В отличие от большинства липидов, которые имеют цилиндрическую форму и, следовательно, образуют слоистые структуры, липид-помощник ДОФЭ имеет конусообразную форму. Было показано, что увеличение количества ДОФЭ в липоплексах приводит к гексагональной структуре липоплексов, а доставка ДНК в клетку увеличивается за счет слияния ли-пидов с клеточной мембраной, что приводит к освобождению ДНК в цитоплазму [35, 36]. Также известно, что эффективность трансфекции ламинарных комплексов зависит от плотности заряда мембраны, в то же время для гексагональных комплексов такая зависимость не наблюдается. [34]. К настоящему времени считается, что трансфекция на основе липосом осуществляется преимущественно за счет эндоцито-за [37]. В данном процессе на первом этапе происходит клеточное поглощение липо-плексов, которые затем дестабилизируют эндосомальную мембрану, приводя к диффузной реорганизации фосфолипидов. Эти фосфолипиды затем дифундируют в ли-поплекс и взаимодействуют с катионными липидами, вызывая освобождение ДНК в цитоплазму. Исследования показали [37], что катионные липиды способны встраиваться в клеточную мембрану, модифицировать функциональность мембранных белков и клетки. В связи с этим, несмотря на то, что генные векторы на основе катион-ных липидов являются эффективными невирусными средствами доставки, они также являются токсичными, что подталкивает исследователей к поиску новых средств доставки ДНК в клетки. Нейтральные липиды являются составной частью клеточных мембран и, соответственно, нетоксичны. Таким образом, одним из возможных безопасных и эффективных средств доставки ДНК в клетку могут быть векторы на основе нейтральных (цвиттерионных) липидов (вместо токсичных катионных липо-сом). Экспериментально было показано, что нейтральные (цвиттерионные) липиды в присутствии ионов металлов могут вести себя эффективно как катионные, образуя комплекс с ДНК [12, 38 - 44]. Одна из первых работ по изучению эффективности ли-поплекса на основе цвиттерионного ДОФХ была проведена в 2006, результаты которой показали хоть и низкую, но положительную тенденцию в трансфекции ДНК в клетку, без использования токсичных компонентов [45]. В последующих работах было показано, что смешивание различных цвиттерионных липидов может привести к увеличению трансфекции. Так, например, было показано, что эффективность комплекса 6ПОФЭ-ДОФХ-ДНК-Ca при соотношении липидов 15:1,соответственно, выше в 2,7 раза эффективности вектора на основе катионного липида ДОФХ-ДОТАП, что подтверждает важность исследований липосом на основе цвиттерионных липи-дов в качестве альтернативы токсичных катионных липидов [47].
Компьютерное моделирование ДНК и липидного бислоя
Методика, применённая в данной работе, включала в себя последовательную минимизацию энергии, нагревание и уравновешивание отдельных компонентов системы (ДНК и молекул воды) независимо друг от друга. Процесс уравновешивания состоял из следующих шагов: 1) 20 пс моделирование при T = 100 K; 2) минимизация энергии воды; 3) минимизация энергии всей системы; 4) моделирование всей системы в течение 20 пс с наложением ограничений на положения атомов ДНК (алгоритм position restraints) с силовой константой k = 41840 кДж мол-1 нм-2 при T = 100 К; 5) то же, что и шаг 4, но время моделирования 50 пс, T = 303 К; 6) то же, что и шаг 5, при k = 20920 кДж мол-1 нм-2; 7) то же, что и шаг 5, но k = 10460 кДж мол-1 нм-2; 8) то же, что и шаг 6, но k = 2092 кДж мол-1 нм-2; 9). то же, что и шаг 6, но k = 84 кДж мол-1 нм-2. Затем система была промоделирована в течение 50 пс без использования ограничений в изотермо-изобарическом (NPT) ансамбле. Конечная конфигурация была использована в качестве стартовой для моделирования в течение микросекунды (production run).
Одной из главных характеристик проверки надежности силового поля является среднеквадратичное отклонение (СКО) от начальной структуры (Рис. 2). Для додека-мера в водном растворе было получено среднее значение СКО = 0,26 ± 0,05 нм для траектории в 1000 нс, что хорошо согласуется с ранее полученными результатами [16].
Что касается липидной мембраны, в работе использовался липидный бислой, состоящий из 128/288 молекул фосфатидилхолина (ПОФХ), являющегося одним из основных компонентов биомембраны. Как было уже указано выше, молекула ПОФХ состоит из 2 гидрофобных хвостов и гидрофильной головной группы (Рис. 1,б). Для проверки имплементации силового поля Amber Lipid14 в программный пакет Gromacs 4.5.6 липидный бислой был уравновешен в течение 200 нс, и в результате был измерен главный показатель правильной работы поля — площадь, приходящаяся на один липид. Значение площади было равно 0.65 ± 0.01 нм2, что хорошо согласуется с ранее полученными результатами [17].
Таким образом, имплементация и валидация силовых полей в Amber99 оказалась успешной и их можно применять для описания межмолекулярных взаимодействий системы ДНК-липидный бислой.
Для расчета профиля свободной энергии (ПСЭ) в работе использовался метод зонтичной выборки, основанный на приложении гармонического потенциала между центрами масс ДНК и бислоя вдоль координаты Z. Для этого додекамер ДНК был помещен параллельно поверхности бислоя (перпендикулярно оси Z). Начальное расстояние между центрами масс липидного бислоя и ДНК было равно 4,8 нм. На центр масс ДНК действовала сила, направленная к центру масс липидного бислоя вдоль координаты Z (силовая константа k = 1000 кДжмоль-1нм-2). В результате такого моделирования было получено 35 конфигураций системы на расстоянии 0.1 нм друг от друга (таким образом, расстояние между центрами масс варьировалось от 4,8 нм до 1,4 нм с шагом 0,1 нм вдоль оси Z). Каждая конфигурация служила начальной для независимых моделирований методом зонтичной выборки в течение 100 нс (силовая константа k = 3000 кДжмоль-1нм-2), первые 20 нс из которых рассматривались как уравновешивание системы и не использовались для анализа. Профиль свободной энергии вдоль оси Z был вычислен при помощи метода анализа взвешенных гистограмм (Weighted Histogram Analysis Method, WHAM), имплементированного в пакет Gromacs [117].
Что касается анализа полученных траекторий, одной из важных характеристик является расчет количества контактов (ненормированное координационное число). Количество контактов было сосчитано согласно методике, описанной в статье [48]. Сначала рассчитывалась радиальная функция распределения для пары атомов. Следующие пары были рассмотрены: Nфх (атомы азота холиновых групп ФХ) -Pднк (атомы фосфатов ДНК), Ca - Pфх (атомы фосфатов ФХ головных групп), Ca -Pднк, Na - Pфх, и Na - Pднк. Далее были определены положения первых минимумов радиальной функции распределения; эти минимумы обозначили радиус первой координационной сферы. Были получены следующие радиусы: 0.45 нм для пар Ca -Pфх и Ca - Pднк, 0.42 нм для пар Na - Pфх и Na - Pднк, и 0.6 нм для пары Nфх -Pднк. (Рис. 3). Количество контактов между атомами A и B рассчитывалось по количеству атомов B в первой координационной сфере атомов A. Считалось, что ионы адсорбировали на мембрану, когда они попадали в первую координационную сферу атома Pфх липида. Кроме того, считалось, что “Ca-мостик” (“Na-мостик”) между фосфатными группами ДНК и липидных молекул образуется, когда оба атома Pфх и Pднк находятся внутри координационной сферы одного и того же иона Ca2+ (Na+).
ДНК-липидный комплекс. Энергия связывания комплекса
Чтобы изучить механизм образования ДНК-липидного комплекса в присутствии ионов кальция, было проведено компьютерное моделирование, в котором ДНК располагалась в непосредственной близости от поверхности липидной мембраны. Были рассмотрены разные начальные условия. Сначала были исследованы системы, в которых ионы одновременно с ДНК были добавлены в раствор с липидным бислоем. В этом случае в начале компьютерного эксперимента липидная мембрана не имела положительного заряда, а отрицательно заряженная ДНК была окружена двухвалентными ионами кальция. Образование комплекса в данном случае является сложным процессом, требующим детального рассмотрения на атомистическом уровне. Дополнительно было проведено компьютерное моделирование, в котором ДНК была расположена вблизи липидного бислоя с пред -адсорбированными ионами кальция (раздел 4.4). Были рассмотрены кинетика, динамические и структурные изменения данных комплексов. Таким образом, следующие два раздела посвящены молекулярному механизму образования ДНК-липидного комплекса.
Для изучения адсорбции молекулы ДНК на нейтральный бислой в присутствии ионов кальция в растворе были рассмотрены следующие системы (Таблица 2). Таблица 2. Список исследуемых систем. № системы Система ДНК-мембрана Начальное расстояние (нм) Времямоделирования(нс) 1 ДНК-ПОФХ-Ca-0.18 0.18 150 2 ДНК-ПОФХ-Ca-0.5a 0.5 150 3 ДНК-ПОФХ-Ca-0.5б 0.5 150 4 ДНК-ПОФХ-Ca-0.5-NaClв 0.5 150 5 ДНК-ПОФХ-Ca-0.5 0.5 600 6 ДНК-ПОФХ-Ca-1.0 1.0 600 а Начальная конфигурация системы отличается от системы ДНК-ПОФХ-Ca-0.5 системы поворотом ДНК на 90 в плоскости мембраны. б Начальная конфигурация системы отличается от системы ДНК-ПОФХ-Ca-0.5 поворотом ДНК на 90 вокруг главной оси ДНК. в Начальная конфигурация системы отличается от системы ДНК-ПОФХ-Ca-0.5 присутствием 100 ммоль NaCl.
Типичная система “ДНК-липидная мембрана” состояла из фрагмента ДНК (двойной додекамер Дрю-Диккерсона из 24 пар оснований с общим зарядом -46е), 46 контрионов Na+ , липидного бислоя, состоящего из 288 молекул ПОФХ липидов и 25 000 молекул воды. К каждой системе было добавлено 45 Ca2+ ионов и 90 Cl 49 ионов, что соответствует концентрации соли 100 ммоль CaCl2 (концентрация была рассчитана относительно общего количества молекул воды). Общее количество атомов в системе было 115 000. Для оценки влияния соли NaCl дополнительно была рассмотрена система, в которой 45 Na+ и 45 Cl+ ионов были добавлены в систему (Таблица 2,система 4). Начальная структура двойного додекамера Дрю-Диккерсона была сгенерирована с помощью программы X3DNA.
Как видно из Таблицы 2 время моделирования большинства систем составляет 100-150 нс. Предварительно для каждого компонента системы (ДНК и липидный бислой) было проведено моделирование с целью начального уравновешивания и ва-лидации адаптированного силового поля. Моделирование двух систем (ДНК-ПОФХ-Ca-0.5 и ДНК-ПОФХ-Ca-1.0) было продлено до 600 нс. Траектории моделирования этих двух систем были использованы для анализа кинетики адсорбции и структуры ДНК-липидного комплекса. Большинство структурных характеристик были получены усреднением по последним 200 нс для данных систем (ДНК-ПОФХ-Ca-0.5 и ДНК-ПОФХ-Ca-1.0).
Начальное расстояние ДНК от поверхности бислоя варьировалось от 0.18 нм до 1 нм. На Рисунке 9 показано типичное изменение расстояния между центрами масс молекулы ДНК и фосфолипидной мембраной вдоль вектора нормали к поверхности мембраны как функция времени.
Связывание ДНК с бислоем с пред-адсорбированными ионами кальция
Дополнительно, было проведено моделирование системы “Сa2+-ДНК-мембрана” с 100 ммоль соли NaCl (система 4, Таблица 2), которое показало, что общая картина адсорбции остаётся такой же, как для систем без соли NaCl. В основном это обусловлено тем, что моновалентные ионы Na+ не способны конкурировать с ионами кальция за места связывания с липидными молекулами (Рис. 12). Таким образом, из всего вышесказанного следуют важные выводы. Компьютерное моделирование с использованием атомистических моделей позволило детально изучить кинетику адсорбции ДНК на цвиттерионную фосфатидилхолиновую мембрану в присутствии ионов кальция, а также структуру и стабильность образовавшегося комплекса. В конечном итоге исследования показывают, что ионы кальция играют двойную роль в ДНК-фосфолипидных системах. Во-первых, связывание двухвалентных катионов с поверхностью липидной мембраны делает её положительно заряженной, вызывая электростатическое притяжение полианионной ДНК. Во-вторых, результаты работы показывают, что ионы кальция играют ключевую роль для стабилизации ДНК-липидного комплекса, так как они соединяют фосфатные группы ДНК и липидных молекул. В отличие от существовавших на данный момент гипотез, результаты исследования показывают, что взаимодействия между холино-выми группами фосфолипидов и фосфатов ДНК играют незначительную роль, так как они нестабильны и характеризуются короткими временами жизни: времена жизни для таких взаимодействий на два порядка меньше времен жизни для кальциевых мостиков, соединяющих фосфатные группы ДНК и липидов.
Для изучения адсорбции ДНК на липидный бислой с заранее адсорбированными иона кальция, было также проведено моделирование без приложения внешней силы к ДНК. Компьютерное моделирование было проведено для больших систем по сравнению с системами для изучения ПСЭ. Каждая система состояла из двойного додекамера ДНК (24 пары оснований), 46 ионов Na+ (в качестве контрионов ДНК), молекул воды (количество варьировалось от 15 000 до 25 000) и липидного бислоя из 288 молекул ПОФХ с заранее адсорбированными ионами кальция (системы 5-8, Таблица 1). Для систем 5 и 6 с отношением липид/кальций = 13,1 были использованы конечные конфигурации липидного бислоя с ионами кальция системы 2, а для систем 7 и 8 (с отношением липид/кальций равным 6,4) конечные конфигурации системы 3. Молекула ДНК была расположена параллельно поверхности бислоя, начальное расстояние между ДНК и липидным бислоем было 0,5 или 1.0 нм (системы с буквами А и Б в названии, соответственно, Таблица 1). Время моделирования четырех ДНК-липидных систем с пред-адсорбированным кальцием на бислой варьировалось от 600 до 1200 нс, общее время моделирования всех систем составило 3,8 микросекунды. Во всех случаях обнаружена очень быстрая адсорбция молекулы ДНК на поверхность бислоя. На Рисунке 19 изображено расстояние между центрами масс ДНК и липидного бислоя вдоль нормали к поверхности бислоя как функция времени в течение первых 100 нс моделирования.
Расстояние между центрами масс ДНК и липидным бислоем вдоль направления, перпендикулярного поверхности бислоя как функция времени. Показаны результаты для систем 5-8,соответственно, Таблица 1. Из графика видно, что адсорбция ДНК происходит в первые 20 нс. Согласно профилю энергии, рассмотренному ранее (Рис. 8), это подтверждает сильное притяжение между ДНК и липидным бислоем с пред-асорбированными ионами кальция. Для описания кинетики адсорбции была рассчитана временная зависимость образования контактов между холиновыми группами липидов и фосфатными группами ДНК и кальциевые мостики, соединяющие фосфатные группы ДНК и липидов. Рисунок 20 показывает количество этих типов контактов в зависимости от времени для системы 6. При адсорбции ДНК на липидный бислой фосфатные группы ДНК сначала контактируют с холиновыми группами липидов, так как холиновые группы (Nфх) ближе расположены к водной фазе по сравнению с фосфатными группами. В связи с этим, в начале моделирования наблюдается резкое увеличение количества контактов Nфх-Pднк. В свою очередь, кальциевые мостики Pфх–Ca–Pднк могут образоваться только когда ДНК внедряется в бислой за счет электростатического притяжения, и ион кальция, связанный с фосфатной группой липида, находится вблизи фосфатной группы ДНК. Как видно из Рисунка 20, в первые 120 нс кальциевые мостики отсутствуют. Они начинают появляться на более поздних стадиях за счет латеральной диффузии ионов кальция по направлению к молекуле ДНК. Рисунок 20 (б) показывает постепенное увеличение числа ионов кальция, участвующих в мостиках Pфх–Ca–Pднк: c течением времени всё больше и больше ионов приближается к молекуле ДНК, адсорбированной на поверхности бислоя. В связи с этим многоступенчатое образование Pфх–Ca–Pднк контактов является достаточно медленным процессом, требующим 800-1000 нс.